第十一章基因工程课件

《第十一章基因工程课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十一章基因工程课件（44页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、本章重点 基因工程的概念和一般操作流程。基因工程的概念和一般操作流程。 基因工程工具基因工程工具酶、载体、目的基因体、目的基因获得方得方法、重法、重组连接技接技术、导入技入技术、以及重、以及重组的的筛选等。等。 动物克隆技物克隆技术与与转基因技基因技术11.111.1基因工程概述基因工程概述 基因工程（基因工程（genetic engineering），），也叫也叫基因操作、基因操作、遗传工程，或重工程，或重组体体DNA技技术。它。它是一是一项将生物的某个基因通将生物的某个基因通过基因基因载体运送到体运送到另一种生物的活性另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖胞中，并使之无性繁殖（称之（称之为

2、“克隆克隆”）和行使正常功能（称之）和行使正常功能（称之为“表达表达”），从而），从而创造生物新品种或新物种的造生物新品种或新物种的遗传学技学技术。 基因工程概述基因工程概述基因工程的基本流程基因工程的基本流程目的基因目的基因获得得重重组DNA分子构建分子构建导入受体入受体细胞胞转化体化体细胞胞扩增、增、鉴定与定与筛选11.2 11.2 工具工具酶11.2.111.2.1限制性内切限制性内切酶 识别双双链DNA中特定序列并切割双中特定序列并切割双链DNA的的核酸内切核酸内切酶。 型和型和型限制型限制酶的切点不固定，不能的切点不固定，不能产生生可以利用的可以利用的DNA片段，只有片段，只有型限制

3、型限制酶具有可具有可以控制和以控制和预测的位点特异性切割的性的位点特异性切割的性质，并且，并且产生固定的生固定的DNA片段，因此基因工程中所用的片段，因此基因工程中所用的限制限制酶都是都是型限制型限制酶。 限制性内切酶1IIII限制性内切限制性内切酶基本特征基本特征特异性位点切割双特异性位点切割双链DNA识别序列序列为4-6个碱基，大多双重交替个碱基，大多双重交替对称称 切割切割产生平生平头末端末端(blunt end/flush end)和粘性末端和粘性末端(cohesive)限制性内切酶2 EcoR l识别6个核苷酸序列，在特定的个核苷酸序列，在特定的G-A之之间切割切割DNA分子：分子：

4、 限制性内切酶3 BamH识别6个核苷酸的序列，在特定的个核苷酸的序列，在特定的A-A之之间切割切割DNA分子分子 限制性内切酶4 有少数限制的有少数限制的酶在双在双链DNA的的对称称轴处切切割，割，产生平生平齐末端（平端），如末端（平端），如Bal和和Sma 限制性内切酶用途 产生特异的限制生特异的限制酶片段；片段； 建立建立DNA分子的限制分子的限制酶图谱； 构建基因文构建基因文库 用限制用限制酶切出的相同的粘性末端，以便重切出的相同的粘性末端，以便重组 11.2.2. DNA聚合酶 DNADNA聚合聚合酶种种类大大肠杆菌聚合杆菌聚合酶（全（全酶） 大大肠杆菌聚合杆菌聚合酶大片段（大片段（

5、Klenow片段）片段） T4噬菌体噬菌体DNA聚合聚合酶 T7噬菌体聚合噬菌体聚合酶及及经修修饰的的 T7噬菌体聚合噬菌体聚合酶（测序序酶） 末端末端转移移酶 逆逆转录酶 耐耐热 DNA聚合聚合酶（TaqDNA聚合聚合酶） DNA聚合酶种类DNA聚合酶用途大大肠杆菌杆菌DNADNA聚合聚合酶（全（全酶） 用切口平移方法用切口平移方法标记DNA（可作可作杂交探交探针） 利用其利用其5-3外切核酸外切核酸酶活性降解寡核着酸作活性降解寡核着酸作为合成合成cDNA第二第二链的引物的引物 用于用于对DNA分子的分子的3突出尾突出尾进行末端行末端标记，用于用于DNA序列分析序列分析 用途KlenowKl

