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1、观察昨天实验课的结果观察昨天实验课的结果1 1、观察自己组的实验结果：、观察自己组的实验结果：转化平板转化平板* *培养板在培养板在37C 37C 培养培养12-16h12-16h卫星菌：培养时间过长卫星菌：培养时间过长2 2、实验中的难点、实验中的难点* *制备效率高的感受态细胞制备效率高的感受态细胞重重组质粒的粒的鉴定定平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞组质粒的细胞提取的质粒提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一
2、步酶切鉴定重组质粒的进一步酶切鉴定如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？平板筛选：平板筛选： 大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞重组质粒的细胞提取的质粒提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一步酶切鉴定重组质粒的进一步酶切鉴定小量制备质粒和电泳分析小量制备质粒和电泳分析 质粒质粒质粒载体质粒载体是存在于细菌染色体外的小型闭是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链合环状双链DNA分子，在宿主细分子，
3、在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状细胞一定的遗传性状筛选标记筛选标记MCS（多克隆位点）（多克隆位点）复制原点复制原点质粒质粒1)培养细菌使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；收集裂解细菌；3)分离纯化质粒分离纯化质粒DNA。 质粒提取原理质粒提取原理：质粒提取有多种方法，但都包含质粒提取有多种方法，但都包含有有3个基本步骤：个基本步骤：去除蛋白去除蛋白质去除基因去除基因组DNA去除去除RNA*酚酚-氯仿抽提法氯仿抽提法*RNase消化消化？质粒质粒DNA与基因组与基因组DNA的区别的区别大肠杆菌遗传物质大肠杆菌遗传物质1、部位不同：
4、、部位不同：2、大小不同：、大小不同： 质粒分子量较小，大小只有普通质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体细菌染色体DNA的百分之一。的百分之一。 基因组基因组DNA分子量较大，细菌基分子量较大，细菌基因组约含因组约含3000个基因，个基因，5 106 bp。基因组基因组DNA容易断裂线性化容易断裂线性化提取的质粒的方法：提取的质粒的方法：特点：小量质粒制备、最简便、快捷特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）测序、转染（细提）1. 1. 小量碱裂解法小量碱裂解法2. 2. 质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒纯化原理：离子交
5、换柱层析等纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒小量制备质粒kit大量制备质粒大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒去除内毒素制备质粒kit质粒提取试剂盒可用于大部分分生实验，质粒提取试剂盒可用于大部分分生实验，本次试验不进行实验操作，只讲解结果分本次试验不进行实验操作，只讲解结果分析。析。碱裂解法提取质粒的原理碱裂解法提取质粒的原理原理：原理：1、强、强碱碱和和SDS裂解裂解细菌，细菌中的质粒或基因组细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱在碱性条件下发生变性。性条件下发生变性。2、怎样去除基因组、怎样去除基因组DNA？ 当加入当加入酸酸性物质进行性物质进行中和中和时，时，质粒质粒DNA很快复性，
6、很快复性， 染色体染色体DNA则则和变性蛋白质等缠绕在一起和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形难以复性而形成沉淀成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？、怎样去除蛋白质？ （已经学过）（已经学过） 留有质粒留有质粒DNA的上清，经的上清，经酚和氯仿去除蛋白质酚和氯仿去除蛋白质后后, 用乙醇用乙醇沉淀沉淀质粒质粒DNA，即得到质粒，即得到质粒DNA.1) 细胞悬浮液（溶液细胞悬浮液（溶液I）-悬浮菌体悬浮菌体50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.010 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.02) 细菌裂解液
7、（溶液细菌裂解液（溶液II） -裂解菌体裂解菌体0.2mol/L NaOH1% SDS碱裂解法提取质粒试剂碱裂解法提取质粒试剂：3）中和液（溶液）中和液（溶液III） -中和中和NaOH60 ml 5mol/L 醋酸钾醋酸钾11.5ml 冰醋酸冰醋酸28.5ml 水水4）20mg/ml RNase-降解细菌降解细菌RNA工作浓度工作浓度3050 g/ml其他试剂作用和成分同实验一。其他试剂作用和成分同实验一。质粒质粒DNA的的制备制备（1）（细菌的收获：）细菌的收获：） 取取1.5 ml 工程菌液工程菌液6,000转转/分，离心分，离心2min， 弃上清。弃上清。（2）（细菌的裂解：）细菌的裂
