《多聚酶链式反应扩增DNA片段汇总课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多聚酶链式反应扩增DNA片段汇总课件（32页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段DNA指纹法在案件侦破中有重指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取场的血液、头发等样品中提取的的DNA，与犯罪嫌疑人的，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。件的侦破提供证据。讨论：讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的员要怎样才能得到足够量的DNA呢？呢？2.你还能说出你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？鉴定技术在其他
2、方面的应用吗？分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆里里里里斯斯斯斯( ( ( (K K K K. . . .B B B B. . . .M M M Mu u u ul l l ll l l li i i is s s s) ) ) )发发发发明明明明了了了了P P P
3、 PC C C CR R R R技技技技术术术术1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 （一）（一）DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位: :一、基础知识一、基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸
4、基团上的磷酸基团上的“OHOHOHOH”和和和和另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第3 3 3 3位碳原子位碳原子位碳原子位碳原子上的羟基上的羟基上的羟基上的羟基之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，即在即在即在即在相邻的相邻的相邻的相邻的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸的的的的3 3 3 3和和和和5 5 5 5碳原子碳原子碳原子碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通
5、过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过33，5-5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将通常将通常将DNADNA的的的的羟基羟基羟基羟基“OHOHOHOH”末端称为末端称为末端称为末端称为3 3 3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5 5 5端端端端3.3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图
6、DNADNA分子的平面结构分子的平面结构ATGCAGCT氢氢氢氢键键键键5端端3端端5端端3端端 识别识别 ：-OH端为端为3; 磷酸基团的磷酸基团的末端为末端为5。（1 1）DNADNA分子是由分子是由 的（即一的（即一条链为条链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3）脱）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。4.4.DNA双螺旋结构特点：双螺旋结构特点：（2 2） 与与 交替连结，排列在外交替连结，排列在外侧，构成侧，构成基本骨架基本骨架； 排列在链的内侧。排列在链的内侧。（3 3）两条链上的碱基通过）两条链上的碱基通过 连结起来，连结起来，形成碱
7、基对。碱基对的组成有特定的规律：形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤（即腺嘌呤（A A）一定与）一定与 配对，配对，鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）一定同）一定同 配对。配对。两条反向平行两条反向平行双螺旋双螺旋脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）（二）（二）DNA的复制：的复制：1.1.概念：概念：由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程。的过程。2.2.时期：时期：有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。3.3.场所：场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体细胞核
8、（主要）、线粒体、叶绿体4.4.基本条件：基本条件：酶酶: :解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶能量能量:ATP:ATP原料原料: :四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链5.5.复制特点：复制特点：a.a.边解旋边复制边解旋边复制b.b.半保留复制半保留复制6.6.遵循原则：遵循原则：碱基互补配对原则碱基互补配对原则7.7.精确复制的原因精确复制的原因a.a.规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板b.b.碱基互补配对保证了复制准确无误的进行碱基互补配对保证了复制准确无误的进行8.8.复制的意义复制的意义: :DNA分子
9、通过复制将遗传信息从亲代传给了分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。后代，保持了遗传信息的连续性。参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物总结：细胞内总结：细胞内DNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开打开打开DNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子
10、链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物（ RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链的原料合成子链的原料催化子链合成催化子链合成使使DNADNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3 3端开始连端开始连接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸 思考：思考：体外扩增体外扩增D
11、NADNA时，如何提供与体时，如何提供与体内内DNA复制相似条件？复制相似条件？ 变性变性（ 80100 ）Taq DNA聚合酶聚合酶（耐高温）（耐高温）2030个核苷酸构个核苷酸构成成DNA或或RNA二、二、PCR（多聚酶链式反应）（多聚酶链式反应）（一）（一）PCR原理原理DNA双链双链变性（加热变性（加热80-100 ）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）DNA单链单链变性的目的：变性的目的： 解开双链解开双链复性的目的：复性的目的：有利于引物有利于引物1和引物和引物2与两条单链与两条单链的结合的结合PCR扩增仪扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够扩增仪实际上就是一台能够自动调自动调控温度控