6、enow片段片段 补平限制性内切平限制性内切酶切割切割DNA产生的生的3凹端；凹端； 用用32P补平平3凹端，凹端，对DNA片段片段进行末端行末端标记； 对带3突出端的突出端的DNA进行末端行末端标记； 在在cDNA克隆中，用于合成克隆中，用于合成cDNA第二第二链； 在体外在体外诱变中，用于从中，用于从单链模板合成双模板合成双链DNA； 应用双脱氧用双脱氧链末端末端终止法止法进行行DNA测序序 用途T4T4噬菌体噬菌体DNADNA聚合聚合酶 补平或平或标记限制性内切限制性内切酶消化消化DNA后后产生的生的3凹端凹端 对带有有3突出端的突出端的DNA分子分子进行末端行末端标记 标记用作探用作探

7、针的的DNA片段片段 将双将双链DNA的末端的末端转化成化成为平端平端 使使结合于合于单链DNA模板上的模板上的诱变寡核着酸引物寡核着酸引物得到延伸得到延伸 用途T7T7噬菌体噬菌体DNADNA聚合聚合酶及由此改造的及由此改造的测序序酶 用于拷用于拷贝长段模板的引物延伸反段模板的引物延伸反应 通通过补平或交平或交换（置（置换）反）反应进行快速末端行快速末端标记 耐耐热 DNADNA聚合聚合酶（Taq DNATaq DNA聚合聚合酶） 用于用于DNA测序序 用于聚合用于聚合酶链式反式反应（PCR）对DNA片段片段进行体外行体外扩增增 用途末端末端转移移酶 给载体或体或CDNA加上互加上互补的同聚

8、尾的同聚尾 用于用于DNA片段片段3末端的放射同位素末端的放射同位素标记 用途11.2.3 DNA连接酶 T4 DNAT4 DNA连接接酶 连接接带匹配粘端的匹配粘端的DNA分子分子 双双链DNA分子互相分子互相连接或合成的接接或合成的接头相相连接接 11.2.4 核酸酶 S1S1核酸核酸酶 去除去除DNA片段的片段的单链突出端，使之成突出端，使之成为平端平端 去除去除c cDNA合成合成时形成的形成的发夹结构构 施行施行Sl核酸核酸酶保保护试验（Sl protectionSl protection或或Sl Sl mappingmapping），），分析分析转录产物物 成熟成熟mRNA与基因与

9、基因组DNA杂交后，交后，结合合Sl核核酸酸酶水解，可确定内含子在基因水解，可确定内含子在基因组DNA中的定中的定位位 修整修整渐进性性删除突除突变的末端的末端 核酸酶Bal 31Bal 31核酸核酸酶 用于不同用于不同长度的度的删除突除突变克隆克隆实验及基因及基因结构、机能分析构、机能分析 绘制制DNA限性内切限性内切图谱 研究超螺旋研究超螺旋DNA的二的二级结构和致畸构和致畸剂引起的引起的双双链DNA螺旋螺旋结构构变化化 11.3 11.3 基因工程基因工程载体体 载体（体（vector）是把外源基因引入受体是把外源基因引入受体细胞并在其中能自我复制的小胞并在其中能自我复制的小DNA 分子

10、。分子。 基因工程中的基因工程中的载体体应具有如下一些特性具有如下一些特性： 独立和独立和稳定的定的 DNA自我复制自我复制 易于从宿主易于从宿主细胞中分离，并胞中分离，并进行行纯化化 具有适当的限制性内切具有适当的限制性内切酶位点位点 有有报告基因告基因 11.3.1 细菌质粒载体 质粒是粒是细菌染色体外的小型菌染色体外的小型环状双状双链的的DNA分子。分子。 质粒粒DNADNA的分子特性的分子特性 质粒粒DNA分子呈双分子呈双链共价封共价封闭环状、自然状、自然旋旋转成超螺旋构型（成超螺旋构型（closed circle DNA， ccDNA），），有有时会因会因单链断裂而成断裂而成为开开链

