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1、第五章第五章 氨基酸和蛋白质提取工艺氨基酸和蛋白质提取工艺基本要求基本要求 了解氨基酸和蛋白质的理化性质和了解氨基酸和蛋白质的理化性质和 分类，以及各种生理活性；分类，以及各种生理活性；掌握蛋白质的提取工艺。掌握蛋白质的提取工艺。第一节第一节 概述概述一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质1. 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质分子量：分子量：1万万百万之间；百万之间；分子大小：已达到胶粒分子大小：已达到胶粒1-100nm范围之内；范围之内；亲水性：球状蛋白质的表面多亲水基团，亲水性：球状蛋白质的表面多亲水基团，具强烈的吸引水分子作用；表面形成一水具强烈的吸引水分子作用；表面形成一水化膜；阻止
2、蛋白质颗粒的相互聚集。化膜；阻止蛋白质颗粒的相互聚集。扩散速度慢，不易透过半透膜，黏度大。扩散速度慢，不易透过半透膜，黏度大。2.蛋白质的等电点蛋白质的等电点蛋白质由各种氨基酸组成蛋白质由各种氨基酸组成 不同的等电点：所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸不同的等电点：所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸 的数目不同，有各自等电点。的数目不同，有各自等电点。等电点偏碱性：含碱性氨基酸数目较多；组蛋白等电点偏碱性：含碱性氨基酸数目较多；组蛋白等电点偏酸性：含酸性氨基酸数目较多；等电点偏酸性：含酸性氨基酸数目较多；人体体液中许多蛋白质的等电点为人体体液中许多蛋白质的等电点为PH5.0左右，左右， 所以在体内以负离子
3、形式存在。所以在体内以负离子形式存在。3.蛋白质的变性蛋白质的变性（次级键、二硫键的破坏）（次级键、二硫键的破坏）变性蛋白质和天然蛋白质最明显的差别：变性蛋白质和天然蛋白质最明显的差别： 溶解度降低，溶解度降低， 同时蛋白质的黏度增加，同时蛋白质的黏度增加， 结晶性破坏，结晶性破坏， 生物活性丧失，生物活性丧失， 易被蛋白酶分解易被蛋白酶分解 3.蛋白质的变性蛋白质的变性引起蛋白质变性的原因：（物理和化学）引起蛋白质变性的原因：（物理和化学）物理因素：物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、加热、加压、脱水、搅拌、振荡、 紫外线照射、超声波等；紫外线照射、超声波等；化学因素：化学因素：强酸、强
4、碱、尿素、重金属盐等强酸、强碱、尿素、重金属盐等 在临床医学上，变性因素常常被应用于消毒在临床医学上，变性因素常常被应用于消毒及灭菌。及灭菌。 注意防止蛋白质变性就能有效保存蛋白质制注意防止蛋白质变性就能有效保存蛋白质制剂剂 3.蛋白质的变性蛋白质的变性可逆变性：可逆变性：当变性程度较轻时，如去除变当变性程度较轻时，如去除变性因素，有些蛋白质仍能恢复或部分恢复性因素，有些蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，称为复性其原来的构象及功能，称为复性不可逆变性：不可逆变性：许多蛋白质变性时被严重破许多蛋白质变性时被严重破坏，不能恢复。坏，不能恢复。 4.蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀蛋白质沉淀：蛋白
5、质沉淀：蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象。蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象。 变性蛋白质一般易于沉淀，变性蛋白质一般易于沉淀， 但也可不变性而使蛋白质沉淀。但也可不变性而使蛋白质沉淀。 如何聚集？如何聚集？ 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即因素，即颗粒表面的水化层和电荷颗粒表面的水化层和电荷n若无外加条件，不致互相凝集；若无外加条件，不致互相凝集；n去除这两个稳定因素（如去除这两个稳定因素（如pH调节等），蛋调节等），蛋白质便容易凝集析出白质便容易凝集析出引起蛋白质沉淀的方法：引起蛋白质沉淀的方法：a.盐析盐析 加入大量的中性盐以破坏蛋白质的
