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1、基本要求：了解紫外-可见吸光光度法的特点，光的基本性质，物质对光的选择性吸收，吸收曲线。掌握朗伯-比耳定律，以及运用朗伯-比耳定律定量分析的方法。掌握紫外-可见分光光度计的基本结构、工作原理，了解其主要部件的基本性质和工作原理。掌握测量条件的选择以及显色反应选择的方法。了解双光束分光光度法的原理和应用。了解双波长分光光度法的原理和应用。第一节第一节 概述概述 一、仪器分析方法分类（回顾）：电化学分析法光学分析法色谱分析法其它分析方法原子光谱法分子光谱法X射线光谱法核磁波谱紫外可见光光谱法荧光光谱法红外吸收光谱法拉曼光谱法n本章是仪器分析课程中光分析方法的第一章，光分析方法中的一些基本理论、基本
2、概念、基本专业术语，在本章中首次出现并应用。紫外可见吸收光谱法历史较久远，应用十分广泛，与其它各种仪器分析方法相比，紫外可见吸收光谱法所用的仪器简单、价廉，分析操作也比较简单，而且分析速率较快。在有机化合物的定性、定量分析方面，例如化合物的鉴定、结构分析和纯度检查以及在药物、天然产物化学中应用较多。光分析的基本过程：光分析的基本过程：n（1）能源提供能量；n（2）能量与被测物之间的相互作用；n（3）产生信号。n 基本特点：n（1）所有光分析法均包含三个基本过程；n（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；n（3）涉及大量光学元器件。电磁幅射的波长分布电磁幅射的波长分布n射线：514
3、0 pmn X射线：10310 nmn光学区：101000 mn远紫外区：10200 nmn近紫外区：200380 nmn可 见 区：380780 nmn近红外区：0.782.5mn中红外区：2.550mn远红外区：501000mn微波：0.1 mm1 mn无线电波：1 m 紫紫外外可可见见吸吸收收光光谱谱是是基基于于分分子子内内电电子跃迁，是分子光谱。子跃迁，是分子光谱。电磁辐射的基本性质电磁辐射的基本性质n电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）传播的能量；n c = =/n E = h = h c /n c ：光速=2.9981010cms；n：波长；：频率；：波数 ；E ：能量；
4、 n h ：普朗克常数6.62410-34Jsn电磁辐射具有波动性和微粒性；n分子光谱（带状光谱）：基于分子中电子能级、振-转能级跃迁；n 紫外光谱法（UV）；n 红外光谱法（IR）；n 分子荧光光谱法（MFS）； n 分子磷光光谱法（MPS）；n 核磁共振与顺磁共振波谱（N）；n不同物质具有不同的分子结构，对不同波长的光会产生选择性吸收，因而具有不同的吸收光谱。而各种化合物，无机化合物或有机化合物吸收光谱的产生在本质上是相同的，都是外层电子跃迁的结果，但二者在电子跃迁类型上有一定区别。有机化合物吸收可见光或紫外光，、和n电子就跃迁到高能态，可能产生的跃迁有*、n*、*和n*。各种跃迁所需要的
5、能量或吸收波长与有机化合物的基团、结构有密切关系，根据此原理进行有机化合物的定性和结构分析。无机络合物吸收带主要是由电荷转移跃迁和配位场跃迁而产生的。电荷转移跃迁的摩尔吸收系数很大，根据朗伯比尔定律，可以建立这些络合物的定量分析方法。二、应用：1定量分析：有色物质可见光区：340800nm对紫外线有吸收的无色物质紫外光区：200340nm灵敏度ppm，精密度RSD:0.5%二、应用：2定性分析：提供某些分子的部分结构信息例：苯的B带吸收（230270nm间出现7个精细结构的峰） 第二节第二节 吸收定律与光谱图吸收定律与光谱图一、朗伯一、朗伯比耳定律比耳定律吸光度(A)的定义I0It当一束平行光
6、平行光通过均匀均匀的溶液介质时，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。设入射光强度为I0，透射光强度为It。则吸光度(A)表示物质对光的吸收程度，其定义为:一、朗伯一、朗伯-比耳定律比耳定律朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。n当C采用重量单位时，吸收定律表达为:A=abc式中：a：吸光系数，L/g*cmb：光程，cmc：浓度，g/L可知：A与c呈线形关系，为定量分析的理论依据一、朗伯一、朗伯比耳定律比耳定律2.当C采用摩尔浓度时，吸收定律表达为:A=bc:摩尔吸光系数，L/molcmc:摩尔浓度，mol/L一、朗伯一、