11、环状状DNA（open circle DNA， ocDNA）有有时双双链断断开成开成线性性DNA（liner DNA， lDNA） 11.3.2 噬菌体载体 细菌菌质粒粒载体所能携体所能携带的外源基因只限于的外源基因只限于10kb以下的以下的DNA片段，噬菌体作片段，噬菌体作为载体，可插体，可插入入长1010kbkb20kb20kb甚至更大的一些外源甚至更大的一些外源DNADNA片段。片段。 噬菌体噬菌体 噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿主菌大主菌大肠杆菌后，呈杆菌后，呈现溶菌性和溶源性两溶菌性和溶源性两类生生长方式。方式。 11.3.3 粘性质粒载体

12、粘性粘性质粒粒载体（也称柯斯体（也称柯斯质粒粒载体或粘粒，体或粘粒，cosmid vector）本本质上是含有抗性基因、上是含有抗性基因、单一克一克隆位点以及隆位点以及DNAcos位点（体外包装所必需）的位点（体外包装所必需）的细菌菌质粒。粒。 粘性粘性质粒粒优点是克隆容量点是克隆容量较大，可容大，可容纳35kb45kb外源外源DNA，转化率也化率也较高。常用的粘性高。常用的粘性粒有粒有PHC79。PJB8、MUA3和和KOSI等，它等，它们大多具有一种或多种限制性内。切大多具有一种或多种限制性内。切酶的的单一一酶切切位点。极其适合高等真核基因的克隆工作。位点。极其适合高等真核基因的克隆工作。

13、 11.3.4 YAC载体酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,）是人工构建的染色体：是人工构建的染色体：目前能插入片段最大的目前能插入片段最大的载体。体。11.3.5 病毒载体 细菌菌质粒和噬菌体具有粒和噬菌体具有严格的宿主格的宿主选择性，性，只能在相只能在相应的的细菌中生存和繁殖，从而限制了基菌中生存和繁殖，从而限制了基因工程的广泛性。因工程的广泛性。 动物病毒物病毒载体是一种比体是一种比较理想的真核基因理想的真核基因工程工程载体，在其序列中往往具有几个很体，在其序列中往往具有几个很强的启的启动子，它可使排列在其后方的核酸序列高子，它可使排

14、列在其后方的核酸序列高产量和高量和高频率地复制和表达。率地复制和表达。 SV40 病毒的基因病毒的基因组是共价封是共价封闭环状双状双链DNA，长52kb。基因基因组在功能上分在功能上分为早、晚期早、晚期转录两个两个区域。区域。 pCATpCATbasic plasmidbasic plasmid在在SV40SV40的的调节调节片段上片段上游插入一个游插入一个氯氯霉素乙霉素乙酸基酸基转转移移酶酶（chlorhenicol chlorhenicol acetylfransferaseacetylfransferase， CATCAT）11.411.4获取目的基因的方法取目的基因的方法 11.4.1

15、11.4.1鸟枪法法 在基因在基因组DNA文文库中中筛选出目的基因出目的基因 鸟枪克隆法在基因克隆法在基因组DNA文文库中中筛选到的到的目的基因，与染色体中的天然基因是一目的基因，与染色体中的天然基因是一样的，含的，含有内含子，在有内含子，在结构基因两端的构基因两端的连接区接区还有有转录调控序列片段，即控序列片段，即调节基因。基因。这样的基因可供基因的基因可供基因表达的表达的调控分析。因控分析。因为有内含子的存在，有内含子的存在，这样获得的得的结构基因不宜在原核宿主构基因不宜在原核宿主组织中表达。中表达。 11.4.211.4.2化学合成基因化学合成基因 将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一

16、将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段地片段一片段地缩合起来，成合起来，成为一个一个基因的核一个一个基因的核苷酸片段苷酸片段 。11.4.311.4.3聚合聚合酶链式反式反应 polymerase chain reaction polymerase chain reaction， PCR PCR优点很多，点很多，具有快速、灵敏、具有快速、灵敏、简便，特异等特点。便，特异等特点。 PCR对 DNA模板的模板的质量和数量要求比其他量和数量要求比其他实验方法低方法低得多得多 但但PCRPCR也有缺点：也有缺点：扩增增DNA的的长度一般不超度一般不超过 2kb， Taq DNA聚合聚合酶在合