6、胶体稳加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出。定性而使其析出。常用的盐：硫酸铵，硫酸钠，氯化钠等。常用的盐：硫酸铵，硫酸钠，氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和pH不同，不同，故可用于对混合蛋白质组分的分离故可用于对混合蛋白质组分的分离。 b.重金属盐沉淀蛋白质：重金属盐沉淀蛋白质： 蛋白质可与重金属蛋白质可与重金属Hg、Pb等结合成盐沉淀等结合成盐沉淀沉淀的条件以沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜稍大于等电点为宜，此时蛋，此时蛋白质分子有较多的负离子可与金属成盐。白质分子有较多的负离子可与金属成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低重金属沉淀的
7、蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质于分离制备不变性的蛋白质临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的性质，临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的性质，抢救误服重金属盐中毒的病人。抢救误服重金属盐中毒的病人。c.生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质：生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质：蛋白质可与生物碱试剂（苦味酸、鞣酸）蛋白质可与生物碱试剂（苦味酸、鞣酸）以及某些酸（三氯乙酸、硝酸等）结合成以及某些酸（三氯乙酸、硝酸等）结合成不溶性的盐沉淀；不溶性的盐沉淀； 沉淀的条件为沉淀的条件为pH小于等电点小于等电点，此时蛋白质，此
8、时蛋白质带正电荷易与酸根负离子结合成盐；带正电荷易与酸根负离子结合成盐；临床血液分析时，常用此原理去除血液中临床血液分析时，常用此原理去除血液中的蛋白质的蛋白质此类沉淀反应还可用于检查尿液中蛋白质此类沉淀反应还可用于检查尿液中蛋白质d.有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质： 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜质颗粒的水化膜在等电点时使蛋白质沉淀在等电点时使蛋白质沉淀；常温下，有机溶剂往往使得蛋白质变性，常温下，有机溶剂往往使得蛋白质变性，如酒精消毒灭菌如酒精消毒灭菌若在
9、低温条件下，则变性进行较缓慢，可若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质用于分离制备各种血浆蛋白质e.加热凝固：加热凝固：将将接近等电点的蛋白质溶液加热接近等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋，可使蛋白质凝固沉淀；白质凝固沉淀；加热首先使蛋白质变性，有规则的肽链结加热首先使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。成凝胶状的蛋白块。 如煮熟的鸡蛋、蛋黄和蛋清都凝固如煮熟的鸡蛋、蛋黄和蛋清都凝固蛋白质的变性、沉淀、凝固相互之蛋白质的变性
10、、沉淀、凝固相互之间有密切关系间有密切关系蛋白质变性后不一定沉淀，变性的蛋白质变性后不一定沉淀，变性的蛋白质只在等电点附件才沉淀；蛋白质只在等电点附件才沉淀；沉淀的蛋白质也不一定凝固沉淀的蛋白质也不一定凝固二、蛋白质、氨基酸的分类二、蛋白质、氨基酸的分类1.蛋白质的分类蛋白质的分类按组成上分：按组成上分：单纯蛋白质和结合蛋白质单纯蛋白质和结合蛋白质单纯蛋白质：单纯蛋白质：水解后只生成氨基酸的蛋白质。水解后只生成氨基酸的蛋白质。一部分酶蛋白和结构蛋白以及所有的储存蛋白一部分酶蛋白和结构蛋白以及所有的储存蛋白都属于此类都属于此类结合蛋白结合蛋白则分为核蛋白（含核酸）、糖蛋白（含则分为核蛋白（含核酸
11、）、糖蛋白（含糖）、血红蛋白（含血红素）等糖）、血红蛋白（含血红素）等根据功能分类：根据功能分类： 酶蛋白、结构蛋白和储藏蛋白酶蛋白、结构蛋白和储藏蛋白酶蛋白：数量最丰富，担任细胞中多种酶蛋白：数量最丰富，担任细胞中多种生化反应的催化作用；生化反应的催化作用；结构蛋白：控制细胞壁的伸长；存在植结构蛋白：控制细胞壁的伸长；存在植物的细胞壁和细胞器中物的细胞壁和细胞器中储藏蛋白：贮藏物质，供生长利用。储藏蛋白：贮藏物质，供生长利用。按功能分类：按功能分类：活性蛋白质和非活性蛋白质活性蛋白质和非活性蛋白质活性蛋白质：酶、激素蛋白质、膜蛋白质等活性蛋白质：酶、激素蛋白质、膜蛋白质等 非活性蛋白质：胶原
12、蛋白、角蛋白等。非活性蛋白质：胶原蛋白、角蛋白等。三、蛋白质、氨基酸的生理功能三、蛋白质、氨基酸的生理功能蛋白质是与各种形式的生命活动联系在一蛋白质是与各种形式的生命活动联系在一起的物质，是组成人体一切细胞、组织的起的物质，是组成人体一切细胞、组织的重要成分，没有蛋白质就没有生命重要成分，没有蛋白质就没有生命而氨基酸是蛋白质的基石，没有氨基酸就而氨基酸是蛋白质的基石，没有氨基酸就没有生命没有生命人体对蛋白质的需要实际上是对氨基酸的人体对蛋白质的需要实际上是对氨基酸的需要需要三、蛋白质、氨基酸的生理功能三、蛋白质、氨基酸的生理功能降解蛋白质需配对的功能肽降解蛋白质需配对的功能肽，不仅保持原有，不
