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1、进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩
2、子们却在周下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味
3、道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人
4、生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅长的时间隧道，袅实验一碱变性法抽提质粒DNA共共100分分实验设计实验设计60%考勤考勤+实验报告实验报告40%实验设计（实验设计（30004000字）：字）：选题：结合自己的专业，利用基因工程技术选题：结合自己的专业，利用基因工程技术内容：内容：1）立题依据；）立题依据；2）原理；）原理；3）实验材料；）实验材料；4）实）实验方法；验方法；5）预期结果；）预期结果；6）参考文献（）参考文献（3篇）篇）评分标准：评分标准：1）项目完整）项目完整35分；分；2）
5、创新性）创新性15分；分； 3）可行性）可行性5分；分；4）合理性）合理性5分。分。质粒在细胞内的复制一般有两种类型质粒在细胞内的复制一般有两种类型: : 严紧控制型严紧控制型( (Strengent control)Strengent control)：复制受宿复制受宿主细胞的严格调控，拷贝数低；主细胞的严格调控，拷贝数低； 松驰控制型松驰控制型(Relaxed control)(Relaxed control)：复制不受宿：复制不受宿主细胞的调控，拷贝数高主细胞的调控，拷贝数高, , 适用于基因工程中做适用于基因工程中做载体。载体。分离质粒分离质粒DNA的方法的方法1.碱变性法；碱变性法；
6、2.煮沸法；煮沸法；3.SDS法；法；4.羟基磷灰石层析法等羟基磷灰石层析法等一、实验目的一、实验目的 通过本实验掌握碱变性法提取质粒通过本实验掌握碱变性法提取质粒DNADNA。二、实验原理二、实验原理在在pH 12-12.5pH 12-12.5时，线性时，线性DNADNA被彻底变性，但共价闭环质粒被彻底变性，但共价闭环质粒DNADNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。合在一起。当在溶液体系中加入当在溶液体系中加入pH4.8pH4.8的的NaACNaAC时，溶液恢复中性，质时，溶液恢复中性，质粒粒DNADNA迅速复性，染色体迅
7、速复性，染色体DNADNA不能恢复，形成网状结构，不能恢复，形成网状结构，通过离心可以把变性的染色体通过离心可以把变性的染色体DNADNA和蛋白和蛋白-SDS-SDS复合物沉淀复合物沉淀分离出来分离出来。质粒DNA细菌染色体DNA分子量小分子量大超螺旋线性双螺旋三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂（一）（一） 仪器仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速离心机 5. 微量取液器（二） 材料 大肠杆菌JM109（pBR322-HBV）（三） 试剂1. LB培养基2. LA培养基（LB+Amp）HBV片段pBR322-HBV四、实验步骤四、实验步骤 甘油保存
8、的菌种甘油保存的菌种JM109-PBR322-HBV,JM109-PBR322-HBV,涂布于涂布于LALA琼脂平板琼脂平板 3737，培养过夜，培养过夜挑取单克隆于挑取单克隆于2ml LA2ml LA液体培养基中液体培养基中3737，220rpm220rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取1.4ml菌液入菌液入1.5ml的的EP管中管中 12000rpm12000rpm、离心、离心30s30s，弃上清，弃上清重复上述步骤一次重复上述步骤一次100ul100ul溶液溶液I I悬浮菌体（悬浮菌体（充分振荡充分振荡) )加入加入200uL200uL溶液溶液II,II,颠倒混匀颠倒混匀5次（次（轻柔轻柔
9、），冰浴），冰浴35min。 (出现拉丝现象出现拉丝现象) )加入加入150l150l溶液溶液IIIIII，温和混匀，温和混匀10s10s，冰上放置，冰上放置3 35min5min。( (云雾状云雾状 沉淀沉淀) )12000rpm12000rpm离心离心5min5min，取上清到一新，取上清到一新EpEp管管( (约约440l440l ) )上清加上清加等体积氯仿等体积氯仿/ /异戊醇（异戊醇（24/124/1），），颠倒混匀颠倒混匀2min2min，1200012000 rpmrpm离心离心5min5min。( (分离蛋白质及核酸，分离蛋白质及核酸，氯仿可使蛋白质变性，氯仿可使蛋白质变性，
10、异戊醇防止发泡异戊醇防止发泡) )取上取上清清(约约400l)至至新新EpEp管中。管中。加入加入2 2倍体积倍体积100%100%冰乙醇冰乙醇,混匀，室温放置混匀，室温放置5min5min。12000 rpm 12000 rpm 离心离心5min5min。 ( (沉淀质粒沉淀质粒DNADNA )弃上清弃上清，加入，加入7070乙醇乙醇1ml1ml，颠倒漂洗，颠倒漂洗（保持沉淀在管底）（保持沉淀在管底），12000 rpm12000 rpm离离心心3min3min。 ( (清除残余离子清除残余离子 )弃上清弃上清，将，将Eppendorf管于吸水纸上倒置管于吸水纸上倒置1min，室温放置，室温
11、放置5min加加40l TE（pH8.0，含无，含无DNA酶的酶的RNA酶酶20g/ml），溶解），溶解DNA ，短暂混，短暂混匀，室温放置匀，室温放置30min以消化以消化RNA。取取10l进行电泳，其余放置用于内切酶酶切实验，或进行电泳，其余放置用于内切酶酶切实验，或-20贮存。贮存。 注意事项注意事项碱变性的时间严格控制酸中和的时间可以适当延长离心取上清时，不要吸取中间的蛋白层漂洗沉淀时不要将沉淀冲掉溶液溶液 50mmol/L 葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0) (主主要要作作用用：Solution I 中中的的EDTA
12、可可以以螯螯合合二二价价金金属属离离子子进进而而抑抑制制依依赖赖于于二二价价金金属属离离子子的的DNA酶的活性，对酶的活性，对DNA起到保护作用。加入起到保护作用。加入solution后一定要充分打散菌体。后一定要充分打散菌体。)溶液溶液 (pH 12.6) 0.2mol/L NaOH ;1%SDS (现用现配) (主主要要作作用用：细细胞胞壁壁肽肽聚聚糖糖碱碱性性下下水水解解，核核酸酸和和蛋蛋白白质质变变性性. Solution II要要新新鲜鲜配配置置,NaOH可可吸吸收收空空气气中中的的二二氧氧化化碳碳而而减减弱弱碱碱性性。加加入入solution II后放置时间不要超过后放置时间不要超
13、过5min，以免变性质粒不易复性，以免变性质粒不易复性)溶液溶液 (pH 4.8) 100ml5mol/L NaAc 60ml; 冰醋酸 11.5ml; 双蒸水 28.5ml (作用：中和碱液，质粒作用：中和碱液，质粒DNA复性，变性蛋白复性，变性蛋白SDS, 线性线性DNA沉淀沉淀)氯仿氯仿/ /异戊醇（异戊醇（2424：1 1）：氯仿可使蛋白质变性，异戊醇氯仿可使蛋白质变性，异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫有助于消除抽提过程中出现的泡沫; ;无水乙醇无水乙醇：除去：除去DNADNA水化层，使水化层，使DNADNA沉淀沉淀TE（pH8.0）:10mmol/LTris-Cl(pH8.0);1mmol/LEDTA(pH8.0)(溶解溶解DNA)DNA)离心离心&沉淀沉淀漩漩涡涡混混合合器器云雾状沉淀云雾状沉淀结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！23
