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1、第三章第三章核酸的结构与功能核酸的结构与功能1核糖核酸核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)核酸核酸(nucleicacid)(多聚核苷酸多聚核苷酸)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)*核酸的构件分子是核苷酸核酸的构件分子是核苷酸(nucleotide)*DNA是遗传信息的载体是遗传信息的载体*RNA转录遗传信息，参与蛋白质生物合成转录遗传信息，参与蛋白质生物合成目前研究发现目前研究发现RNA功能广泛，其核心作用功能广泛，其核心作用是基因表达的调控。是基因表达的调控。2第一节第一节 核苷酸核苷酸碱基碱基(bases)（嘌呤、嘧啶嘌呤、嘧啶）
2、N糖苷键糖苷键核苷核苷戊糖戊糖(pentose)(nucleoside)磷酸酯键磷酸酯键（脱氧核糖脱氧核糖核糖）核糖）核苷酸核苷酸磷酸磷酸(nucleotide)(phosphate)34一、一、碱基碱基1.碱基碱基是含氮杂环化合物，嘧啶和嘌呤两类是含氮杂环化合物，嘧啶和嘌呤两类腺嘌呤腺嘌呤(A,adenine)嘌呤嘌呤(purine)鸟嘌呤鸟嘌呤(G,guanine)胞嘧啶胞嘧啶(C,cytosine)嘧啶嘧啶(pyrimidine)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T,thymine)尿嘧啶尿嘧啶(U,uracil)56嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶DNAAGCTRNAAGCU*核酸分子中含有稀有碱基核酸分子中含有稀有
3、碱基(rarebases)72.碱基可随碱基可随PH变化变化出现酮式，烯醇式互变。出现酮式，烯醇式互变。83.嘧啶和嘌呤碱基均具有共轭双键，对波长为嘧啶和嘌呤碱基均具有共轭双键，对波长为260nm左右的紫外光有较强吸收左右的紫外光有较强吸收图图3-494. 4. 碱基的亚氨基中氢能与具有较大电负性碱基的亚氨基中氢能与具有较大电负性N 和羰基氧和羰基氧=O形成氢键形成氢键10二、二、戊糖戊糖*核酸中有两种戊糖核酸中有两种戊糖DNA为为D-2-脱氧核糖脱氧核糖(D-2-deoxyribose)RNA为为D-核糖核糖(D-ribose)111191三、核苷三、核苷 1.1.核苷是戊糖与碱基之间以糖苷
4、键核苷是戊糖与碱基之间以糖苷键（glycosidicbond）相连接而成，称为相连接而成，称为N-N-糖苷键糖苷键12表表3-1各种常见的核苷各种常见的核苷13图图3-7稀有碱基与假尿苷稀有碱基与假尿苷2. RNA2. RNA中含有稀有碱基，还存在异构化的核苷中含有稀有碱基，还存在异构化的核苷 假尿苷（假尿苷（）111514四、核苷酸四、核苷酸 515164.环核苷酸：环腺苷酸环核苷酸：环腺苷酸(cyclicAMP,cAMP)和环鸟苷酸和环鸟苷酸(cyclicGMPcGMP)175.单核苷酸的生理作用单核苷酸的生理作用1)1)核酸的核酸的构件分子构件分子2)2)参与物质代谢参与物质代谢(UTP
5、(UTP、CTP)CTP)、能量代谢、能量代谢(ATP)(ATP)3)3)作为第二信使作为第二信使( (cAMPcAMP) )，在信号传递过程中起，在信号传递过程中起 重要作用重要作用, ,参与代谢调节参与代谢调节4)4)参与某些生物活性物质的组成参与某些生物活性物质的组成 (NAD(NAD+ + 、NADPNADP+ +) )18第二节第二节核酸的分子结构核酸的分子结构*核酸的核酸的构件分子构件分子是是核苷酸核苷酸组成组成RNA的核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸是核糖核苷酸主要有四种主要有四种AMP、CMP、GMP、UMP组成组成DNA的核苷酸是的核苷酸是脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸主要有四种主要