7、朗伯比耳定律比耳定律透光率（T）I0 It定义为： 则： 应用：仪器的调整应用：仪器的调整 T（%）：0 100 （全吸收）（全吸收） （无吸收）（无吸收） A： 0二、紫外二、紫外-可见吸收光谱图可见吸收光谱图n定义：固定试样浓度和吸收池厚度，以吸收度（或透光率）对波长所作的曲线。例0.001molL-1高锰酸钾、重铬酸钾光谱图。扫描 - -胡罗卜素胡罗卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮几种有机化合物的几种有机化合物的吸收光谱图。吸收光谱图。浓度与吸收曲线紫外紫外-可见吸收光谱图的应用可见吸收光谱图的应用定量：一般总有一最大吸收峰，其对应波长称为最大吸收波长（max）,往往以max作为
8、定量分析时的单色光波长，可最大限度地提高灵敏度。简单定性，回答“是不是”的问题。第三节第三节 紫外紫外-可见光分光光度计可见光分光光度计 一、分类一、分类单光束分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计双光束分光光度计单波长分光光度计单波长分光光度计 双波长分光光度计双波长分光光度计可见光分光光度计可见光分光光度计 紫外紫外-可见光分光光度计可见光分光光度计二、基本光路图三、主要部件（以单光束分光光度计为例） 三、主要部件（以单光束分光光度计为例）1.光源：提供稳定的复合光可见光区：钨灯、碘钨灯。其辐射波长范围在3202500nm。紫外区：氢灯、氘灯。发射185400nm的连续光谱。三、主要部
9、件（以单光束分光光度计为例）2.单色器作用：从光源的复合光中分离出所需单色光。组成：由色散元件和狭缝组成。三、主要部件（以单光束分光光度计为例）2.单色器色散元件作用：将复合光分解成连续单色光。nA.棱镜（靠折射作用分光）可以得到波长非均匀分布的连续光谱，光强损失较大。400nm800nm三、主要部件（以单光束分光光度计为例） 棱镜棱镜（Prism）： 棱棱镜镜的的色色散散作作用用是是基基于于构构成成棱棱镜镜的的光光学学材材料料对对不不同同波波长长的的光光具具有有不不同同的的折折射射率率。波波长长大大的的折折射射率率小小，波长小的折射率大。波长小的折射率大。Cornu棱镜棱镜 b Littro
10、w棱镜棱镜三、主要部件（以单光束分光光度计为例）n棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800400500 600三、主要部件（以单光束分光光度计为例）n光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。提供波长均匀分布的连续光谱，可用于吸收光谱的自动扫描。n原理：n利用光通过光栅时n发生衍射和干涉现象n 而分光.。光栅衍射示意图光栅衍射示意图M M1 1光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅M M2 2三、主要部件（以单光束分光光度计为例） A
11、AB BC CD Dd d P P0 0距离距离相相对对强强度度P P1 112光栅光栅例：7530型紫外可见光分光光度计。步进马达带动光栅，得到匀速变化的单色光。光栅制作：机刻6002880条/mm复制光栅（照相，化学腐蚀）三、主要部件（以单光束分光光度计为例）2.单色器狭缝由锐边金属片组成nA.入射狭缝：位于光源与色散元件之间。作用：是限制杂散光进入色散元件。nB.出口狭缝：位于色散元件与吸收池之间。作用：把额定波长单色光分离出单色器。三、主要部件（以单光束分光光度计为例）2.单色器狭缝n狭缝宽度可调定性分析时，窄一点，单色光纯，但光强弱。定量分析时，宽一点，灵敏度高。例：7530型分光光
12、度计0.2nm，1.0nm，2.0nm三、主要部件（以单光束分光光度计为例）3.吸收池（也可称为比色皿、样品池）作用：盛放试液。材料A.普通光学玻璃：用于可见光区，因为它吸收紫外光。B.石英玻璃：用于紫外光区，亦可用于可见光区。三、主要部件（以单光束分光光度计为例）3.吸收池（也可称为比色皿、样品池）宽度：0.5cm，1cm，2cm使用注意事项固定使用同一比色皿，因为每个比色皿的壁厚、光程、吸光特性等不尽相同。三、主要部件（以单光束分光光度计为例）4.检测器一类光电转换元件。常用类型有：光电池光电管光电倍增管三、主要部件（以单光束分光光度计为例）4.检测器光电池SeFe(Cu)h 玻璃玻璃Ag
