《动物毒理实验》课件：实验二 小鼠骨髓细胞微核试验

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1、实验二小鼠骨髓细胞微核试验2 实验原理 微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。内而形成，由于比核小得多故称微核。 通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（胞（PCEPCE）的微核出现率，间接反应骨髓细）的微核

2、出现率，间接反应骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试药物是否具有致突变作用试药物是否具有致突变作用, ,主要用于测试主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。干扰细胞有丝分裂的物质。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成3 实验材料3.1 3.1 器材器材 解剖器械，显微镜，载玻片等。3.2 3.2 试剂试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、Giemsa储备液、pH 6.8磷酸盐缓冲液、小牛血清、生理盐水3.3 3.3 药物药物 环磷酰胺3.4 3.4 动物动物 小鼠7-12周龄，体重20-30g， 雌雄各半。4 操作步骤4.1 4.

3、1 给药给药 环磷酰胺生理盐水溶液按环磷酰胺生理盐水溶液按50mg/kg50mg/kg剂量腹剂量腹腔注射腔注射2 2次次，间隔，间隔24h24h。 空白对照：生理盐水空白对照：生理盐水4.2 4.2 骨髓液的制备和涂片骨髓液的制备和涂片 试验动物第二次染毒试验动物第二次染毒6 6小时后用颈椎脱臼小时后用颈椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉。剔去肌肉。 在在洁洁净净的的玻玻片片滴滴小小牛牛血血清清1 1滴滴，剪剪去去骨骨骺骺，用用止止血血钳钳将将骨骨髓髓挤挤到到血血清清中中，混混匀匀，推推片片，干燥。干燥。4 操作步骤操作步骤4.3 4.3 固

4、定固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇液固定液固定5-10min5-10min，取出，晾干。不能及时染，取出，晾干。不能及时染色的涂片也应固定好保存。色的涂片也应固定好保存。4 操作步骤操作步骤4.4 4.4 染色染色 将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的GiemsaGiemsa染液染液(Giemsa(Giemsa储备液储备液1 1份份+pH6.8+pH6.8的磷酸盐的磷酸盐缓冲液缓冲液9 9份份) ) 染色染色10-15min10-15min，冲洗，晾干。，冲洗，晾干。1/15mol/L1/15mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐

5、缓冲液(PH6.8)(PH6.8)磷酸二氢钾磷酸二氢钾(KH(KH2 2POPO4 4) )4.50g4.50g磷酸氢二钠磷酸氢二钠(Na(Na2 2HPOHPO4 412H12H2 2O)O) 11.81g11.81g加蒸馏水至加蒸馏水至 1000mL1000mL 4 操作步骤操作步骤嗜多染红细胞（嗜多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞（）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈粉红色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，呈粉红色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。4.5 4.5 观察计数观察计数 低倍镜下观察，选

6、择细胞完整、分散均匀，低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，再在油镜下观察计数。着色适当的区域，再在油镜下观察计数。 计数计数10001000个个PCEPCE中含微核的中含微核的PCEPCE数，并且计数数，并且计数至少至少200200个细胞（个细胞（PCE+NCE200PCE+NCE200个）中个）中PCEPCE与与NCENCE的比值。的比值。4 操作步骤操作步骤MNNCE5 结果记录细胞细胞细胞细胞总数总数总数总数微核微核微核微核细胞数细胞数细胞数细胞数微核率微核率微核率微核率（）PCEPCEPCEPCE数数数数NCENCENCENCE数数数数PCE/PCE/PCE/PCE/

7、NCENCENCENCE空白组空白组空白组空白组染毒组染毒组染毒组染毒组表表 微核率统计微核率统计嗜多染红细胞微核率嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数检查嗜多染红细胞数1000正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常过千分之五为异常 。6 结果分析与评价本试验中只计数本试验中只计数PCEPCE中微核，微核率以千分中微核，微核率以千分率表示。率表示。PCE/NCEPCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCEPCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意义值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。不可靠。 正正常常PCE/NCEPCE/NCE约约为为1 1（正正常常范范围围0.6-1.20.6-1.2），如如比比值值小小于于0.10.1，表表示示PCEPCE形形成成受受到到严严重重抑抑制制；如如比比值值小小于于0.050.05，表表示示受受试试物物剂剂量量过过大大，实实验验结结果果不不可可靠。靠。