13、仅保持原有的蛋白质营养成分及功能，且强化功能，具的蛋白质营养成分及功能，且强化功能，具有极强的活性和多样性。有极强的活性和多样性。小肽可防治高血压、高血脂、心脏病、抗氧小肽可防治高血压、高血脂、心脏病、抗氧化，抗病毒，提高机体免疫力等生理活性。化，抗病毒，提高机体免疫力等生理活性。第二节第二节 氨基酸和蛋白质的提取工业特性氨基酸和蛋白质的提取工业特性大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀碱或稀大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液酸溶液少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂酮、丁醇等有机溶剂蛋白质在不同溶剂中的溶解度差别，主要蛋白质在不同溶剂中的
14、溶解度差别，主要取决于蛋白质分子中极性基团与非极性基取决于蛋白质分子中极性基团与非极性基团的比例和位置及偶极距；团的比例和位置及偶极距；第二节第二节 氨基酸和蛋白质的提取工业特性氨基酸和蛋白质的提取工业特性蛋白质在不同溶剂中的溶解度差别，主要蛋白质在不同溶剂中的溶解度差别，主要取决于蛋白质分子中极性基团与非极性基取决于蛋白质分子中极性基团与非极性基团的比例和位置及偶极距；团的比例和位置及偶极距；可采用可采用不同溶剂和调整影响蛋白质溶解度不同溶剂和调整影响蛋白质溶解度的外界因素（温度、的外界因素（温度、pH、离子强度等），、离子强度等），即可把所需的蛋白质和酶从细胞内复杂的即可把所需的蛋白质和酶
15、从细胞内复杂的组分中提取分离出来组分中提取分离出来1.蛋白质的水溶液提取法蛋白质的水溶液提取法凡是能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白凡是能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白质或酶，一般都可用稀盐溶液或缓冲溶液质或酶，一般都可用稀盐溶液或缓冲溶液提取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和提取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和增加蛋白质的溶解度增加蛋白质的溶解度一般稀盐溶液用量为原材料的一般稀盐溶液用量为原材料的3-6倍体积，倍体积，可一次性提取或分次提取。提取时常缓慢可一次性提取或分次提取。提取时常缓慢搅拌，以提高提取效率。搅拌，以提高提取效率。 注意因素：注意因素：盐浓度：一般在盐浓度：一般在0.02-0.
16、2mol/L；pH：一般选择在被提取的蛋白质：一般选择在被提取的蛋白质等电点等电点两侧的稳定区内。两侧的稳定区内。 如：细胞色素如：细胞色素C（碱性蛋白质），常用稀（碱性蛋白质），常用稀酸提取。酸提取。温度：蛋白质和酶都不耐热，提取时通温度：蛋白质和酶都不耐热，提取时通常要求常要求低温操作低温操作。2.蛋白质的有机溶剂提取法蛋白质的有机溶剂提取法难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的，和脂质难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的，和脂质结合交牢固的蛋白质或酶，常用有机溶剂结合交牢固的蛋白质或酶，常用有机溶剂提取。提取。常用的溶剂：异丙醇、乙醇、正丁醇等，常用的溶剂：异丙醇、乙醇、正丁醇等，同时有亲脂性和亲水性。同
17、时有亲脂性和亲水性。3.从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法4. 蛋白质和酶提取后的进一步纯化蛋白质和酶提取后的进一步纯化常用的方法有：常用的方法有：盐析法；盐析法；等电点沉淀法；等电点沉淀法；有机溶剂分级分离法；有机溶剂分级分离法；层析法层析法 （凝胶过滤层析，离子交换层析，（凝胶过滤层析，离子交换层析，吸附层析等）；吸附层析等）；电泳法；电泳法；结晶纯化等。结晶纯化等。举例：举例：凝集素：（能使红细胞凝集的蛋白质）凝集素：（能使红细胞凝集的蛋白质）采用生理盐水或缓冲溶液提取采用生理盐水或缓冲溶液提取需进一步纯化需进一步纯化提取液直接上提取液直接上Sephadex柱，纯化柱，纯化提取液通过固定化配体的亲和柱，纯化提取液通过固定化配体的亲和柱，纯化凝集素结合蛋白：凝集素结合蛋白：配体为糖蛋白、糖肽等配体为糖蛋白、糖肽等硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀（老工艺）（老工艺）新工艺新工艺
