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1、 5组：李东 老师：陈思目录原理类型命名法实验注意事项连接常见问题及对策DNADNA的限制性酶切实验原理的限制性酶切实验原理n核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于用于抗击外来的侵袭。抗击外来的侵袭。n限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，键， 产生的片段产生的片段端为，端为，端为。端为。n根据限制酶的识别切割特性，根据限制酶的识别
2、切割特性， 催化条件及是催化条件及是否具有修饰酶活性可分为否具有修饰酶活性可分为、型三大型三大类。类。限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型n第一类（第一类（I型）限制性内切酶：型）限制性内切酶：能识别专一能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。结构或克隆基
3、因。这类酶如这类酶如EcoB、EcoK等。等。 第二类（第二类（IIIIII型）限制性内切酶：型）限制性内切酶：也有专一也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度产生的一定长度DNADNA片段，具有各种单链末端。片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。因此也不能应用于基因克隆。限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型n第三类（第三类（型）限制性内切酶：型）限制性内切酶：就
4、是通常指的限制性就是通常指的限制性内切酶内切酶. .n 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；切割，产生特异的片段； n型酶分子量较小，仅需型酶分子量较小，仅需Mg2+Mg2+作为催化反应的辅助因子，识作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； n型内切酶切割双链产生种不同的切口型内切酶切割双链产生种不同的切口端端突出；突出；端突出和平末端。端突出和平末端。n 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能才使得人们能在体外
5、有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。动了分子生物学的兴旺和发展。 限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型粘性末端粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。粘性末端。如如EcoEcoRIRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 5 G|AATTC G|AATTC 3 3 3 3 CTTAA|G CTTAA|G 5 5在双链上交错切割的位置切割后生成在双链上交错切割的位置切割后生成
6、5 5G AATTCG AATTC3 3 3 3CTTAA GCTTAA G5 5各各有有一一个个单单链链末末端端，二二条条单单链链是是互互补补的的，其其断断裂裂的的磷磷酸二酯键以及氢键可通过酸二酯键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如双链，产生平头末端。例如EcoEcoRV RV 的识别位置是：的识别位置是： 5 5 GAT|ATC GAT|ATC 3 33 3 CTA|TAG CTA|TAG 5 5 切割后形成切割后形成5 5 GAT ATC GAT
7、ATC 3 33 3 CTA TAG CTA TAG 5 5 这种末端同样可以通过这种末端同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：v用用属属名名的的头头一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称，如如E. E. colicoli 用用EcoEco表示，所以用斜体字。表示，所以用斜体字。v用用一一个个字字母母代代表表菌菌株株或或型型，如如流流感感嗜嗜血血菌菌( (Heamophilus Heamophilus influenzaeinfluenzae)Rd)Rd菌菌株株用用d d，即即HinHind d。v如如
8、果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株，具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰酶酶，则则以以罗罗马马数数字字表表示示，如如HinHind, d, HinHindd，HinHindd等。等。 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法实验材料及仪器 高速离心机，电炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪头，Ep管，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，质粒DNA 双酶切双酶切无菌水无菌水0.8L10x缓冲液2L质粒16LBgl I0.6LSal II0.6L共20L 按如下体系加入到0.5ml离心管中加体系离心37 水浴1h跑
9、电泳结果结果与分析结果与分析 质粒的双酶切没有出现结果但质粒的双酶切没有出现结果但marker出了出了条带说明胶没有问题，而条带说明胶没有问题，而PCR的酶切产物的酶切产物出现了较好的实验结果。出现了较好的实验结果。内切酶：内切酶：n不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；n 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；n内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定。内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定。n同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘
10、油超过会抑制内切酶活力；甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；n 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。对内切酶的污染。五、注意事项五、注意事项五、注意事项五、注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切连接反应DNA 分子的体外连接（重组）是指外源分子的体外连接（重组）是指外源 DNA 片段和载体片段和载体 DNA 分子在体外通过分子在体外通过 DNA 连接酶共价连接。连接酶共价连接。 DNA酶切片段的联接是两酶切片段的联接是两DNA片段相邻的片段相邻的 5磷酸和磷酸和3羟基间可由联接酶
11、催化形成磷酸羟基间可由联接酶催化形成磷酸二酯键，即能完成联接反应。二酯键，即能完成联接反应。连接体系10 Buffer2.5L载体1LDNA10LT4酶1L无菌水10.5L共25L1.1.内切酶失活内切酶失活2.2.DNADNA不纯，含有不纯，含有SDSSDS，酚，酚，EDTAEDTA等内切酶抑制因子等内切酶抑制因子3.3.条件不适（试剂、温度）条件不适（试剂、温度）4.4.DNADNA酶切位点上的碱基被甲酶切位点上的碱基被甲基化基化5.5.DNADNA酶切位点上没有甲基化酶切位点上没有甲基化（如（如Dpn IDpn I）6.6.DNADNA位点上存在其它修饰位点上存在其它修饰7.7.DNAD
12、NA不存在该酶识别顺序不存在该酶识别顺序1.1.标准底物检测酶活性标准底物检测酶活性2.2.将将DNADNA过柱纯化，乙醇沉淀过柱纯化，乙醇沉淀DNADNA3.3.检查反应系统是否最佳检查反应系统是否最佳4.4.换用对换用对DNADNA甲基化不敏感的同裂酶甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒酶解，重新将质粒DNADNA转化至转化至dcm-dcm-，dam-dam-基因型的细菌菌株基因型的细菌菌株5.5.换用不同切割非甲基化位点的同裂换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化酶消化DNADNA（如（如San3A ISan3A I代替代替Dpn I)Dpn I)，重新将质粒转至，重新将质粒转至dcm+
13、dam+dcm+ dam+菌株菌株中扩增中扩增6.6.将将DNADNA底物与底物与DANDAN混匀进行切割验混匀进行切割验证证7.7.换用其它的酶切割换用其它的酶切割DNADNA或过量酶消或过量酶消化进行验证化进行验证六、六、六、六、限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析q问题一：问题一：DNADNA完全没有被内切酶切割完全没有被内切酶切割原原 因因对对策策1.1.内切酶活性下降内切酶活性下降2.2.内切酶稀释不正确内切酶稀释不正确3.3.DNADNA不纯，反应条件不佳不纯，反应条件不佳4.4.内切酶识别的内切酶识别的D
14、NADNA位点上的碱位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰基被甲基化或存在其它修饰5.5.部分部分DNADNA溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上6.6.内切酶溶液粘度大，取样不准内切酶溶液粘度大，取样不准7.7.酶切后酶切后DNADNA粘末端退火粘末端退火8.8.由于反应溶液、温度、强烈振由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性荡使内切酶变性9.9.过度稀释使酶活性降低过度稀释使酶活性降低10.10.反应条件不适反应条件不适11.11.识别位点两侧插入了可影响酶识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序切效率的核酸顺序1.1.用用5-105-10倍量过量消化倍量过量消化2.2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释
15、酶用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.3.同上同上4.4.同上同上5.5.反应前离心数秒反应前离心数秒6.6.将内切酶稀释，增大取样体积将内切酶稀释，增大取样体积7.7.电泳前将样品置电泳前将样品置6565保温保温5-105-10分分钟，取出后置冰浴骤冷钟，取出后置冰浴骤冷8.8.使用标准反应缓冲液及温度，避使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡免强烈振荡9.9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏不能贮藏10.10.使用最佳反应体系使用最佳反应体系11.11.加大酶量加大酶量5-105-10倍倍q问题二：问题二：DNADNA切割不完全切割不完全 原原因因对对策策六、六、六、六、限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析