6、有四种dAMP、dCMP、dGMP、dTMP*核酸中核苷酸以核酸中核苷酸以3,5磷酸二酯键磷酸二酯键相连相连19一、核酸的一级结构一、核酸的一级结构1.概念：概念：2.核酸的一级结构是指其多核苷酸中的碱核酸的一级结构是指其多核苷酸中的碱基的排列顺序基的排列顺序*DNA的一级结构是指的一级结构是指DNA中脱氧核糖中脱氧核糖核苷酸的排列顺序。核苷酸的排列顺序。 *RNA的一级结构是指的一级结构是指RNA中核糖核苷中核糖核苷酸的排列顺序。酸的排列顺序。1.2.205端端3端端3,5磷酸二酯键磷酸二酯键(a)21P图图3-10DNA的分子书写方式的分子书写方式(a)分子结构式分子结构式(b)线条式线条
7、式（c）字母式字母式222.书写方式书写方式*简写形式简写形式5-AGGCU-3（5末端含磷酸，末端含磷酸，3末端含羟基）末端含羟基）3.多核苷酸多核苷酸（polynucleotide）寡核苷酸寡核苷酸(oligonucleotide)23二、二、DNADNA的空间结构的空间结构 1.DNA1.DNA的二级结构的二级结构 1 1） DNADNA双螺旋结构研究背景双螺旋结构研究背景 （double helix structuredouble helix structure） 24 Chargaff的碱基分析的碱基分析 不同种生物不同种生物DNADNA分子中的碱基组成不同分子中的碱基组成不同 同一
8、生物不同组织其同一生物不同组织其DNADNA分子的分子的碱基组碱基组成相成相同同 某一特定生物其某一特定生物其DNADNA碱基组成是固定的碱基组成是固定的 任何生物任何生物DNADNA碱基组成都符合碱基组成都符合 ChargaffChargaff 定律定律 A=TA=T， G=C G=C 即即 A+G=T+CA+G=T+C DNA纤维晶体的纤维晶体的x-衍射研究衍射研究显示显示DNADNA是双链是双链 的螺旋形分子的螺旋形分子253355262 2） DNADNA双螺旋（双螺旋（B B型）结构特点型）结构特点由两条由两条DNADNA互补链互补链反向平行反向平行。 右手螺旋，直径为右手螺旋，直径
9、为2nm2nm。 DNADNA双螺旋亲水骨架是双螺旋亲水骨架是脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸, , 在螺旋分子的在螺旋分子的外侧外侧，而疏水，而疏水碱基碱基对在对在 螺旋分子螺旋分子内部。内部。 27 碱基对之间的碱基对之间的 距离为距离为0.34nm0.34nm，并有一个并有一个 3636 的夹角，的夹角，每一螺旋内含每一螺旋内含1010个个 碱基对碱基对， 螺距为螺距为3.4nm.3.4nm. 螺旋表面有螺旋表面有大沟大沟 (major groove)(major groove)和和小沟小沟 (minor groove)(minor groove). .是是DNADNA与蛋白质结合的部位与蛋
10、白质结合的部位28 DNADNA双螺旋通过中的碱基氢键配对生成。双螺旋通过中的碱基氢键配对生成。 A A与与T T 配对，形成配对，形成二二个氢键。个氢键。 G G与与C C 配对，形成配对，形成三三个氢键。个氢键。29 3 3）维持）维持DNADNA二级结构稳定性的因素二级结构稳定性的因素 碱基对间的氢键碱基对间的氢键 碱基的堆积力碱基的堆积力（stacking forcestacking force） 相邻碱基对相距相邻碱基对相距0.34nm0.34nm存在存在 Van Van derder waalswaals力。力。 碱基对的疏水性使之在水溶液中相互碱基对的疏水性使之在水溶液中相互 间
11、聚集而形成疏水键。间聚集而形成疏水键。 30 DNADNA链上存在大量的磷酸基团链上存在大量的磷酸基团, ,带负电荷，带负电荷， 能使两条互补链分开，在生理条件下，双能使两条互补链分开，在生理条件下，双 螺旋表面存在着可中和磷酸基团的碱性蛋螺旋表面存在着可中和磷酸基团的碱性蛋 白质和带正电荷的白质和带正电荷的NaNa+ + , ,降低静电斥力。降低静电斥力。314）DNA双螺旋的种类：双螺旋的种类：DNA构象与核苷酸顺序、碱基组成有构象与核苷酸顺序、碱基组成有关，并取决于环境条件（盐类、相对关，并取决于环境条件（盐类、相对湿度）湿度） 生理条件下，右手生理条件下，右手DNA双螺旋大多以双螺旋大