13、(Au)透明膜透明膜-收集极收集极塑塑料料-对对500600nm光灵敏，用于可见光区。光灵敏，用于可见光区。容易产生疲劳效应，便易。容易产生疲劳效应，便易。72G型光电比色计。型光电比色计。三、主要部件（以单光束分光光度计为例）4.检测器光电管90V DC直流放大直流放大阴极阴极R-+光束光束e阳极丝（阳极丝（Ni）抽真空抽真空灵敏度比光电池大例：721型可见光分光光度计三、主要部件（以单光束分光光度计为例）4.检测器光电倍增管1个光子产生个光子产生106107个电子个电子石英套石英套光束光束栅极，栅极，Grill阳极阳极屏蔽屏蔽对光特别敏感，灵敏度比光电管高200倍。对供电量要求高，需要达到
14、0.010.05%的稳定性。一种新型检测器：一种新型检测器：光电二极管阵列，光电二极管阵列，PDASiO2窗窗p 型硅型硅n 型硅基型硅基pnpnpnpnpnpn0.025mm2.5mm侧视侧视(cross section)顶视顶视(top view)光束光束512个个 1024个个三、主要部件（以单光束分光光度计为例）5.显示器将检测器产生的光电流用直观的形式显示出来。n例：72G型722型7530型电表指针显示数字形式显示屏幕形式显示第四节第四节 测试条件测试条件一、分析波长一、分析波长1.一般情况下，选max作分析波长，以便获得最高的灵敏度。2.对于高浓度样品，为保证足够的工作直线的线形
15、范围，可选用灵敏度较低的吸收峰波长。3.max受到其它波峰干扰时，可选用别的吸收峰波长。二、出口狭缝宽度二、出口狭缝宽度n最佳宽度的选择方法：在A不减小时的最大狭缝宽度。（因为，在一定宽度范围内，A不变；过大时，由于干扰谱带或非吸收光出现在光谱通带内，A减小。）三、合适的吸收度范围三、合适的吸收度范围n根据吸收定律，A=0.4343时，吸收度测试量误差最小。实际工作中，将试样吸收度控制在0.20.8之间。n控制方法：选择合适的比色皿宽度，稀释待测样等。第五节第五节 试样体系条件的选择试样体系条件的选择显色反应n在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分X 转变为有色化合物，然后再进行测定。使试样
16、中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反应叫显色反应。nmX（待测物）nR（显色剂）XmRn（有色化合物）显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。选择显色反应的一般标准1、灵敏度高 选择 较大(104105)的显色反应。2、选择性好 显色剂仅与被测组分显色而与其它共存组分不显色。避免共存组分干扰。3、有色物组成固定 如： Fe3+ + 磺基水杨酸 三磺基水杨酸铁(黄色) （组成固定） Fe3+ + SCN- FeSCN2+、 Fe(SCN)2+ （组成不固定）n4、有色物稳定性高 其它离子干扰才小。如三磺基水杨酸铁的Kf =1042 , F- 、H3PO4 对它无干扰
17、。n5、显色过程易于控制 而且有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。一、 酸碱度n影响显色剂的平衡浓度和颜色nHR H+ + R- nR- + Mn+ MRnn影响被测物质的存在状态npH升高，MM(OH)M(OH)n甚至n影响络合物的组成及颜色n在pH23 Fe(ssal)+紫红色n在pH47 Fe(ssal)22- 棕橙色 n在pH810 Fe(ssal)3 黄 色n在pH12 Fe(OH)3 沉 淀一、 酸碱度npH会影响显色剂的解离，被测离子的水解等，所以，要选择最佳酸度，并用缓冲液来控制。ApH选择最佳pH值方法：固定试液浓度，改变pH值测A，做A-pH图，找出对A影响最小的p
18、H值范围。二 、显色剂浓度n1、显色剂的用量n显色反应一般可表示为M+RMRn显色剂用量，适当过量。Aab(1)CRa(2)CR(3)CR二 、显色剂浓度n2、最佳浓度选择n作A-C显色剂图，找出对A影响最小的浓度范围。AC显色剂显色剂三 、显色时间n显色反应有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的显色反应需放置不同的时间，并在一定的时间范围内进行比色测定。n试液自加入显色剂等且定容后开始计时，测A，制作At曲线，(2)、(3)用秒表控时t-minab(1)(3)t-mint-mina(2)三 、显色时间n试液颜色常随时间而变化。1.找到对颜色变化影响最小的时间段。2.每个试液都要有相同的显