17、成作用在合成作用时也会也会发生生错误，出，出错率率025，费用比用比较昂昂贵。 11.5 DNA11.5 DNA体外重体外重组与基因与基因转移移 11.5.111.5.1体外重体外重组 将目的基因与将目的基因与载体体连接在一起，即接在一起，即DNA的体外重的体外重组。 粘性末端粘性末端连接接 同一限制同一限制酶切位点切位点连接接 不同限制不同限制酶切位点切位点连接接这两种方法两种方法 酶切割切割产生生单链突出的粘性末端突出的粘性末端（cohensive terminal） 酶切位点附近的切位点附近的DNA序列不影响序列不影响连接接 两个两个DNA片段一起退火（片段一起退火（anneal）时，粘

18、性末端粘性末端单链间进行碱基配行碱基配对，然后在，然后在T4 DNA连接接酶催化作用下形成共价催化作用下形成共价结合的重合的重组DNA分子分子 体外重体外重组条件与条件与过程程连接接结果果平端连接 具有平末端的具有平末端的酶切切载体只能与平末端的目的体只能与平末端的目的基因基因连接。接。 T4 DNA连接接酶可催化相同和不同限可催化相同和不同限制性核酸内切制性核酸内切酶切割的平端之切割的平端之间的的连接接 有有时载体体DNA片段是平末端，而目的基因片段是平末端，而目的基因却是粘性末端，那就需要却是粘性末端，那就需要进行行处理，使理，使载体体DNA和目的基因的末端一致起来，通常是将目和目的基因的

19、末端一致起来，通常是将目的基因的粘性末端修的基因的粘性末端修饰成平末端，即添成平末端，即添补法和削法和削除法除法 。人工接头连接 同聚物加尾连接 同聚物加尾同聚物加尾连接是接是利用同聚物序列之利用同聚物序列之间的退火作用完成的的退火作用完成的连接接 11.5.2 11.5.2 基因基因转移移转化化( (transformation)transformation)，是将重是将重组质粒粒导入入受体受体细菌菌细胞胞转染染( (transfection)transfection)，是将携是将携带外源基因的外源基因的病毒感染受体病毒感染受体细胞胞 微注射技微注射技术( (microinjection)m

20、icroinjection) 电转化法化法( (electro-transformation)electro-transformation) 微微弹技技术( (micro neblast techniquemicro neblast technique也叫高速也叫高速粒子粒子轰击法法micro projectormicro projector或基因或基因枪技技术gene gene blaster technique)blaster technique) 脂脂质体介体介导法法( (liposome mediated gene liposome mediated gene trans-fer)tr

21、ans-fer)； 11.6 11.6 重重组体的体的鉴定定筛选 11.7 11.7 转基因技基因技术 转基因基因动物是指以物是指以实验方法方法导入外源基因，入外源基因，在染色体在染色体组内内稳定整合并能定整合并能遗传给后代的一后代的一类动物。物。 融合法，包括融合法，包括细胞融合，微胞融合，微细胞介胞介导融合等融合等 化学法，包括化学法，包括DNA-磷酸磷酸钙沉淀法、沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介葡聚糖法、染色体介导法等法等 物理法，包括物理法，包括显微注射法、微注射法、电脉冲法、脉冲法、细胞胞冻存法等存法等 病毒感染法，包括重病毒感染法，包括重组DNA病毒感染、重病毒感染、重组RNA

22、病毒感染等病毒感染等 11.8 11.8 克隆技克隆技术 生生产哺乳哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割物克隆的方法主要有胚胎分割和和细胞核移植两种，目前胞核移植两种，目前应用的主要是后者。用的主要是后者。 （1）培育）培育优良畜种和生良畜种和生产实验动物；物； （2）生）生产转基因基因动物物 （3）用于）用于细胞和胞和组织替代替代疗法；法； （4）复制）复制濒危的危的动物物种物物种 11.911.9基因基因诊断断 用分子生物学方法用分子生物学方法检测患者体内患者体内遗传物物质的的水平或水平或结构构变化而作出的或化而作出的或辅助助临床床诊断的技断的技术，称称为基因基因诊断断 核酸核酸杂交交 聚合聚合酶链反反应 限制性内切限制性内切酶酶谱分析分析 RFLP