12、多以 B型形式存在型形式存在, ,还有还有A型、型、C型、型、D型、型、 E型型323334左手双螺旋左手双螺旋DNA Z-DNA发现发现:1979年，年，Rich等人工合成六聚体等人工合成六聚体d（CGCGCG）单晶进行单晶进行X射线衍射射线衍射分析，数据表明主链的走向呈分析，数据表明主链的走向呈“之之”字型，字型，左手双螺旋左手双螺旋DNA35ZDNA的结构特点的结构特点:a.每个螺旋由每个螺旋由12个碱基对个碱基对构成，螺距构成，螺距4.46nm直径直径1.8nmb.碱基组成特殊，为嘌呤和嘧啶交替碱基组成特殊，为嘌呤和嘧啶交替排列，如排列，如CGCGCG主链呈锯齿状主链呈锯齿状（Zig-
13、Zag）走向。走向。c.只有一条只有一条沟沟d.体内体内ZDNA的存在的存在ZDNA的功能：与基因转录调节有关的功能：与基因转录调节有关36（4）三股螺旋）三股螺旋DNA概念：概念：三股螺旋三股螺旋DNA中通常是一条同型寡核苷酸中通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合，三股螺旋中的第三股可以来自分沟结合，三股螺旋中的第三股可以来自分子间，也可以来自分子内。子间，也可以来自分子内。三股螺旋三股螺旋DNA存在于基因调控区和其他存在于基因调控区和其他重要区域，具有重要生理意义。重要区域，具有重要生理意义。37图3-14三股螺旋三股螺旋D
14、NA嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸嘌呤核苷酸382. DNA2. DNA的三级结构的三级结构超螺旋结构超螺旋结构1）DNA三级结构是指三级结构是指DNA链进一步扭曲盘链进一步扭曲盘 旋形成超螺旋结构旋形成超螺旋结构 2 2）大多数原核生物和病毒的基因组大多数原核生物和病毒的基因组DNADNA以双以双 链环状链环状DNADNA形式存在。真核细胞中的线粒形式存在。真核细胞中的线粒 体体DNADNA、叶绿体叶绿体DNADNA都是环状的都是环状的 39 3）超螺旋可分超螺旋可分正超螺旋和负超螺旋。几乎正超螺旋和负超螺旋。几乎所有天然所有天然DNADNA中都存在负超螺旋结构中都存在负超螺旋结构图图3-1
15、5原核生物原核生物DNA超螺旋超螺旋403.DNA3.DNA的四级结构的四级结构DNADNA与蛋白质形成复合物与蛋白质形成复合物 1 1）真核生物基因组）真核生物基因组DNADNA折叠第一层是核小体，折叠第一层是核小体， 图图3-16核小体结构核小体结构41 * * 核小体的结构核小体的结构 a.a.由由146bp146bp长的双链长的双链DNADNA绕组蛋白八聚体绕组蛋白八聚体 核心核心(H(H2A2A,H,H2B2B,H,H3 3,H,H4 4 ) )2 2 1.75 1.75 圈组成圈组成 核心颗粒。核心颗粒。 b.b.各核心颗粒间有一个连接区，由各核心颗粒间有一个连接区，由60bp60
16、bp 的的DNADNA和和1 1个分子组蛋白个分子组蛋白H H1 1构成。构成。42图图3-17真核生物染色体真核生物染色体DNA组装不同层次的结构组装不同层次的结构2 2）核小体又进一步盘绕折叠，最后形成染色体）核小体又进一步盘绕折叠，最后形成染色体43 三、三、 基因和基因组基因和基因组1.1.基因（基因（genegene） 基因的现代分子生物学概念是指能编码有基因的现代分子生物学概念是指能编码有 功能的蛋白质多肽链或合成功能的蛋白质多肽链或合成RNARNA所必需的所必需的 全部核酸序列，是核酸分子的功能单位。全部核酸序列，是核酸分子的功能单位。 44图图3-18真核生物基因结构示意真核生
17、物基因结构示意452.基因组（基因组（genome）基因组是指一个细胞或病毒所有基因及间隔基因组是指一个细胞或病毒所有基因及间隔序列，储存了一个物种所有的遗传信息。序列，储存了一个物种所有的遗传信息。46病毒基因组病毒基因组病毒病毒DNA的大小差别很大的大小差别很大每种病毒只有一种核酸，每种病毒只有一种核酸，DNA或或RNA组成组成肝炎病毒（肝炎病毒（hepatitisvirus):甲肝病毒（甲肝病毒（HAV)RNA病毒病毒乙肝病毒乙肝病毒（HBV）DNA病毒病毒丙肝病毒（丙肝病毒（HCV）RNA病毒病毒丁肝病毒丁肝病毒（HDV）RNA病毒病毒戊肝病毒戊肝病毒（HEV）RNA病毒病毒47病毒基