19、色时间。At四、温度n有些反应需要加热。有些显色剂或有色配合物在较高温度下易分解褪色。此外温度对光的吸收及颜色深浅也有影响，要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。n固定其它条件，改变T，作 A T 曲线，寻找适宜 反应温度。TATATATATA四、温度n温度能影响显色反应的速度，影响颜色的稳定性。据此可以找到最佳的温度。n有些显色反应受温度影响较大，这时候，要控制恒定的温度。n5、溶剂：有机溶剂可降低有色化合物的离解度。合适的表面活性剂可增溶、增敏、增稳。n6、共存干扰离子的影响及消除：包括：正干扰（共存离子本身有色or与显色剂反应，在测量条件下有吸收）和负干扰（共存离子引起显色反应不完
20、全）消除干扰的方法消除干扰的方法(a) (a) 控制酸度；控制酸度；(b) (b) 加入掩蔽剂；加入掩蔽剂； (c) (c) 改变干扰离子价态；改变干扰离子价态； (d) (d) 分离干扰离子。分离干扰离子。实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁 n铁盐标准溶液铁盐标准溶液 0.0100mg/mL n0.1% 邻二氮菲（又称邻菲咯琳）水溶液邻二氮菲（又称邻菲咯琳）水溶液n1% 盐酸羟胺水溶液盐酸羟胺水溶液nHAc-NaAc 缓冲溶液（缓冲溶液（ pH=4.6 ）称取）称取 136g 优级纯醋酸钠，加优级纯醋酸钠，加120mL 冰醋酸，加水溶解后，稀释至冰醋酸，加水
21、溶解后，稀释至500mL实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁 橙红色配合物的最大吸收波长在橙红色配合物的最大吸收波长在508nm处，摩尔吸光系处，摩尔吸光系数数508=1.1104，反应的灵敏度、稳定性、选择性均，反应的灵敏度、稳定性、选择性均较好。此反应可用于微量较好。此反应可用于微量Fe2+的测定，如果铁以的测定，如果铁以Fe3+的形式存在，则应预先加入还原剂盐酸羟胺或对苯二的形式存在，则应预先加入还原剂盐酸羟胺或对苯二酚将酚将Fe3+还原成还原成Fe2+。 n4 Fe3+2NH2OH 4Fe2+N2O+4H+H2O 羟胺羟胺实验：邻二氮菲分光光度法测定微量
22、铁实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁n Bi3+、Cd2+、Hg+、Zn2+、Ag +等离子与邻二氮菲生成沉等离子与邻二氮菲生成沉淀；淀；Cu2+、Co2+、Ni 2+等离子则形成有色配合物，因此，等离子则形成有色配合物，因此，当这些离子共存时，应注意它们的干扰。当这些离子共存时，应注意它们的干扰。铝和磷酸盐含量大时，使反应速度慢，铝和磷酸盐含量大时，使反应速度慢，CN存在将与存在将与Fe2+生成配合物，严重干扰测定，需预先除去。生成配合物，严重干扰测定，需预先除去。酸度高时，反应进行慢；酸度太低，则酸度高时，反应进行慢；酸度太低，则Fe2+水解，影响显色，水解，影响显色，测定时的酸度是控制在
23、测定时的酸度是控制在pH=4-6。第六节第六节 定量分析法定量分析法定量分析方法：标准曲线法Blank Standard Sample Sample一、单组分的定量分析一、单组分的定量分析（测定样品中某一种成分的含量）1.工作曲线法 （适用组成较简单的、批量的样品） 依据： A-C呈线性关系，作A-C曲线。配制一系列待测成分的标准溶液C1C2C3C4C5测出相应的吸光度A1A2A3A4A5Blank Standard Sample Sample建立工作直线（AC）作图法回归法n测量待测样品，得A样n从工作直线上找到待测成分的浓度C样n由回归方程计算出C样2. 增量法增量法（适用于组成较复杂的样
24、品） 取若干份等体积待测液。加入与待测液等体积的一系列标准溶液。 作A-C标曲线，此线与C标轴交点即为C样。C0=0（试剂空白）等体积标液等体积待测液C0C3C2C1C4理论依据：A=bc=b(C样+C标)当A=0时，C样=-C标方法特点方法特点：适用于组成较复杂的样品，对于批量样品较麻烦。AC标0（C0）-C样二、二、 多组分同时测定多组分同时测定 （同时测定一个样品中的几个组分）n溶液的总吸光度等于各组分的吸光度之和：nA=A1+A2+A3+Ann吸收峰互不重叠nA、B两组分的吸收峰相互不重叠，则可分别在A、B处用单组分含量测定法测定组分A和B。二、二、 多组分同时测定多组分同时测定 （同