12、温度的仪器，它可以根据的仪器，它可以根据DNA的热变的热变性原理性原理，通过自动改变温度，达到扩增，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。片段的目的。1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸适温延伸高温变性高温变性低温复性低温复性重复重复1 13 3步步3030轮轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端端延伸延伸变性变性 复性复性（退火）退火） 延伸延伸（二）（二）PCR的反应过程：的反应过程：（二）（二）PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸
13、延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万（万（220）倍以上。）倍以上。DNADNA母链：母链： 解旋酶解旋酶( (条件）：条件）： 4 4种脱氧核苷酸：种脱氧核苷酸：DNADNA聚合酶（条件）：聚合酶（条件）： ATPATP：引物：引物：缓冲溶液缓冲溶液适宜温度适宜温度（三）（三）PCRPCR反应的条件反应的条件8010080100：耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶三、
14、三、 PCR实验实验操作操作1 1、PCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5mL0.5mL3 3、微量移液器、微量移液器 用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体液体，其其其其上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够实质上是能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器4 4、离心机、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。固体与液体分开的设备。
15、（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次9494，5min5min3030
16、3030次次次次9494，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次44，1min1min5555，30s30s7272，1min1min（二）操作步骤：（二）操作步骤：四、四、 结果分析与评价结果分析与评价DNA 含量的测定含量的测定：稀释稀释 对照调零对照调零 测定测定 计算计算5050倍倍蒸馏水做蒸馏水做对照对照波长波长260nm处读数处读数（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算四、四、课题成果评价课题成果评价1 1 、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为为2 2 n n2 2 、 a
17、a条条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为为a x2 a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1 、原理原理 可以通过测量可以通过测量DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与DNADNA的含量有关的含量有关光光吸吸收收波长波长nmnm2602602402402202202802800.10.10.20.22 2 、过程过程稀释稀释2 2L PCRPCR反应液，加入反应液，加入9898LL蒸馏水，即将样品进蒸
18、馏水，即将样品进蒸馏水，即将样品进蒸馏水，即将样品进行行行行50505050倍稀释倍稀释倍稀释倍稀释对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将处，将紫外分光光度计的读数调节至零紫外分光光度计的读数调节至零取取DNADNA稀释液稀释液100100L至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处的处的处的处的光吸收值光吸收值光吸收值光吸收值测定并测定并计算计算计算计算DNADNADNADNA含量（含量（含量（含量（ g g g g/mL/mL/mL/mL）50505050(260nm(260nm(260nm(260nm的读数的读数的读
19、数的读数) ) ) )稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数5050：在厚度为在厚度为1cm比色杯中的吸光值为比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为的含量为5050 g g / /mLmL紫外分光光度计紫外分光光度计比色杯比色杯体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNA
20、DNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的5 5端向端向 3 3端端延伸延伸子链的子链的5 5端向端向 3 3端延伸端延伸课堂小结课堂小结多多聚聚酶酶链链式式反反应应扩扩增增DNA片片段段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变
21、性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR仪仪仪仪设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算课堂练习课堂练习填空填空题题1.PCR仪加热使（仪加热使（ ）变性）变性, 复性使引物与模复性使引物与模板板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温延伸需将反应温度升至中温( ),在（在（ ）的作用下）的作用下,以（以（ ）为原）为原料合成新链。料合成新链。2.PCR经（经（ ）三个阶段为一个）三个阶段为一个循环。循环。DNA互补互补72Tap酶酶4种种dNTP变性、复性、延伸变性、复性、延
22、伸选择选择题题1.PCR反应产物的特异性取决于反应产物的特异性取决于( )A退火温度退火温度 B引物碱基组成和长度引物碱基组成和长度C循环次数循环次数 D.A+B+CD2. PCR实验的特异性主要取决于（实验的特异性主要取决于（ ）A.DNA聚合酶的种类聚合酶的种类 B.反应体系中模板反应体系中模板DNA的量的量C.引物序列的结构和长度引物序列的结构和长度D.四种四种dNTP的浓度的浓度C3.做做PCRPCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是用前必须进行的关键步骤是 A.A.反复洗涤反复洗涤 B.B.不怕外源不怕外源DNADNA污染污染 C.C.高压灭菌高压灭菌 D.D.在在-20-20储存储存4.PCR4.PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是 A.A.原理原理简单简单 B.B.原料易获得原料易获得 C.C.Taq DNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性 D.D.快速快速、高效、灵活、易于操作、高效、灵活、易于操作