18、因组最病毒基因组最 大的特点是出大的特点是出 现重叠基因现重叠基因48原核生物基因组原核生物基因组原核生物基因组多为环状双链原核生物基因组多为环状双链DNA原核生物基因组原核生物基因组大部分为结构基因，编码大部分为结构基因，编码 生存所必需的蛋白质和生存所必需的蛋白质和RNA各种生物的的基因数目与各种生物的的基因数目与DNA量的比较量的比较大肠杆菌大肠杆菌基因数基因数2350DNA分子大小分子大小4.2106编码序列编码序列占基因组占基因组%98以上5酵母酵母果蝇果蝇610087501.31071.4108人人30000-350003.210927049原核生物基因组最大的特点是具有操纵子原核
19、生物基因组最大的特点是具有操纵子 （operon）结构结构大肠埃希菌乳糖操纵子大肠埃希菌乳糖操纵子50 真核生物基因组真核生物基因组基因组比原核生物大得多基因组比原核生物大得多 真核生物中进化的复杂程度与真核生物中进化的复杂程度与DNADNA含量并含量并 不完全一致不完全一致 存在大量非编码的间隔序列，基因序列存在大量非编码的间隔序列，基因序列 占整个基因组占整个基因组1010不到不到 51真核生物基因组的最大的特点是出现分真核生物基因组的最大的特点是出现分 隔开的基因隔开的基因 外显子外显子( (exonexon) )：编码氨基酸序列的编码氨基酸序列的DNADNA片段片段 内含子内含子（in
20、tronintron）：不编码氨基酸序列的不编码氨基酸序列的 DNADNA插入片段插入片段外显子外显子1外显子外显子2外显子外显子352真核生物基因组中存在单拷贝序列真核生物基因组中存在单拷贝序列 和低度重复序列、中度重复序列和和低度重复序列、中度重复序列和 高度重复序列高度重复序列 53四、各类四、各类RNARNA的结构的结构 RNARNA的一般特点：的一般特点： 1. RNA1. RNA主要存在于胞浆主要存在于胞浆, ,含量比含量比DNADNA多，多， 分子大小不均分子大小不均一一 2.2.主要有四种核糖核糖核苷酸主要有四种核糖核糖核苷酸A A、G G、C C、U U 通过通过33，55磷
21、酸二酯键连接形成单链多磷酸二酯键连接形成单链多 核苷酸核苷酸 3.3.空间结构主要为单链及局部双螺旋空间结构主要为单链及局部双螺旋 5.5.在局部双螺旋中除在局部双螺旋中除A A与与U U配对、配对、G G与与C C配对外配对外 还存在非标准配对，如还存在非标准配对，如G G与与U U配对配对 54图图3-19RNA局部空间结构局部空间结构(a)在二级结构中的凸出、环、发夹结构在二级结构中的凸出、环、发夹结构（b）发夹结构发夹结构55RNaseP中中M1RNA的二级结构示意图。的二级结构示意图。两个括号是在三级结构中互补的序列两个括号是在三级结构中互补的序列561.tRNA1.tRNA的结构的
22、结构 tRNAtRNA的一级结构的一级结构 tRNAtRNA是单链分子，含是单链分子，含73937393核苷酸，核苷酸，含有含有10%10%的稀有碱基的稀有碱基 33端为端为CCA-OHCCA-OH，55端多为端多为pGpG 分子中大约分子中大约30%30%的碱基是不变的或半不的碱基是不变的或半不变的变的,决定了它们的二级结构都是三叶决定了它们的二级结构都是三叶 草型。草型。 57图图3-20tRNA二级结构（二级结构（a）tRNA三级结构（三级结构（b）58 tRNAtRNA的二级结构的二级结构 1 1）tRNAtRNA二级结构为二级结构为三叶草型三叶草型 59 2 2）四环四臂四环四臂 氨
23、基酸臂氨基酸臂 a. 7a. 7个个bpbp组成组成 b. 3b. 3末端均为末端均为 N NCCAOH3CCAOH3结构结构c. c. 携带氨基酸携带氨基酸60二氢尿嘧啶环（二氢尿嘧啶环（D D环）环） a.a.含有含有两个二氢尿嘧啶两个二氢尿嘧啶（DHUDHU） b.8-14b.8-14个碱基组成个碱基组成 c.c.识别氨基酰识别氨基酰tRNAtRNA合成酶合成酶二氢尿嘧啶臂二氢尿嘧啶臂3-4bp3-4bp61反密码环反密码环 a.7a.7个碱基组成，其中个碱基组成，其中3 3个组成个组成 反密码子反密码子( (anticodonanticodon) )b.b.反密码子与反密码子与mRNA
24、mRNA上相应密码配对上相应密码配对反密码臂有反密码臂有5 5对碱基组成对碱基组成62 T TC C环环 a. a. 个个碱基组成碱基组成 b. b. 含含T TC C序列序列 c. c. 识别识别rRNArRNA中的中的5SrRNA5SrRNA T TC C环臂环臂5 5对碱基组成对碱基组成 额外环额外环 a. a. 由由4 4 2121个个b b之间变动，又称可变环之间变动，又称可变环 b. b. 不同不同tRNAtRNA分子差异较大。分子差异较大。63（3 3）tRNAtRNA的三级结构特点的三级结构特点 1) 1) tRNAtRNA的三级结构呈的三级结构呈 倒倒L L型型64 2) 2
25、) 倒型分子有两支双螺旋区，倒型分子有两支双螺旋区， 一支由氨基酸臂和一支由氨基酸臂和T TC C臂组成臂组成另一支由另一支由DHUDHU臂和反密码臂组成臂和反密码臂组成3) 3) 倒型分子的一端为氨基酸臂的倒型分子的一端为氨基酸臂的 -CCA-OH , -CCA-OH , 另一端为反密码环另一端为反密码环， 便于识别有关分子便于识别有关分子654) T4) TC C环位于倒型的拐角，有利与环位于倒型的拐角，有利与 核糖体核糖体5sRNA5sRNA相互作用相互作用5)5) 碱基在疏水作用下相互堆集，对形成碱基在疏水作用下相互堆集，对形成 tRNAtRNA空间结构有重要意义空间结构有重要意义66
26、2.mRNA.mRNA概述：概述： 1) 1) 占细胞中总的占细胞中总的 2) 2) 分子大小不均一分子大小不均一 3) 3) 有编码序列与非编码序列有编码序列与非编码序列 67.mRNA.mRNA的结构的结构 原核生物原核生物mRNAmRNA的结构特点的结构特点 1)1)原核生物原核生物mRNAmRNA结构简单，为多顺反子结构简单，为多顺反子 2)2)端有翻译起始序列端有翻译起始序列683) 3) 端有与翻译终止有关的非编码序列端有与翻译终止有关的非编码序列4) 4) 有少量的间隔序列有少量的间隔序列5)5)端无帽子结构端无帽子结构 ， 端没有端没有polyApolyA尾巴尾巴69 真核生物
27、真核生物mRNAmRNA结构特点结构特点 1)1)真核生物真核生物mRNAmRNA为单顺反子结构为单顺反子结构 70 2) 2) 端帽子结构端帽子结构 * * 结构结构: : m m7 7G G55pppppp55 NpNp (m(m7 7G G55pppppp55 NmpNpNmpNp , m , m7 7G G55pppppp55 NmpNmpNpNmpNmpNp) ) * * 功能：与蛋白质合成起始有关功能：与蛋白质合成起始有关, , 保护保护mRNAmRNA不被不被RNaseRNase降解。降解。71723) 3) 33末端多聚腺苷酸尾巴结构末端多聚腺苷酸尾巴结构 结构：结构：3 3
28、有有20-25020-250个多聚腺苷酸个多聚腺苷酸 结构（结构（poly Apoly A）。）。 功能：与稳定功能：与稳定mRNAmRNA有关有关73 3.rRNA3.rRNA的结构的结构 rRNArRNA占细胞总占细胞总RNARNA的的80%80%左右左右 rRNArRNA分子为单链，局部有双螺旋区域分子为单链，局部有双螺旋区域 74 原核生物主要的原核生物主要的rRNArRNA有三种，即有三种，即5S5S、16S16S和和 23S 23S rRNArRNA，真核生物则有真核生物则有4 4种，即种，即5S5S、5.8S5.8S、 18S18S和和28S 28S rRNArRNA。 rRNA
29、rRNA与多种核糖体蛋白与多种核糖体蛋白（Ribosomal Ribosomal protein,rPprotein,rP） 装配成核糖体，是装配成核糖体，是蛋白质合成的场所蛋白质合成的场所，75 原核生物：原核生物：23SrRNA、5SrRNA50S大亚基大亚基34种蛋白质种蛋白质核糖体核糖体16SrRNA70S30S小亚基小亚基21种蛋白质种蛋白质真核生物：真核生物：5SRNA、5.8SrRNA、28SrRNA60S大亚基大亚基核糖体核糖体49种种Pro80S18SrRNA40S小亚基小亚基33种种Pro76 原核生物原核生物 小亚基小亚基 上上16S 16S rRNArRNA 3 3端有
