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1、实验二实验二 小鼠脾脏淋巴细胞的分离小鼠脾脏淋巴细胞的分离 小鼠脾脏淋巴细胞的分离小鼠脾脏淋巴细胞的分离n目的目的 n原理原理n实验步骤实验步骤n注意事项注意事项2技能教育目的目的n熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMCPBMC）的分离方法）的分离方法3技能教育原原 理理n脾脏各种血细胞的密度不尽相同，脾脏各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作作密度梯度离心密度梯度离心，使一定比重的细胞，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。种血细胞加以分离。 4技能教育原原 理理
2、外周血外周血红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞1.0931.0301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001 (PBMC)1.0925技能教育1500rpm, 20 , 30minPBMC红细胞红细胞粒细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、稀释的血浆、血小板血小板6技能教育实验步骤实验步骤n1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨（研磨同时滴加（研磨同时滴加1640培养液，保持细培养液，保持细胞活性）胞活性） n2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取，细胞混合液静置数分钟后吸管吸
3、取，沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层液上方（液上方（Ficoll：血细胞：血细胞=1：1）7技能教育实验步骤实验步骤n3.2000r/min，离心离心15minn4.沿管壁周缘沿管壁周缘轻轻吸取轻轻吸取淋巴细胞淋巴细胞层移层移入另一试管中入另一试管中8技能教育实验步骤实验步骤n5.加足量稀释液加足量稀释液充分洗涤充分洗涤，1000 r/min离心离心5min ，弃上清，弃上清n6. 适量的培养基重悬细胞适量的培养基重悬细胞 ，计数，计数9技能教育注意事项注意事项n1.在在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面加，以免冲散
4、界面 n2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染多的上清液或分层液而导致血小板污染10技能教育细胞计数细胞计数n实验步骤实验步骤n注意事项注意事项11技能教育实验步骤实验步骤n1、准备计数板、准备计数板：n2、制制备备细细胞胞悬悬液液：收收集集细细胞胞，制制成成单单个个细细胞胞悬液悬液n3、加加样样：用用吸吸管管轻轻轻轻吹吹打打细细胞胞悬悬液液，取取少少许许细细胞胞悬悬液液，在在计计数数板板上上盖盖玻玻片片的的一一侧侧加加微微量量细细胞悬液，胞悬液，n4、计计数数：在在显显微微镜镜下下，用用10物物镜镜观观察察计计数数板板四角大方
5、格中的细胞数四角大方格中的细胞数 12技能教育13技能教育实验步骤n5、计算计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数细胞数/毫升原液毫升原液 =（4大格细胞数之和大格细胞数之和/4）10414技能教育注意事项n1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液取样计数前，应充分混匀细胞悬液 n2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡气泡n3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 n4.本法要求细胞密度不低于本法要求细胞密度不低于104细胞细胞/mln5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数释不当，需重新制备细胞悬液、计数15技能教育试验报告要求n原理原理,n步骤步骤,n结果结果,n讨论。讨论。16技能教育