25、时测定一个样品中的几个组分） （1）n个波长处分别测定样品的吸光度。 （假设测定n个组分，一般选择各个组分的max）（2）根据吸光度的加和性建立n个方程，解联立方程， 可得n个组分的浓度。原理：吸光度加和性例：同时测某样品中二个组分分别在1、2处测样品的吸光度A1、A2。（设定光程b=1cm）1:A1=11C1+12C22:A2=21C1+22C2ij：波长i处，j组分的摩尔吸光系数。文献，也可通过纯组分的工作直线的斜率求得。文献，也可通过纯组分的工作直线的斜率求得。例：同时测某样品中三个组分分别在1、2、3处测样品的吸光度A1、A2、A3。 （设定光程b=1cm） 1: A1 =11C1 +
26、12C2+13C3 2: A2 =21C1 +22C2+23C3 3: A3 =31C1 +32C2+33C3分光光度计的类型按按光束分光束分单光束分光光度计单光束分光光度计 722722、721721、723723、752752双光束分光光度计双光束分光光度计 JascoJasco-UV/VIS UV-2450/2550 760CRT-UV/VIS UV-2450/2550 760CRT单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示第七节第七节 双光束分光光度计的应用双光束分光光度计的应用 应用：能克服光源不稳定造成的误差一、光路图一、光路图 I0I0I0I
27、1I2样品 参比 切光器 单波长双光束分光光度计比值比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器二、工作原理二、工作原理 参比：样品：则：作A-C工作直线，定量。由于A与I0无关，所以，能够克服I0不稳定所造成的误差。第八节第八节 双波长分光光度计的应用双波长分光光度计的应用 特点：能消除共存干扰组分的影响；能消除浑浊试样的干扰；能用于高浓度试样的测量。属于背景吸收一、光路图一、光路图 结构特点：二个单色器 .显示器切光器（使光束交替通过）二、工作原理二、工作原理 1：A1=1bc+As1（As1：1处的背景吸收）2：A2=2bc+As2（As2：2处的背景吸收）如果As1=As2则A=A2-A1
28、=2bc-1bc+As2-As1=（2-1）bcA与c呈线性关系，可定量。.显示器12三、双波长分光光度法对于吸收曲线有重叠的单组分(显色剂与有色络合物的吸收光谱重叠)或多组分(两种性质相近的组分所形成的有色络合物吸收光谱重叠)试样、混浊试样以及背景吸收较大的试样，由于存在很强的散射和特征吸收，难以找到一个合适的参比溶液来抵消这种影响。利用双波长吸光光度法，使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除上述各种干扰，求得待测组分的含量。四、选择四、选择1和和2 （目的是为了使1和2下背景吸收As1
29、和As2相等。）x（干扰组分）Ay211. 已知干扰组分已知干扰组分注意波长的选择原则注意波长的选择原则A = A2-A1=(2bc+ As2)-(1bc+As1)=(2-1)bc关键问题n测量波长2和参比波长1的选择与组合n以两组分x和y的双波长法测定为例：n设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为:nAx和Ay，则该体系的总吸光度差Ax+y为：nAx+y = A x + A yn如何选择波长1 、2有一定的要求。21AyxA21yxy2、未知干扰组分、未知干扰组分 选择两波长十分接近但A差值较大的1和2。（1和2十分靠近，可以认为As1和As2相等；A尽可能大，可提供较高的灵敏度。）光谱分析参考书光谱分析参考书(1) (1) 光谱导论光谱导论石油大学出版社石油大学出版社 1992，李新安等译；，李新安等译；(2) (2) 紫外紫外可见光分光光度法可见光分光光度法，陈国珍，陈国珍 思考题及习题一、概念紫外-可见光吸收光谱图二、思考题n什么是紫外-可见光吸收光谱图？从中可以得到哪些有用的信息？n画出紫外-可见光分光光度计的光路图，并说明其主要部件和功能。n棱镜和光栅的分光原理及分光效果有哪些不同？n比色皿（或吸收池）有哪些不同的材料，在使用上有何不同，为什么？在定量分析中使用比色皿应当注意哪些事项，为什么？