30、一端有一 保守序列保守序列ACCUCCUACCUCCU与与mRNA SDmRNA SD序列互补与蛋序列互补与蛋 白质合成起始有关。白质合成起始有关。 原核生物原核生物5S5S与真核生物与真核生物5.8SrRNA 5.8SrRNA 中有中有 CGAACCGAAC的保守序列能识别的保守序列能识别tRNAtRNA中中T T C C环中环中 GTGT CGCG序列序列 。774.4.其他其他RNA分子分子1)细胞核内小分子细胞核内小分子RNA（smallnuclearRNA，snRNA），参与，参与mRNA前体的剪前体的剪接以及成熟的接以及成熟的mRNA由核内向胞浆中转运由核内向胞浆中转运的过程。的过
31、程。2)核仁小分子核仁小分子RNA（smallnucleolarRNA，snoRNA）参与参与rRNA前体的加工以及核前体的加工以及核糖体亚基的装配。糖体亚基的装配。783)胞质小分子胞质小分子RNA（smallcytosolRNA，scRNA）如：如：7SLRNA与蛋白质一起组成信号识别与蛋白质一起组成信号识别 颗粒，参与蛋白质的合成。颗粒，参与蛋白质的合成。 4)4)反义反义RNA（antisenseRNA）能调节基因表达。能调节基因表达。5)5)核酶是具有催化活性的核酶是具有催化活性的RNA分子或分子或RNA片段片段6)6)微微RNA（microRNA，miRNA），长度一般长度一般 为
32、为20-24个核苷酸，在个核苷酸，在mRNA翻译过程中起到翻译过程中起到 开关作用，它与靶开关作用，它与靶mRNA结合，产生转录后结合，产生转录后 基因沉默作用基因沉默作用。79五、五、RNA组组RNA组是研究细胞的全部组是研究细胞的全部RNA基因和基因和RNA的的分子结构与功能。分子结构与功能。RNA组的研究将在探索生组的研究将在探索生命奥秘中做出巨大贡献。命奥秘中做出巨大贡献。80第三节第三节核酸的理化性质核酸的理化性质一、一、核酸的大小及测定核酸的大小及测定1.DNA分子大小分子大小2.测定方法：测定方法：电泳，超速离心法以及测定电泳，超速离心法以及测定DNA序列序列（Sanger的双脱
33、氧的双脱氧DNA链末端合成终止法链末端合成终止法）81_生物生物碱基对碱基对(kb)总长度总长度(1m)形状形状_病毒病毒多瘤病毒多瘤病毒5.11.7环状环状SV405.21.8环状环状M136.41.9环状环状 X1745.41.8环状环状fd6.41.9环状环状P46.41.9线状线状T7351.2线状线状入入48.516线状线状T216655线状线状细菌细菌支原体支原体760260环状环状大肠杆菌大肠杆菌46001560环状环状真核生物真核生物(单倍体单倍体)酵母酵母135004600线状，分布于线状，分布于7个染色体上个染色体上果蝇果蝇137000466000线状，分布于线状，分布于4
34、个染色体上个染色体上人人31600001074000线状，分布于线状，分布于23个染色体上个染色体上南美洲肺鱼南美洲肺鱼10200000034700000线状，分布于线状，分布于19个染色体上个染色体上_表表3-3不同生物不同生物DNA分子大小分子大小82 二、二、 核酸的水解核酸的水解1.化学法化学法1)在很低在很低pH条件下条件下DNA和和RNA都会发生都会发生 磷酸二酯键水解。磷酸二酯键水解。2)在高在高pH时，时，RNA的磷酸酯键易被水解，的磷酸酯键易被水解，而而DNA的磷酸酯键不易被水解。的磷酸酯键不易被水解。832.酶法酶法核酸酶核酸酶(nucleases)包括：包括：核糖核酸酶核
35、糖核酸酶(RNase)脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶(DNase)核酸外切核酸外切酶酶(exonuclease)核酸内切核酸内切酶酶(endonuclease)843ppppOH35限制性内切酶限制性内切酶(restrictionendonuclease)5GAATTC33CTTAAG5EcoRI核酸外切核酸外切酶酶核酸内切核酸内切酶酶85三、核酸的变性、复性与杂交三、核酸的变性、复性与杂交 . .变性变性（denaturation） 1) 1) 定义：定义： 在一定理化因素作用下，核酸双螺旋等空在一定理化因素作用下，核酸双螺旋等空 间结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链间结构中碱基之间的氢键断裂
36、，变成单链 的现象称为变性（的现象称为变性（denaturationdenaturation）。）。 2) 2) 引起核酸变性的常见理化因素有加热、引起核酸变性的常见理化因素有加热、 酸、碱、尿素和甲酰胺等。酸、碱、尿素和甲酰胺等。 86 3)3)增色效应（增色效应（hyperchromichyperchromic effect effect） 核酸变性时核酸变性时双螺旋等高级空间构象被破坏，双螺旋等高级空间构象被破坏，碱碱 基暴露基暴露其其260nm紫外线吸收会大大增加紫外线吸收会大大增加的现象的现象浓度为浓度为50 g/ml双螺旋双螺旋DNA A260DNA A260为为 1.001.00
37、 单链单链DNA A260DNA A260为为 1.371.37 游离核苷酸游离核苷酸 A260A260为为 1.601.60 图图3-24DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱1.天然天然DNA2.变性变性DNA3.核苷酸总吸光度值核苷酸总吸光度值87 4)4)熔解温度熔解温度（melting temperature,Tmmelting temperature,Tm） 概念概念 加热变性时加热变性时DNA溶液溶液A260升高达到最大值升高达到最大值 一半时的温度称为该一半时的温度称为该DNA的熔解温度。的熔解温度。Tm一般在一般在8595 之间之间DNA熔解曲线熔解曲线 88 影响因素影响因素
38、a.DNAa.DNA分子中，分子中，C.GC.G对含量对含量 与与TmTm成正比成正比 C.GC.G对含量增加对含量增加1 1, Tm, Tm增加增加0.40.40 0C C。 b.Tm b.Tm 与与 DNA DNA 溶液中溶液中 的离子强度成正比。的离子强度成正比。 在在0.4mol/L0.4mol/L盐溶液盐溶液 中中DNADNA保存较为稳定。保存较为稳定。 离子强度对离子强度对Tm影响影响89DNA的的Tm值可以根据值可以根据G+C含量计算：含量计算：Tm=69.3+0.41（%GC）2.复性复性(renaturation)1)1)复性的复性的概念概念: : 变性变性DNADNA在适当
39、条件下，可使两条分开的在适当条件下，可使两条分开的 单链重新形成双螺旋单链重新形成双螺旋DNADNA的过程称为复性的过程称为复性。2)2)退火退火（annealingannealing） 当热变性的当热变性的DNADNA经缓慢冷却后复性称为退经缓慢冷却后复性称为退 火。火。 90 2) 2) 影响因素影响因素: : DNA DNA浓度高，复性快浓度高，复性快 DNADNA分子大，分子大，复性慢复性慢 合适的复性温度：合适的复性温度：Tm-25 适当的离子强度：一般在适当的离子强度：一般在0.4mol/L0.4mol/L91图图3-26DNA热变性过程的两种冷却过程示意图热变性过程的两种冷却过程
40、示意图92 3. 3. 杂交杂交（hybridizationhybridization） 1)1)概念概念 具有互补序列的不同来源的单链核酸具有互补序列的不同来源的单链核酸 分子分子, ,按碱基配对原则结合在一起称按碱基配对原则结合在一起称 为杂交为杂交。杂交可发生在杂交可发生在DNA-DNADNA-DNA、 RNA-RNARNA-RNA和和DNA-RNADNA-RNA之间。之间。93942)核酸杂交是分子生物学研究中常用核酸杂交是分子生物学研究中常用的技术之一，用来分析基因组织的的技术之一，用来分析基因组织的结构，定位，表达等。结构，定位，表达等。方法：方法：Southern印迹法印迹法Northern印迹法印迹法95
