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1、三三 谷氨酸消费菌及扩展培育谷氨酸消费菌及扩展培育教学内容容1 1，了解谷，了解谷氨酸消酸消费菌的主要特征、特点。菌的主要特征、特点。2 2，掌握菌，掌握菌种的的扩展培育方法。展培育方法。3 3，了解影，了解影响消消费菌生菌生长的主要要素。的主要要素。教学目的目的与要求要求学时：4作作业安排安排小小论文文前言：前言：一，谷一，谷氨酸菌酸菌种的的选育育进展：展：1 1，运用常用常规育育种技技术及及其所其所选育的谷育的谷氨酸高酸高产新菌新菌种 前言：前言：2 2，谷，谷氨酸消酸消费菌抗噬菌菌抗噬菌株的株的选育育前言：前言：3 3 ，采用，采用遗传工程新技工程新技术选育谷育谷氨酸酸优良菌良菌种 前言
2、：前言：二，谷二，谷氨酸消酸消费菌保管菌保管方法方法 1 1，几，几种斜面培斜面培 养基基 保管方保管方法法前言：前言：二，谷二，谷氨酸消酸消费菌保管菌保管方法方法 2 2磷酸磷酸盐缓冲冲液保管液保管方法的方法的改良改良前言：前言：二，谷二，谷氨酸消酸消费菌保管菌保管方法方法 3 3试管管熔封法熔封法保管谷保管谷氨酸菌酸菌种的的研讨 前言：前言：二，谷二，谷氨酸消酸消费菌保管菌保管方法方法 4 4液液氮超低超低 温保保 存谷存谷氨酸菌酸菌种 第一节第一节 谷氨酸消费菌的主要特征和菌学性质谷氨酸消费菌的主要特征和菌学性质一，现有谷氨酸消费菌的分类：一，现有谷氨酸消费菌的分类： 现有谷氨酸消费菌主
3、要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。这四个属在细菌的分类系统中彼此比较接近。短杆菌属隶属于短杆菌科(Brevibacteriaceace)，而棒状杆菌属、小杆菌属及节杆菌属那么都隶属于棒状杆菌科(corynebacteriaceae)。短杆菌科和棒状杆菌科均属于真细菌目中的革兰氏染色阳性、无芽抱杆菌及有芽抱杆菌的一大类。 二，现有谷氨酸消费菌的菌学性质： 三，现有谷氨酸消费菌的主要特征：三，现有谷氨酸消费菌的主要特征： 三，现有谷氨酸消费菌的主要特征：三，现有谷氨酸消费菌的主要特征： 三、现有谷氨酸消费菌的主要特征三、现有谷氨酸消费菌的主要特征总结总结 第二节第二节 谷氨酸消
4、费菌在发酵过谷氨酸消费菌在发酵过程中的形状变化程中的形状变化人们发现，谷氨酸消费菌在发酵过程中会发生明显人们发现，谷氨酸消费菌在发酵过程中会发生明显的菌体形状的变化。实际证明，在发酵过程中发现的菌体形状的变化。实际证明，在发酵过程中发现菌体形状有明显的变化时，正是产谷氨酸的激增时菌体形状有明显的变化时，正是产谷氨酸的激增时间。但在发酵培育基含有过剩生物素的培育条件下，间。但在发酵培育基含有过剩生物素的培育条件下，菌体形状那么没有明显变化，却呈现耗糖、长菌、菌体形状那么没有明显变化，却呈现耗糖、长菌、不产谷氨酸的异常发酵。不产谷氨酸的异常发酵。 一、种子的菌体形状一、种子的菌体形状 斜面和一、二
5、斜面和一、二级种子培育在不同培育条件下种子培育在不同培育条件下, ,细胞形状根本胞形状根本类似。斜面培育的菌体似。斜面培育的菌体较细小小, ,一、二一、二级种子比斜面菌体大而粗壮，革种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深。多氏染色深。多为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，无分，无分枝；枝；细胞胞陈列呈列呈单个、成个、成对及及“V“V字形，有字形，有栅状或状或不不规那么聚那么聚块；分裂的；分裂的细胞大小胞大小为0.70.70.9*1.00.9*1.03.4um3.4um。由于生物素充足，繁衍的菌体。由于生物素充足，繁衍的菌体细胞均胞均为谷谷氨酸非氨酸非积累型
6、累型细胞。胞。 二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形状二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形状 从谷氨酸发酵中菌体形状的变化来看,大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形状。三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形状形状 发酵前期感染噬菌体后，菌体酵前期感染噬菌体后，菌体细胞明胞明显减少减少, ,细胞不胞不规那么，那么，发圆、发胖，缺乏胖，缺乏“ “字形字形陈列，有明列，有明显的的细胞碎片，胞碎片，严重重时出出现拉拉丝、拉网、拉网，相互堆在一同，几乎找不到完好的菌体，相互堆在一同，几乎找不到完好的菌体细胞胞, ,类似蛛网或似蛛网或鱼翅状。翅状。 在在发酵中