8、解：） 加入加入200 l预冷的细胞悬浮液（溶液预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮悬浮细细菌菌 加入加入200 l细菌裂解液（溶液细菌裂解液（溶液II），）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。 注：注： 粘稠粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。已经游出。（3）（中和：）（中和：）加入加入150 l中和液，上下颠倒混合后置中和液，上下颠倒混合后置 冰上冰上 5min， 12,000转转/分，分， 4离心离心 5min。 碱裂解法提取质粒操作步骤碱裂解法提取质粒操作步骤（去除蛋白质）（去除蛋白质） （4） 将上清移至
9、另一离心管中将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色注意不要混入白色沉淀物沉淀物)，加入等体积的，加入等体积的TE饱和的酚饱和的酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀混和液，振荡混匀1min，12,000转转/分离心分离心 5min。（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀溶液，振荡混匀1min， 12,000转转/分分 离心离心 5min 。（沉淀（沉淀DNA）（6）将上层水相移至另一离心管中，加入）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积倍体积的无水乙醇，的无水乙醇，
10、置置-20沉淀沉淀1015 min。上午实验结束上午实验结束（7 7） 12,000 转转/分离心分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10minDNA 5-10min。（去除（去除RNA）（8 8）用）用20 l含含RNase的的水溶解质粒水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合轻轻吹打混合。 37 保温保温10min20 l质粒质粒DNA溶液溶液取出取出10 l放于另一个离心管中备用放于另一个离心管中备用剩余剩余10 l用于下一步酶切用于下一步酶切重重组质粒的粒的鉴定定平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质
11、粒的细胞，却无法区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞空质粒或重组质粒的细胞提取的质粒提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一步酶切鉴定重组质粒的进一步酶切鉴定质粒的粒的电泳泳质粒质粒DNA的的3种形式泳动速度种形式泳动速度:超螺旋超螺旋线性线性开环开环 质粒质粒DNA的存在形式有的存在形式有3种种:1、共价闭环共价闭环DNA:常以超螺旋常以超螺旋形式存在形式存在 2、开环开环DNA:质粒质粒DNA两条链两条链中有一条发生一处或多处断裂，中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张因此可以自由旋转从而消除张力力,形成松弛的环状分子形成
12、松弛的环状分子 3、线性线性DNA:因质粒因质粒DNA的两的两条链在同一处断裂而造成条链在同一处断裂而造成.开环开环超螺旋超螺旋线性线性一、重组质粒的酶切一、重组质粒的酶切在一微量离心管中加入：在一微量离心管中加入： 1. 重组质粒重组质粒DNA 10 ul 2. 10 X Buffer M 2 ul 3. EcoRI 0.5 ul 4. Hind 0.5 ul 5. 去离子水去离子水 6 ul 总体积总体积 20 ul 置置37 ， 45 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒的酶切结果琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒的酶切结果 取取10 ul 酶切后的质粒酶切后的质粒 加加2 3 ul电泳上样液，混匀。电泳
13、上样液，混匀。 加入点样孔加入点样孔 电泳：电泳： 100伏，伏，40分钟。分钟。注：可将注：可将 5ul 未切的质粒作为对照。未切的质粒作为对照。质粒电泳质粒电泳空质粒空质粒重组质粒重组质粒重组质粒分子量变大而在重组质粒分子量变大而在电泳中滞后电泳中滞后质粒酶切电泳质粒酶切电泳a:酶切前酶切前b:酶切后酶切后插入片段插入片段注：注： 观察质粒的电泳带型观察质粒的电泳带型 分析质粒切不开的原因。分析质粒切不开的原因。4.4.CR产物与产物与T载体连接载体连接3. RT-PCR5.5. 转化转化2.提取提取RNA、 电泳电泳实验课总结实验课总结 -基因克隆总结基因克隆总结1.1. 基因组基因组D
14、NA提取、酶切、电泳提取、酶切、电泳（1）基因组）基因组DNA提取、酶切、电泳提取、酶切、电泳1)建立基因组文库的第一步建立基因组文库的第一步2)人类基因组测序的第一步人类基因组测序的第一步3)Southern blot的第一步的第一步Smear1 2 3 （2）RNA的提取、电泳的提取、电泳28S28S18S18S1)RT-PCR的第一步，也是目的的第一步，也是目的基因获得的第一步；基因获得的第一步；2)Northern blot的第一步；的第一步；注意：注意：RNA提取过程中提取过程中主要避免主要避免RNA酶的污染。酶的污染。（3） PCR及电泳分析及电泳分析1)获得目的基因的最常用方法；
15、获得目的基因的最常用方法；2)可以进行探针标记；可以进行探针标记；3)可以进行基因的定点突变可以进行基因的定点突变4)PCR酶切片段长度分析（酶切片段长度分析（PCR-RFLP）；）；5)可以定量分析基因含量（可以定量分析基因含量（real time PCR）.注意：引物设计是非常重要的。注意：引物设计是非常重要的。（4）T-A连接、转化连接、转化1）PCR产物的产物的T/A克隆克隆2）感受态细胞的制备；）感受态细胞的制备；3）重组质粒的转化）重组质粒的转化4）抗生素筛选）抗生素筛选平板筛选单克隆细胞平板筛选单克隆细胞注意：目的基因与载体的连接比例是本步骤的关键注意：目的基因与载体的连接比例是本步骤的关键分析自己小组的实验结果，分析自己小组的实验结果， 有时失败的经历更重要！有时失败的经历更重要！ 祝同学们下午考试中取得好成绩！祝同学们下午考试中取得好成绩！