7、、后期感染噬菌体后，菌体酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞胞形状不形状不规那么，那么，边缘不整不整齐，有的，有的边缘似乎有似乎有许多毛刺状的多毛刺状的东西，有西，有细胞碎片胞碎片 。第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种1，日常菌种任务 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种育种思绪 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种育种思绪育种思绪1.1.切断或减弱支路代谢切断或减弱支路代谢 2.2.解除本身的反响抑制解除本身的反响抑制 3.3.添加前体物的合成添加前体物的合成 4.4.提高细胞膜的浸透性提高细胞膜的浸透性 5.5.强化能量代谢强化能量代谢6.6.利用基
8、因工程技术构建谷氨酸工程菌株利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种2 2，选育耐高浸透压的菌株，选育耐高浸透压的菌株 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种3 3，选育不分解利用谷氨酸的突变株：即选育以谷氨酸为，选育不分解利用谷氨酸的突变株：即选育以谷氨酸为独一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。独一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种4，选育细胞膜浸透性好的突变株 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种5，选育强化CO2固定反响的突变株 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消
9、费菌的育种6，选育减弱乙醛酸循环的突变株 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种7，选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到a-酮戊二酸代谢的突变株 第三节 谷氨酸消费菌的育种8，选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反响调理的突变株 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种9，选育强化能量代谢的突变株 第三节第三节 谷氨酸消费菌的育种谷氨酸消费菌的育种10，选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株 第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸消利用生物工程新技术选育谷氨酸消费菌费菌 一、运用原生质体交融新技术选育谷氨酸消费菌一、运用原生质体交融新技术选育谷氨酸消费菌1)1)标志菌株的挑志菌株的挑
10、选；2)2)原生原生质体的制体的制备；3)3)原生原生质体的再生；体的再生；4)4)原生原生质体的交融；体的交融；5)5)交融子的交融子的选择；6)6)适用性菌株的挑适用性菌株的挑选。第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸消利用生物工程新技术选育谷氨酸消费菌费菌 二，运用转化法选育谷氨酸消费菌二，运用转化法选育谷氨酸消费菌 所谓转化，是指受体细胞直接吸收了来自供体所谓转化，是指受体细胞直接吸收了来自供体细胞的细胞的DNADNA片段，并将它整合到本人的基因组中，片段，并将它整合到本人的基因组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的景象。转化从而获得了供体细胞部分遗传性状的景象。转化作用需求受体菌
11、和转化作用需求受体菌和转化DNADNA。转化既是进展细菌。转化既是进展细菌遗传分析的有效工具，亦是微生物育种的有效方遗传分析的有效工具，亦是微生物育种的有效方法。法。 第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸消利用生物工程新技术选育谷氨酸消费菌费菌 三，运用转导法选育谷氨酸消费菌三，运用转导法选育谷氨酸消费菌 所谓转导，是指经过温暖型噬菌体为媒介，将供体细脑中的所谓转导，是指经过温暖型噬菌体为媒介，将供体细脑中的DNADNA片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞获得了供体细胞片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞获得了供体细胞部分遗传性状的景象。转导作用需求三个组成部分，即供体菌，部分遗传性状的
12、景象。转导作用需求三个组成部分，即供体菌，转导噬菌体，受体菌。由于绝大多数细菌转导噬菌体，受体菌。由于绝大多数细菌( (包括谷氨酸消费菌在包括谷氨酸消费菌在内内) )都有噬菌体，所以转导远较转化作用普遍。又由于转导都有噬菌体，所以转导远较转化作用普遍。又由于转导DNADNA位于噬菌体蛋白质外壳内，所以不会像转化位于噬菌体蛋白质外壳内，所以不会像转化DNADNA那样容易被外那样容易被外界的界的DNADNA分解酶所破坏，因此比较稳定。转导同转化一样，也分解酶所破坏，因此比较稳定。转导同转化一样，也是微生物育种的有效方法。是微生物育种的有效方法。 第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸消利用生物
13、工程新技术选育谷氨酸消费菌费菌 四、运用重组四、运用重组DNADNA技术选育谷氨酸消费菌技术选育谷氨酸消费菌 重重组DNADNA技技术也称也称为基因工程，它是在分子基因工程，它是在分子遗传学学实际的根的根底上开展起来的。它底上开展起来的。它综合了生物化学和微生物学的合了生物化学和微生物学的现代技代技术和和手段在离体条件下将某种生物的基因与作手段在离体条件下将某种生物的基因与作为载体的体的DNADNA分子分子衔接起来，然后接起来，然后转化到某一寄主化到某一寄主细胞中，使之胞中，使之进展复制并得以表展复制并得以表达，从而使寄主菌达，从而使寄主菌获得新的得新的遗传性状。利用重性状。利用重组DNADN
14、A技技术，可，可以使以使编码限速限速酶的基因的基因扩增以排除生物合成途径中的增以排除生物合成途径中的“ “瓶瓶颈，从而使谷氨酸从而使谷氨酸产量添加。因比重量添加。因比重组DNADNA技技术是提高谷氨酸是提高谷氨酸产量量的一种新的有效手段。的一种新的有效手段。 第四节第四节 利用生物工程新技术选育谷氨酸消利用生物工程新技术选育谷氨酸消费菌费菌 五、运用固定化细胞技术发酵消费谷氨酸五、运用固定化细胞技术发酵消费谷氨酸 固定化细胞是固定化细胞是6060年代后期开展起来的一项新技术，年代后期开展起来的一项新技术，是经过物理的或化学的方法将细胞束缚在一定区间内是经过物理的或化学的方法将细胞束缚在一定区间
15、内使之仍具有催化活性的固定化生物催化剂。由于它既使之仍具有催化活性的固定化生物催化剂。由于它既能坚持酶或微生物细胞的催化功能，又能使细胞很方能坚持酶或微生物细胞的催化功能，又能使细胞很方便地与反响液分别，并能进展反复运用，所以对原资便地与反响液分别，并能进展反复运用，所以对原资料的合理利用，缩短不用要的操作时间，防止环境污料的合理利用，缩短不用要的操作时间，防止环境污染及进展现代化的工业消费部具有重要的现实意义。染及进展现代化的工业消费部具有重要的现实意义。 举例：例：经过基因工程构建谷氨酸消基因工程构建谷氨酸消费菌菌B44B44在谷氨酸消费中，依其代谢途径，把不用要的代谢途径 (经诱变阻断了
16、a一酮戊二酸到琥珀酰CoA和乙醛酸两条代谢途径) 切断后，同时诱变出细胞渗漏型甘油缺陷 B 4 ，以便让谷氨酸有效外漏，解除因代谢途径改动后细胞内代谢产物谷氨酸过度积累而产生的反响抑制，谷氨酸产量有一定提高( 经诱变挑选得到的营养缺陷型突变株 B 4比其出发菌株 B l提高产酸率 18.6 和对糖的转化率提高 12.3 ) 。举例：例：经过基因工程构建谷氨酸基因工程构建谷氨酸消消费菌菌B44B44举例：例：经过基因工程构建谷氨酸基因工程构建谷氨酸消消费菌菌B44B441.1 ，菌株和质粒 举例：例：经过基因工程构建谷氨酸基因工程构建谷氨酸消消费菌菌B44B441.2 培育基和培育条件举例：例：
17、经过基因工程构建谷氨酸基因工程构建谷氨酸消消费菌菌B44B441.2 培育基和培育条件举例：例：经过基因工程构建谷氨酸基因工程构建谷氨酸消消费菌菌B44B441.3 DNA的提取与纯化1.4 PCR克隆pfkA基因1.5 重组质粒Ku一1的构建及重组菌的挑选和鉴定1.6 重组质粒的稳定性 1.7 磷酸果糖激酶活性测定 1.8 糖转化率和谷氨酸生成比较 举例：例：经过基因工程构建谷氨酸基因工程构建谷氨酸消消费菌菌B44B44结果：果： 经基因工程改造后的基因工程改造后的 B 4 4 B 4 4对糖的糖的转化化率有所提高，谷率有所提高，谷氨酸酸产量有量有较大的提高，大的提高， 这主要是增大磷酸果糖
18、激酶主要是增大磷酸果糖激酶剂量，解除了量，解除了EMPEMP途途径中的磷酸果糖激酶的限制，中的磷酸果糖激酶的限制， 以致以致解除了磷酸果糖激酶解除了磷酸果糖激酶对曾曾经改造的谷改造的谷氨酸酸整整个代代谢途途径的限制，故物流代的限制，故物流代谢加强。加强。以致以致B44B44对糖的糖的转化率有所提高，谷化率有所提高，谷氨酸酸产量有量有较大的提高。大的提高。 第五节第五节 菌种的扩展培育和种子的质量要求菌种的扩展培育和种子的质量要求 国内谷氨酸发酵种子扩展培育普遍采用二级种子培育的流程，即；斜面菌种-一级种子培育-二级种子培育-发酵罐。 第五节 菌种的扩展培育和种子的质量要求 一，菌种的扩展培育1
19、斜面菌种的培育第五节第五节 菌种的扩展培育和种子的质量要求菌种的扩展培育和种子的质量要求 一，菌种的扩展培育2一级种子培育 第五节第五节 菌种的扩展培育和种子的质量要求菌种的扩展培育和种子的质量要求 一，菌种的扩展培育2一级种子培育 第五节第五节 菌种的扩展培育和种子的质量要求菌种的扩展培育和种子的质量要求 一，菌种的扩展培育3二级种子培育 (1) 培育基组成第五节第五节 菌种的扩展培育和种子的质量要求菌种的扩展培育和种子的质量要求 一，菌种的扩展培育3二级种子培育第五节第五节 菌种的扩展培育和种子的质量要求菌种的扩展培育和种子的质量要求 一，菌种的扩展培育3二级种子培育第五节第五节 菌种的扩
20、展培育和种子的质量要求菌种的扩展培育和种子的质量要求 二，影响种子质量的要素1培育基构成：种子培育基要求合有丰富的氮源，足够的生物素，少量的碳源，以利于菌体生长。假设糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使PH降低菌种容易衰老。2温度；幼龄菌对温度变化敏感，应防止温度过高和动摇大。3PH值：零小时时PH不宜过高，培育终了PH不宜过低，PH上升后有所下降时，培育时间已接近终了。4溶解氧：长菌阶段对氧要求比发酵时低，溶氧程度过高，抑制长菌。5接种量：种量过少，菌体增长缓慢，顺应期长，培育时间长，影响种子活力。但种量过大，在拼瓶操作中易引起污染。普通种且以1左右为宜。6培育时间：培育时间不宜太长，
21、以78h为好，掌握对数生长期作为种子接入发酵罐。 总 结谷氨酸消费的种子制备谷氨酸消费的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一一级种子培育种子培育二二级种子培育种子培育发酵酵1斜面斜面 (AS1.299)培育基：蛋白胨培育基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%， pH 7.0-7.2培育基特点：有利于菌体的生培育基特点：有利于菌体的生长，原料比，原料比较精精细培育条件：培育条件：32，生，生长18-24小小时生生长斜面要求：生斜面要求：生长良好，所运用斜面延良好，所运用斜面延续传代不超越代不超越 3次次2 一级种子摇瓶一级种子摇瓶培育条件：于培育条件：
22、于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小小时。培育基：葡萄糖培育基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%培育基特点：有利于菌体的生培育基特点：有利于菌体的生长，所运用的原料曾，所运用的原料曾经基基 本接近于本接近于发酵培育基酵培育基3二级种子二级种子(种子罐种子罐)培育条件：在种子罐中培育容培育条件：在种子罐中培育容积为发酵罐的酵罐的1%， 32培育培育7-10个小个小时培育基：和一级种子类似，其中葡萄糖用水解糖替代，培育基：和一级种子类似，其中葡萄糖用水解糖替代， 浓度为浓度为2.5%培育基的特点：培育基的特点：长菌体，更接近于菌体，更接近于发酵培育基酵培育基4种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈大小均匀，呈单单个或八字个或八字陈陈列列PH 7.0-7.2时终时终了，了，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛
