《PCR技术侯云鹏》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR技术侯云鹏（98页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 PCR技术技术 侯云鹏侯云鹏 2013.11.101.PCR概述概述2.PCR反应的原理和步骤反应的原理和步骤3.PCR的反应动力学的反应动力学4.PCR反应体系的主要成分和作用反应体系的主要成分和作用5.PCR的反应条件控制的反应条件控制6.PCR反应的特点反应的特点7.防止防止PCR错误扩增的措施错误扩增的措施8.PCR常见问题及解决办法常见问题及解决办法9.常规常规PCR技术及几类技术及几类PCR新技术新技术一、聚合酶链式反应（一、聚合酶链式反应（PCR）概述）概述（一）概念（一）概念 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain (Polymerase Chain
2、ReacitonReaciton, PCR), PCR)，即，即PCRPCR技术，是近年来发技术，是近年来发展起来的一种在体外快速扩增特定基因或展起来的一种在体外快速扩增特定基因或DNADNA序列的方法。序列的方法。 （二）发展历程（二）发展历程19711971年年 KjellKjell KleppeKleppe提出提出PCRPCR原始雏形原始雏形 概念概念19831983年年 KaryKary Mullis Mullis发明发明PCRPCR技术技术19871987年年 获得专利获得专利19931993年年 诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖 PCRPCR技术的技术的基本原理基本原理类似于类似于DNAD
3、NA的天然复制的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。核苷酸引物。 PCRPCR由由变性变性-退火退火-延伸延伸三个基本反应步骤三个基本反应步骤构成：构成：二、二、PCR反应的原理和步骤反应的原理和步骤 1 1、模板模板DNADNA的变性的变性：模板：模板DNADNA经加热至经加热至9 93 3左右一定时间后，使模板左右一定时间后，使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩扩增形成的双链增形成的双链DNADNA解离，使之成为单链，以解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2
4、2、模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：模板：模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降至经加热变性成单链后，温度降至5555左右，左右，引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；3 3、引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板新的与模板DNA DNA 链互补的半保留复制链。链互补的半保留复
5、制链。 重复循环变性重复循环变性-退火退火-延伸三过程，就可获延伸三过程，就可获得更多的得更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 24 4分分钟，钟，2 23 3小时就能将待扩目的片段富集小时就能将待扩目的片段富集10106 610109 9倍。倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 变性（94度）引物退火（55度）延伸（72度）DNA聚合酶dNTP变性退火引物经经2530次循环，次循环，目的目的DNA增加增加106-9PCRPCR反应过程反应过程示意
6、图示意图Y = Y0 * (1+X)nY:Y:扩增拷贝数量扩增拷贝数量Y Y0:0:起始模板数量起始模板数量X X：扩增效率扩增效率n:n:扩增循环数扩增循环数 PCR 理论方程理论方程三、三、PCR的反应动力学的反应动力学 PCRPCR的三个反应步骤反复进行，使的三个反应步骤反复进行，使DNADNA扩增量扩增量呈指数上升。呈指数上升。平均扩增效率平均扩增效率的理论值为的理论值为100%100%，但，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列靶序列DNADNA片段的增加呈指数形式，随着片段的增加呈指数形式，随着PCRPCR产物产物的逐渐积累
7、，被扩增的的逐渐积累，被扩增的DNADNA片段不再呈指数增加，片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应停滞效应”，这种效应称，这种效应称平台期平台期。四、四、PCR反应体系的主要成分和作用反应体系的主要成分和作用lDNADNA聚合酶聚合酶l模板模板l引物引物ldNTPdNTPl缓冲体系缓冲体系（一）（一）DNADNA聚合酶聚合酶 TaqTaq DNA DNA聚合聚合酶来酶来源于嗜热水生菌的源于嗜热水生菌的重组体，重组体，与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活性。性。 可分为两大类：可分为两大类：
8、 1 1、具有校正功能的（有、具有校正功能的（有3535核酸酶活性）核酸酶活性） 比如：比如：Vent,pfu,pwoVent,pfu,pwo等等 2 2、不具有校正功能的、不具有校正功能的 （无（无3 53 5核酸酶活性）核酸酶活性） 比如：一般的比如：一般的TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶（二）二）模板模板 核酸模板的核酸模板的量与纯化程度，是量与纯化程度，是PCRPCR成败与否成败与否的关键环节之一，传统的的关键环节之一，传统的DNADNA纯化方法通常采用纯化方法通常采用SDSSDS和蛋白酶和蛋白酶K K来消化处理标本来消化处理标本。一。一般临床检测标般临床检测标本，可采用快速简
9、便的方法溶解细胞，裂解病原本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于接用于PCRPCR扩增。扩增。RNARNA模板提取一般采用异硫氰酸模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶胍或蛋白酶K K法，要防止法，要防止RNaseRNase降解降解RNARNA。 （三）引物（三）引物 引引物是物是PCRPCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCRPCR产产物的特物的特异性取决于引物与模板异性取决于引物与模板DNADNA互补的程度。理论上，互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板只要知道任何一段模板DNADNA序列序列
10、，就，就能按其设计互能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用补的寡核苷酸链做引物，利用PCRPCR就可将模板就可将模板DNADNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则： 1 1、引物长度一般、引物长度一般15-3015-30个个bpbp，常用为，常用为20bp20bp左右。引左右。引物过短过长都会使特异性降低。物过短过长都会使特异性降低。 2 2、引物扩增跨度以、引物扩增跨度以200-500bp200-500bp为宜，特定条件下可为宜，特定条件下可扩增长至扩增长至10kb10kb的片段。的片段。 3 3、引物碱基、引物碱基G+CG+C含量以含量以40-
11、60%40-60%为宜，为宜，G+CG+C太少扩增效太少扩增效果不佳，果不佳，G+CG+C过多易出现非特异条带。碱基随机分过多易出现非特异条带。碱基随机分布，避免布，避免5 5个个以上的相同核苷酸的成串排列。以上的相同核苷酸的成串排列。 4 4、避免引物内部出现、避免引物内部出现二级结构二级结构，避免两条引物间互，避免两条引物间互补，特别是补，特别是33端的互补端的互补，否则会形成引物二聚体，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。产生非特异的扩增条带。 5 5、引物、引物33端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应基，应严格要求配对严格要求配对，以避免因
12、末端碱基不配对，以避免因末端碱基不配对而导致而导致PCRPCR失败。失败。 6 6、引物中有或能加上、引物中有或能加上合适的酶切位点合适的酶切位点，被扩增的，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。分子克隆很有好处。 7 7、引物应与核酸序列数据库的其它序列、引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同无明显同源性源性。引物量引物量以最低引物量产生所需要的结果为以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。且可增加引物之间形成二
13、聚体的机会。 （四）（四）dNTPdNTP的质量与浓度的质量与浓度 dNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCRPCR扩增效率有密切关扩增效率有密切关系。在系。在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200umol/L200umol/L，尤其是注意尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等的浓度要相等( (等摩尔配制等摩尔配制) )，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，如其中任何一种浓度不同于其它几种时( (偏高偏高或偏低或偏低) )，就会引起错配。浓度过低又会降低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCRPCR产物的产量。产物的产量。（五）五）PCRPCR反应缓
14、冲液反应缓冲液组成：组成：50mM 50mM KClKCl 10mM 10mM Tris.ClTris.Cl (pH 8.4) (pH 8.4) 1.5mM MgCl2 1.5mM MgCl2 Mg2+ Mg2+是是TaqTaq酶活性所必需的金属离子酶活性所必需的金属离子。dNTPdNTP能与能与Mg2+Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+Mg2+浓度降低。浓度降低。Mg2+Mg2+浓浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低度过低会降低TaqTaq DNA DNA聚合酶的活性，使反应产聚合酶的活性，使反应产物减少。物减少。（六）
15、六）PCRPCR反应标准体系反应标准体系五、五、PCR的反应条件的反应条件控制控制（一）（一）PCRPCR反应的温度反应的温度和和时间时间控制控制 1 1、变性温度与时间、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全变性温度低，解链不完全是导致是导致PCRPCR失败的失败的最主要原因。一般情况下，最主要原因。一般情况下，939394lmin94lmin足以足以使模板使模板DNADNA变性，若低于变性，若低于9393则需延长时间，但则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或。此步若不能使靶基因模板或PCRPCR产物完全
16、变性，产物完全变性，就会导致就会导致PCRPCR失败。失败。 2 2、退火退火( (复性复性) )温度与时间温度与时间 退退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度成及其浓度，还有靶基序列的长度。引。引物的复性温物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：度可通过以下公式帮助选择合适的温度： TmTm值值( (解链温度解链温度)=4(G+C)=4(G+C)2(A+T)2(A+T) 复复性温度性温度=Tm=Tm值值-(5-(510)10) 在在TmTm值允许范围内值允许范围内，选，选择较高的复性温度可大择较高的复性温度可大大减少
17、引物和模板间的非特异性结合大减少引物和模板间的非特异性结合，提，提高高PCRPCR反应反应的特异性。复性时间一般为的特异性。复性时间一般为303060sec60sec，足以使引物，足以使引物与模板之间完全结合。与模板之间完全结合。 3 3、延伸温度与时间：、延伸温度与时间： PCRPCR反应的延伸温度一般选择在反应的延伸温度一般选择在70707575之之间，常用温度为间，常用温度为7272，过高的延伸温度不利于引，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。物和模板的结合。 PCRPCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般长度而定，一般1Kb1Kb以内的
18、以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min是足够的。是足够的。3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min；扩；扩增增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15min。延伸进间过长会导致非。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。伸时间要稍长些。（二二） PCR PCR反应的反应的循环次数控制循环次数控制 循环次数决定循环次数决定PCRPCR扩增程度。扩增程度。PCRPCR循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度。一般的循环次数的浓度。一般的循环次数选在
19、选在30304040次之间，循环次数越多，非特异性次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。产物的量亦随之增多。六、六、PCR反应反应的特点的特点 1 1、特异性强、特异性强 PCRPCR反应的特异性决定因素为引物与模板反应的特异性决定因素为引物与模板DNADNA特异正确的特异正确的结合、碱基配对原则、结合、碱基配对原则、TqDNATqDNA聚合酶合成反应的正确度、靶基聚合酶合成反应的正确度、靶基因的特异性与保守性。因的特异性与保守性。 2 2、灵敏度高、灵敏度高 PCRPCR产物的生成量是以指数方式增加的。产物的生成量是以指数方式增加的。 3 3、简便快速、简便快速 PCRPCR反应
20、用耐高温的反应用耐高温的TaqTaq DNA DNA聚合酶，一次性地将反应液聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在加好后，即在DNADNA扩增液和水浴锅上进行变性、退火、延伸反扩增液和水浴锅上进行变性、退火、延伸反应，一般在应，一般在2 24h4h完成扩增反应。完成扩增反应。 4 4、对标本的纯度要求低、对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNADNA粗制品及总粗制品及总DNADNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的
21、DNADNA扩增检测。扩增检测。1 1、隔离操作、戴不受污染的手套、隔离操作、戴不受污染的手套2 2、试剂的配制、分装和保存、试剂的配制、分装和保存3 3、开盖前先离心，小心开盖和上盖。、开盖前先离心，小心开盖和上盖。4 4、加样时最后加模板、加样时最后加模板DNADNA5 5、设立对照实验、设立对照实验6 6、注意其他操作过程中可能造成的污染、注意其他操作过程中可能造成的污染七、七、防止防止PCR错误扩增的措施错误扩增的措施八、八、PCR常见问题常见问题及解决办法及解决办法 （一）（一）扩增不出特异性带扩增不出特异性带 1 1、原因、原因 （1 1）引物设计引物设计有问题（引物位置错误，引物
22、之间有问题（引物位置错误，引物之间太强的相互作用）太强的相互作用） （2 2）反应体系反应体系有问题有问题 （3 3）退火温度退火温度太高太高 2 2、解决办法、解决办法 （1 1）确认）确认引物正确性引物正确性 （2 2）用保证能扩增出来的引物）用保证能扩增出来的引物验证反应体系验证反应体系 （3 3）采用）采用梯度梯度PCRPCR功能，寻找最适合的退火温度功能，寻找最适合的退火温度 （二二）扩增带很弱扩增带很弱 1 1、原因、原因 （1 1）反应体系）反应体系效率低效率低 （2 2）退火温度退火温度太高太高 （3 3）很多）很多非特异性非特异性扩增扩增 （4 4）大量）大量引物二聚物引物二
23、聚物的形成的形成 2 2、解决办法、解决办法 （1 1）用已）用已确认的引物确认的引物验证验证 （2 2）采用）采用梯度梯度PCRPCR功能寻最适的退火温度功能寻最适的退火温度 （3 3）采用）采用定量定量PCRPCR的熔点曲线功能分析，提高退火的熔点曲线功能分析，提高退火温度，改变反应体系的温度，改变反应体系的PHPH值值 （三三）非特异性扩增带很多非特异性扩增带很多 1 1、原因、原因 （1 1）退火温度退火温度太低太低 （2 2）反应体系反应体系有问题有问题 2 2、解决办法、解决办法 （1 1）采用）采用梯度梯度PCRPCR功能寻找最佳反应温度功能寻找最佳反应温度 （2 2）更换）更换
24、反应体系反应体系 （四四）引物二聚物太多引物二聚物太多 1 1、原因、原因 （1 1）引物设计引物设计有问题有问题 （2 2）反应体系反应体系有问题有问题 （3 3）退火温度退火温度太低太低 2 2、解决办法、解决办法 （1 1）重新设计重新设计引物引物 （2 2）调整和更换调整和更换反应体系反应体系 （3 3）用）用梯度梯度PCRPCR寻找最佳的退火温度寻找最佳的退火温度 （五五）结果的重现性差结果的重现性差 1 1、原因、原因 反应体系发生了反应体系发生了变化变化 2 2、解决办法、解决办法 用用荧光定量荧光定量PCRPCR仪熔点曲线功能分析仪熔点曲线功能分析PCRPCR的结果，的结果，看
25、看非特异性产物非特异性产物和和引物二聚物引物二聚物 九、九、常规常规PCR技术及几类技术及几类PCR新新技术技术温度梯度温度梯度PCR PCR 不对称不对称PCRPCR热启动热启动PCR PCR 原位原位PCRPCRTouch-down PCR Touch-down PCR 连接酶链反应连接酶链反应RT-PCR RT-PCR RACE-PCRRACE-PCR荧光定量荧光定量PCR PCR AFLPAFLP兼并引物兼并引物PCRPCR 巢氏巢氏PCPC免疫免疫-PCR(immuno-PCR-PCR(immuno-PCR) ) 反向反向PCRPCRMSPMSP甲基化特异甲基化特异 PCR PCR（
26、一）温度梯度（一）温度梯度PCRPCR 1 1、概念：、概念： 通过对复性温度比引物的通过对复性温度比引物的TmTm值低值低2-2-1010的范围内进行系列的范围内进行系列PCRPCR预实验来对预实验来对复性条件进行优化复性条件进行优化. . 温度梯度PCR温度梯度曲线温度梯度曲线Thermal Image of 45-65C Gradientacross a PTC-200 with a 96-well Alpha温度梯度PCR优化复性温度 48C68CUnoptimized Annealing temperature 50COptimizedAnnealing Temperature 62
27、.6CGradient optimization of 12 different temperatures across the block, tested between 48C and 68C （二）热启动（二）热启动PCRPCR 热启动热启动PCRPCR是除了好的引物设计之外，提高是除了好的引物设计之外，提高PCRPCR特异性最重要的方法之一。尽管特异性最重要的方法之一。尽管TaqTaq DNA DNA聚合酶的聚合酶的最佳延伸温度在最佳延伸温度在7272，聚合酶，聚合酶在室温仍然有活性在室温仍然有活性。因此，在因此，在PCRPCR反应试剂配制过程中，以及在热循环反应试剂配制过程中，以及在
28、热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。扩增。限制限制TaqTaq DNA DNA聚合酶活性的常用方法是在聚合酶活性的常用方法是在冰上冰上配制配制PCRPCR反应液反应液，并将其置于，并将其置于预热的预热的PCRPCR仪仪。这种方。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。不能完全消除非特异性产物的扩增。手动热启动法手动热启动法管底：管底：DNADNA、预冷预冷bu
29、fferbuffer、dNTPdNTP和和dHdH2 2O O 管壁：引物管壁：引物预热：预热：8080加加TaqTaq酶，离心，开始酶，离心，开始PCRPCR循环。循环。专用热启动酶法专用热启动酶法抗体介导的抑制抗体介导的抑制DNADNA聚合酶法聚合酶法化学阻断化学阻断DNADNA聚合酶法聚合酶法其他其他DNADNA聚合酶抑制剂法聚合酶抑制剂法 （三）（三）Touch-down PCRTouch-down PCR1 1、概念：、概念： Touch-down PCRTouch-down PCR又称降落又称降落PCRPCR。即选定一个即选定一个温度范围，如温度范围，如50-3550-35，每降，
30、每降1-21-2进行进行1-21-2个循个循环，然后在环，然后在5050度下进行度下进行1515个循环。个循环。2 2、原理：、原理： 随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。特异性条带优先被扩增。3 3、选择初始复性温度的原则：、选择初始复性温度的原则： 起始复性温度应该比引物的起始复性温度应该比引物的TmTm值高出值高出5-105-10度，然后每个循环递减度，然后每个
31、循环递减1-21-2度。度。4 4、Touch-down PCRTouch-down PCR的应用范围的应用范围模板模板DNADNA浓度较低浓度较低; ; 引物简并程度高或特异性低引物简并程度高或特异性低; ; RT-PCR RT-PCR时使用时使用oligo-dToligo-dT。（四）（四）RT-PCRRT-PCR1 1、概念：、概念： RNARNA的多聚酶反应（的多聚酶反应（RT-PCRRT-PCR）是以是以RNARNA为模板，为模板，联合逆转录反应（联合逆转录反应（reverse transcriptionreverse transcription，RTRT）与与PCRPCR，可用于检
32、测单个细胞或少数细胞中少于可用于检测单个细胞或少数细胞中少于1010个拷贝的个拷贝的RNARNA模板。模板。2 2、RNARNA扩增包括两个步骤：扩增包括两个步骤：（1 1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成成RNARNA的的互补互补cDNAcDNA（2 2）加热后）加热后cDNAcDNA与与RNARNA链解离，然后与另一引物退链解离，然后与另一引物退火，并由火，并由DNADNA聚合酶催化引物延伸生成聚合酶催化引物延伸生成双链靶双链靶DNADNA，最后扩增靶最后扩增靶DNADNADouble strand cDNAAAAAATTTTTRTAAAAA
33、TTTTTRTRTAAAAATTTTTOligo dT primer is bound to mRNAReverse transcriptase (RT) copies first cDNA strandReverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNART-PCRA. Double strand DNAB. Denature9650C. Anneal primers50D. Polymerase binds72TaqTaqRT-PCR3 3、cDNAcDNA第二链的合成方法有以下两
34、种第二链的合成方法有以下两种: : （1 1）自身引导法自身引导法 合成的单链合成的单链cDNAcDNA 3 3端能够形成一短的端能够形成一短的发夹结发夹结构构, ,这就为第二链的合成提供了现成的引物这就为第二链的合成提供了现成的引物, ,当第一当第一链合成反应产物的链合成反应产物的DNA-RNADNA-RNA杂交链变性后，利用大杂交链变性后，利用大肠杆菌肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 KlenowKlenow片段或反转录酶片段或反转录酶合成合成cDNAcDNA第二链第二链, ,最后用对单链特异性的最后用对单链特异性的S1S1核酸酶核酸酶消化消化该环该环, ,即可进一步克隆。但自身引导合成法较
35、难控即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用制反应，而且用S1S1核酸酶切割发夹结构时无一例外核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于地将导致对应于mRNA 5mRNA 5端序列出现缺失和重排端序列出现缺失和重排, ,因因而该方法目前很少使用。而该方法目前很少使用。 (2) (2) 置换合成法置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNAcDNA-mRNA-mRNA杂交链不经变性杂交链不经变性, ,而是而是dNTPdNTP存在下存在下, ,利用利用RNARNA酶酶H H在杂交链的在杂交链的mRNAmRNA链上造成切口和缺口。从而链
36、上造成切口和缺口。从而产生一系列产生一系列RNARNA引物引物, ,使之成为合成第二链的引物使之成为合成第二链的引物, ,在大肠杆菌在大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的作用下合成第二链。的作用下合成第二链。 该反应有该反应有3 3个主要优点个主要优点: : 非常有效非常有效; ; 直接利用直接利用mRNAmRNA链链, ,无须进一步处理和纯化无须进一步处理和纯化; ; 不必使用不必使用S1S1核酸酶核酸酶来切割双链来切割双链cDNAcDNA中的单链发夹中的单链发夹环。环。4 4、RT-PCRRT-PCR特殊条件特殊条件（1 1）模板：）模板： 作为模板的作为模板的RNARNA分子必须是分子必须
37、是完整完整的，并且的，并且不含不含DNADNA、蛋白质和其他杂质。蛋白质和其他杂质。RNARNA中即使含有最微量中即使含有最微量的的DNADNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白若经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白若未除干净，与未除干净，与RNARNA结合后会影响逆转录和结合后会影响逆转录和PCRPCR；残残留的留的RNaseRNase极易将模板极易将模板RNARNA降解掉。降解掉。（2 2）引物：）引物：上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的3 3端和下一个外显子的端和下一个外显子的5 5端，这样不会在基端，这样不会在基因组上扩出来。因组上扩出来。设计
38、在两个离得远的外显子上，这样从基因组设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和和cDNAcDNA上得到的片段长度不一样，可以一物两上得到的片段长度不一样，可以一物两用。用。5 5、RT-PCRRT-PCR方法：一步法和两步法方法：一步法和两步法（1 1）一步法：）一步法： 在同一缓冲液体系中加入逆转录酶、引物、在同一缓冲液体系中加入逆转录酶、引物、TaqTaq酶、酶、4 4种种dNTPdNTP直接进行直接进行mRNAmRNA反转录与反转录与PCRPCR扩增。另外扩增。另外TaqTaq酶不酶不仅具有仅具有DNADNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用
39、其双重作用在同一体系中直接以利用其双重作用在同一体系中直接以mRNAmRNA为模板进行为模板进行反转录和其后反转录和其后PCRPCR扩增，从而使扩增，从而使mRNAmRNA的的PCRPCR步骤更为简步骤更为简化。化。 特点：特点：所需所需样品量少样品量少，可检测出总，可检测出总RNARNA中小于中小于1ng1ng的低丰度的低丰度mRNAmRNA。可用于临床小样品的检测、低丰度。可用于临床小样品的检测、低丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA文库的构建及特异文库的构建及特异cDNAcDNA的克隆，并有可能的克隆，并有可能与与TaqTaq酶的测序技术相组合。酶的测序技术相组合。（2 2）两步法：
40、）两步法： 由于单管反应时由于单管反应时RTRT和和PCRPCR都不能在都不能在最佳条件最佳条件下进行并且容易下进行并且容易相互干扰相互干扰，常只适宜用基因特异，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因及定量引物扩增较短的基因及定量PCRPCR，两步法则是将，两步法则是将RTRT和和PCRPCR分别进行。分别进行。 特点：特点：两步法使得两个反应分开，能够充分两步法使得两个反应分开，能够充分发挥各自的特点，更为发挥各自的特点，更为灵活灵活而且而且严谨严谨，适合那些，适合那些GCGC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的以及多个基因的RT-PC
41、RRT-PCR。RT-PCRRT-PCR中的一步法和两步法比较中的一步法和两步法比较 一步法一步法 两两步法步法n引物：引物：Gene-specific Gene-specific Oligo(dTOligo(dT) ) Random Random hexamershexamers Gene-specific Gene-specificn优点：优点：方便，不易污染方便，不易污染 灵活性灵活性n应用：应用：大量样本分析大量样本分析 GCGC含量、二级结构严重含量、二级结构严重 低丰度低丰度mRNAmRNA的的RT-PCR RT-PCR 的模板或者是未知模的模板或者是未知模 实时定量实时定量RT-
42、PCR RT-PCR 板，以及多个基因的板，以及多个基因的 RT-PCR RT-PCR。 （五）荧光定量（五）荧光定量PCRPCR 1 1、概念：、概念： 在在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个光信号积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通过进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。C CT T扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。CtCt值的定义值的定义Ct起始起始DNADNA拷贝数拷贝数C CT T值与起始值与起始
43、DNADNA拷贝数的关系拷贝数的关系Ct = -k logX0 + b阈值阈值 = = 基线（背景）信号基线（背景）信号均值基线（背景）信号均值基线（背景）信号标准偏差标准偏差 x 10x 10基线的范围：基线的范围：从第从第3 3个循环起到指数增长个循环起到指数增长开始前开始前3 3个循环止。个循环止。一般取一般取3-153-15循环。循环。 基线和阈值的确定基线和阈值的确定基线阈值标准偏差3个循环2 2、荧光、荧光PCRPCR的方法的方法（1 1）插入染料法）插入染料法（2 2）杂交探针法）杂交探针法TaqManTaqMan 探针探针分子信标探针（分子信标探针（Molecular Mole
44、cular BeaconsBeacons）FRETFRET探针探针 5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353插入染料方法的原理插入染料方法的原理插入染料TaqIDl延延 伸伸53535353检测激发的荧光检测激发的荧光535355TaqTaq353TaqTaq55 退退 火火IDIDIDIDIDIDIDIDIDIDlllllnSYBR GreenSYBR Greenn激发波长激发波长495nm495nm，检测波长检测波长520nm520nm。nSYBRGreenSYBRGreen染料插入双链染料插入双链DNAD
45、NA，检测灵敏度提高检测灵敏度提高200200倍。倍。n相对杂交探针方法，插入染料相对杂交探针方法，插入染料法相对法相对较便宜较便宜。n和杂交探针方法相比，插入染和杂交探针方法相比，插入染料法料法特异性低特异性低 。最常用的插入染料最常用的插入染料TaqMan探针探针5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应体系反应体系变变 性性535353535353Taql53RQProbe53RQ535353RQ退退 火火531. 1. 链取代链取代Taq3QR5533QTaqR52. 2. 水水 解解3. 3. 聚聚 合合53QTaqR354. 4. 检测荧光检测荧
46、光533QTaqR5lTaqManTaqMan探针的设计原则探针的设计原则nT Tm m大于引物大于引物T Tm m1010n55末端不能是末端不能是G G5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应组分反应组分分子信标分子信标(Molecular Beacons)变变 性性535353535353Taq53RQRQMolecularBeacon5353531. 1. 链替换链替换Taq52. 2. 聚合完成聚合完成l53RQ退退 火火53RQ5335TaqR QMolecularBeaconFRET 探针探针5353l3DR5退退 火火53链替换链替换, ,
47、荧光熄灭荧光熄灭5335Taq3DR1-5 basesDRTaq5R5Texas Red, ROXTexas Red, ROXCY3.5, Redmond RedCY3.5, Redmond Red常用的荧光基团常用的荧光基团FAMFAMTET, VICTET, VICCY5CY5CY5.5, LC705CY5.5, LC705LC640LC640HEXHEXJOEJOECY3CY3TAMRATAMRA Absorbance (nm) Emission (nm) 552 570 643 667 494 525 535 556 521 520 536 548 565 580 583 60353F
48、QTubulin53HQGapdH53TXQb b-actin53Cy5QCyclophilin多色荧光检测技术多色荧光检测技术 同时检测同时检测4 4色色荧光荧光3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的应用的应用n相对定量相对定量：基因在不同组织中的表达差基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核异、药物疗效考核n绝对定量绝对定量：基因表达研究、病原体检测、基因表达研究、病原体检测、转基因食品检测转基因食品检测相对定量相对定量 参考基因：参考基因：Actin, GAPDH, 18sRNA靶基因靶基因AGAPDHCt对照组对照组25.219.55.7实验组实验组22.120.81.31 1计算计
49、算CtCt：Ct=Ct Ct=Ct 靶基因靶基因Ct GAPDHCt GAPDH，分别计算实验组和对照组的分别计算实验组和对照组的CtCt。2 2计算计算CtCt：Ct=CtCt=Ct实验组实验组CtCt对照组，本例中对照组，本例中Ct= Ct= 4.44.4。3 3计算相对表达量的差值。计算相对表达量的差值。2 2 CtCt 绝对定量绝对定量构建标准曲线：构建标准曲线：A A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。B B、利用纯化的扩增产物制备利用纯化的扩增产物制备 C C、克隆有扩增产物的质粒克隆有扩增产物的质粒 标准品的选择：标准品的选择
50、：标准标准品可以从厂家购买，也可以自己制备品可以从厂家购买，也可以自己制备标准标准品的单位，取决于对最终结果的要求：拷贝数，品的单位，取决于对最终结果的要求：拷贝数，% %，n ng/uLg/uL, mol/, mol/uLuL（如：如果要得出的是样品中的如：如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的DNADNA）n荧光强度的校正荧光强度的校正影响影响荧光信号强度的因素包括：荧光信号强度的因素包括：光源强度、管盖透光性能缓冲液用量、反应体积、PCR反应强度等等以扩增前的荧光探针本底信号为依据，荧光强度归一以扩增前的荧光探针本底信号为依据，荧光
51、强度归一化校正。化校正。内参照荧光内参照荧光RoxRox校正。校正。nPCRPCR扩增效率的校正扩增效率的校正利用多色荧光检测技术对内标荧光的检测可校正利用多色荧光检测技术对内标荧光的检测可校正PCRPCR扩扩增效率误差。增效率误差。实验误差校正技术实验误差校正技术准确定量准确定量 （六）兼并引物（六）兼并引物PCRPCR（Degenerate PrimerDegenerate Primer）1、密码子的兼并性、密码子的兼并性氨基酸密码子数氨基酸密码子数、 2 2、概念、概念 兼并引物是指代表编码兼并引物是指代表编码单个氨基酸单个氨基酸所有不所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越同碱基
52、可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物兼并性小的氨基酸，并避免引物3 3末端兼并，末端兼并，因为因为33端最后端最后3 3个碱基的退火足以在错误位点个碱基的退火足以在错误位点起始起始PCRPCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。降低引物的退火温度。（七）巢氏（七）巢氏PCRPCR（Nested PCRNested PCR） 巢氏巢氏PCRPCR需要两到三对引物，一般采用第一套引需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增物扩增15-3015-30个
53、循环，再用扩增个循环，再用扩增DNADNA片段内设定的第片段内设定的第二套引物扩增二套引物扩增15-3015-30个循环，这样可使待扩增序列得个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。套式引物到高效扩增，而次级结构却很少扩增。套式引物PCRPCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。提高了扩增效率。 若将套失若将套失PCRPCR的内外引物稍加改变，延长外引物的内外引物稍加改变，延长外引物长度（长度（25-30bp25-30bp），），同时缩短内引物长度（同时缩短内引物长度（15-15-17bp17bp），
54、），使外引物先在高退火温度下复性，做双温使外引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成，增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。这样就可以使两套引物一次同时加入。（八）反向（八）反向PCRPCR（Inverse PCRInverse PCR）1 1、概念、概念 反向反向PCRPCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNADNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在也就是说这一反应体系不是在一对引物之间
55、而是在引物外侧合成引物外侧合成DNADNA。反向反向PCRPCR可用于研究与已知可用于研究与已知DNADNA区区段相连接的未知染色体序列，因此又称为段相连接的未知染色体序列，因此又称为染色体步移染色体步移。这时选择的引物虽然与核心这时选择的引物虽然与核心DNADNA两末端序列互补，但两末端序列互补，但引物引物3 3端是相互反向的。端是相互反向的。2 2、反向、反向PCRPCR的操作流程：的操作流程： 扩增前先用限制性内切酶扩增前先用限制性内切酶酶切样品酶切样品DNADNA，然后用然后用DNADNA连接酶连接成一个连接酶连接成一个环状分子环状分子，通过，通过反向反向PCRPCR扩增引扩增引物的上
56、游片段和下游片段。物的上游片段和下游片段。 Inverse PCR限制酶切点（限制酶切点（X）限制酶切点（限制酶切点（X）已知序列已知序列限制酶限制酶X酶切酶切连接连接引物引物2引物引物1PCR（九）不对称（九）不对称PCRPCR（Asymmetric PCRAsymmetric PCR） 1 1、不对称不对称PCRPCR的基本原理：的基本原理： 采用不等量的引物产生大量的单链采用不等量的引物产生大量的单链DNADNA（ssss- -DNADNA）。）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为性引物；其最佳比例一般为1:50-1:1001
57、:50-1:100，关键是关键是限制引物的绝对量限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不。限制性引物太多太少，均不利于利于ssss-DNA-DNA。2 2、不对称、不对称PCRPCR反应过程：反应过程： 一般来说，在不对称一般来说，在不对称PCRPCR反应中，在开始的反应中，在开始的20-2520-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链出双链DNADNA，当限量的那个引物耗光后，随后的当限量的那个引物耗光后，随后的5-5-1010个循环就产生出个循环就产生出ssDNAssDNA。产生的。产生的dsds-DNA-DNA与与ssss-DNA-DNA
58、由于分子量不同，可以通过电泳分离。由于分子量不同，可以通过电泳分离。3 3、ssDNAssDNA产物量：产物量： 一般对一般对100l PCR100l PCR反应体系而言，当引物比反应体系而言，当引物比率为率为50pmol:0.5pmol50pmol:0.5pmol，经过经过3030个循环后，大约可个循环后，大约可产生产生1-3pmol1-3pmol的的ssDNAssDNA。ssDNAssDNA的产量可用下列几的产量可用下列几种方法来估计种方法来估计: :a)a)在在ssss-DNA-DNA合成过程中，掺入合成过程中，掺入32P-dNTP32P-dNTP。取取10%10%的反应产物，经过琼脂糖
59、电泳分离后，放射自显的反应产物，经过琼脂糖电泳分离后，放射自显影。影。b)b)取取5%5%的反应物来走胶，转移到膜上，并用与的反应物来走胶，转移到膜上，并用与ssDNAssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。互补的寡核苷酸为探针杂交。4 4、解决不对称、解决不对称PCRPCR反应扩增效率低的方法：反应扩增效率低的方法：增加增加PCRPCR循环的次数循环的次数在最后五个循环中多加在最后五个循环中多加TaqTaq聚合酶聚合酶(2U)(2U)试一下相反的不对称引物比率。有时相反的不试一下相反的不对称引物比率。有时相反的不对称引物比率可能给出不同产量的对称引物比率可能给出不同产量的ssDNAssDNA。（
60、十）原位（十）原位PCRPCR1 1、概念：、概念： 原位原位PCRPCR就是在组织细胞里进行就是在组织细胞里进行PCRPCR反应，它结合反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCRPCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。一项有较大潜力的新技术。2 2、特点、特点 原位原位PCRPCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和
61、临床过程及病理的转归有重大的究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值，其特异性和敏感性高于一般的实用价值，其特异性和敏感性高于一般的PCR.PCR. 3 3、基本方法：、基本方法： 固定组织或细胞固定组织或细胞: :将组织细胞固定于预先用四氟将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。去细胞内源性过氧化物酶。 蛋白酶蛋白酶K K消化处理消化处理: :用用60ug/ml60ug/ml的蛋白酶的蛋白酶K K将固定好将固定好的组织细胞片的组织细胞片5555消化处理消化处理2h2h后，后，962
62、min962min以灭活以灭活蛋白酶蛋白酶K K。 PCRPCR扩增扩增: :在组织细胞片上，加在组织细胞片上，加PCRPCR反应液，覆盖反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行行PCRPCR循环扩增。循环扩增。 杂交杂交: :PCRPCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。行原位杂交。 显微镜观察结果。显微镜观察结果。原位原位PCRPCR（十一）连接酶链反应（十一）连接酶链反应( (LigaseLigase chain reaction chain reaction，LCR)LCR) 1
63、 1、LCRLCR的基本原理：的基本原理： 利用利用DNADNA连接酶特异地将双链连接酶特异地将双链DNADNA片段连接，片段连接，经变性经变性- -退火退火- -连接三步骤反复循环，从而使靶基连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。因序列大量扩增。 2 2、应用、应用 目前目前LCRLCR主要用于点突变的研究与检测、微主要用于点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等
64、。3 3、反应程序、反应程序: :首先加热至一定温度下首先加热至一定温度下(94(9495)95)使使DNADNA变性，双变性，双链打开；链打开；然后降温退火然后降温退火(65)(65)，引物与之互补的模板，引物与之互补的模板DNADNA结结合并留下一缺口；合并留下一缺口；如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，列完全互补，DNADNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCRLCR反应的三步骤反应的三步骤( (变性变性- -退火退火- -连接连接) )就能反复进行，就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应
65、中作模板，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序使更多的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物也就不能形成连接产物。Ligase chain reaction (LCR)Denaturation 70CAnnealing and Ligation 40CDenaturation 70C cDNAcDNA末端快速扩增技术是一种基于末端快速扩增技术是一种
66、基于PCRPCR从低从低丰度的转录本中快速扩增丰度的转录本中快速扩增cDNAcDNA的的55和和33末端末端的有效方法。的有效方法。 RACERACE可以分为两类：可以分为两类： 5 RACE-PCR5 RACE-PCR 3 RACE-PCR 3 RACE-PCR（十二）（十二）cDNAcDNA末端快速末端快速扩增技增技术(rapid amplification of (rapid amplification of cDNAcDNA ends, ends, RACERACE） 利用利用mRNAmRNA的的33末端的末端的poly(Apoly(A) )尾巴作为一个引物结合尾巴作为一个引物结合位点
67、，以位点，以Oligo(dT)30MNOligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶作为锁定引物在反转录酶MMLVMMLV作用下，反转录合成标准第一链作用下，反转录合成标准第一链cDNAcDNA。利用该反转录利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5 5末端时自动加上末端时自动加上3 3一一5 5个个( (dCdC) )残基，退火后残基，退火后( (dCdC) )残基残基与含有与含有SMARTSMART寡核苷酸序列寡核苷酸序列Oliogo(dGOliogo(dG) )通用接头引物配通用接头引物配对后，转换为以对后，转换为以SMART
68、SMART序列为模板继续延伸而连上通用序列为模板继续延伸而连上通用接头接头(figure 2 )(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通然后用一个含有部分接头序列的通用引物用引物UPM(universalUPM(universal primer,UPMprimer,UPM) )作为上游引物，用作为上游引物，用一个基因特异引物一个基因特异引物2(GSP 2 2(GSP 2 genespecificgenespecific primer,GSPprimer,GSP) )作为下游引物，以作为下游引物，以SMARTSMART第一链第一链cDNAcDNA为模为模板，进行板，进行PCRPCR
69、循环，把目的基因循环，把目的基因55末端的末端的cDNAcDNA片段扩片段扩增出来。最终，从增出来。最终，从2 2个有相互重叠序列的个有相互重叠序列的3 / 5-3 / 5-RACERACE产物中获得全长产物中获得全长cDNAcDNA，或者通过分析或者通过分析RACERACE产物的产物的33和和55端序列，合成相应引物扩增出全长端序列，合成相应引物扩增出全长cDNAcDNA。 5 RACE-PCR5 RACE-PCR 利用利用mRNAmRNA的的33末端的末端的poly(Apoly(A) )尾巴作为一个引物尾巴作为一个引物结合位点，以连有结合位点，以连有SMARTSMART寡核营酸序列通用接头
70、引寡核营酸序列通用接头引物的物的Oligo(dT)30MNOligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准作为锁定引物反转录合成标准第一链第一链cDNAcDNA。然后用一个基因特异引物然后用一个基因特异引物GSP1(gene GSP1(gene specific specific primer,GSPprimer,GSP) )作为上游引物，用一个含有作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物部分接头序列的通用引物UPM(universalUPM(universal primer,UPMprimer,UPM) )作为下游引物，以作为下游引物，以cDNAcDNA第一链为模板，第一链为模板，
71、进行进行PCRPCR循环，把目的基因循环，把目的基因33末端的。末端的。DNADNA片段扩片段扩增出来。增出来。 3 RACE-PCR3 RACE-PCR（1 1）是利用锁定引物）是利用锁定引物(lock docking primer)(lock docking primer)合成第合成第一链一链cDNAcDNA, ,即在即在oligo(dToligo(dT) )引物的引物的33端引入两个简并的端引入两个简并的核苷酸核苷酸【5-Oligo(dT)16_30MN-3, 5-Oligo(dT)16_30MN-3, M=A/G/C;N=A/G/C/TM=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在
72、使引物定位在poly(Apoly(A) )尾的起尾的起始点，从而消除了在合成第一条始点，从而消除了在合成第一条cDNAcDNA链时链时oligo(dToligo(dT) )与与poly(Apoly(A) )尾的任何部位的结合所带来的影响尾的任何部位的结合所带来的影响; ;（2 2）在）在55端加尾时，采用端加尾时，采用poly(Cpoly(C) )，而不是而不是poly(Apoly(A););（3 3）采用）采用RNaseRNase H H一莫洛尼氏鼠白血一莫洛尼氏鼠白血. .病毒病毒(MMLV)(MMLV)反转反转录酶或选择嗜热录酶或选择嗜热DNADNA聚合酶可能在高温聚合酶可能在高温h (
73、60 h (60 度度 -70-70度度 ) )有效地逆转录有效地逆转录mRNAmRNA，从而消除了从而消除了55端由于高端由于高CCCC含量含量导致的导致的mRNA mRNA 二级结构对逆转录的影响二级结构对逆转录的影响; ;（4 4）是采用热启动）是采用热启动PCR (hot start PCR)PCR (hot start PCR)技术和降落技术和降落PCR(touchPCR(touch down PCR) down PCR)提高提高PCRPCR反应的特异性。反应的特异性。 RACE-PCRRACE-PCR AFLPAFLP技技术术是是一一项项新新的的分分子子标标记记技技术术，是是基基于
74、于PCRPCR技技术术扩扩增增基基因因组组DNADNA限限制制性性片片段段，基基因因组组DNADNA先先用用限限制制性性内内切切酶酶切切割割，然然后后将将双双链链接接头头连连接接到到DNADNA片片段段的的末末端端，接接头头序序列列和和相相邻邻的的限限制制性性位位点点序序列列，作作为为引引物物结结合合位位点点。限限制制性性片片段段用用二二种种酶酶切切割割产产生生，一一种种是是罕罕见见切切割割酶酶，一一种种是是常常用用切切割割酶酶。它它结结合合了了RFLPRFLP和和PCRPCR技技术术特特点点，具具有有RFLPRFLP技技术术的的可可靠靠性性和和PCRPCR技技术术的的高高效效性性。由由于于A
75、FLPAFLP扩扩增增可可使使某某一一品品种种出出现现特特定定的的DNADNA谱谱带带，而而在在另另一一品品种种中中可可能能无无此此谱谱带带产产生生，因因此此，这这种种通通过过引引物物诱诱导导及及DNADNA扩扩增增后后得得到到的的DNADNA多多态态性性可可做做为为一一种种分分子子标标记记。AFLPAFLP可可在在一一次次单单个个反反应应中中检检测测到到大大量量的的片片段段。以以说说AFLPAFLP技技术术是是一一种种新新的的而而且且有有很很大大功功能能的的DNADNA指指纹纹技技术。术。（十三）（十三）AFLPAFLP（扩增性片段增性片段长度多度多态性性 ）AFLPAFLP1 1、概念：、
76、概念： 免疫免疫-PCR-PCR是新近建立的一种灵敏、特异的抗是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统。它利用抗原原检测系统。它利用抗原- -抗体反应的特异性和抗体反应的特异性和PCRPCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测。于极微量抗原的检测。2 2、免疫、免疫PCRPCR优点优点特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上。应的基础上。敏感度高，敏感度高，PCRPCR具有惊人的扩增能力，免疫具有惊人的扩增能力，免疫PCRPCR比比ELISAELISA敏感度高敏感度高105105倍以
77、上，可用于单个抗原的倍以上，可用于单个抗原的检测。检测。操作简便，操作简便，PCRPCR扩增质粒扩增质粒DNADNA比扩增靶基因容易比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行。得多，一般实验室均能进行。（十四）免疫（十四）免疫- -PCR(immunoPCR(immuno-PCR-PCR) ) 3 3、主要步骤、主要步骤 抗原抗原- -抗体反应；抗体反应； 与嵌合连接分子结合；与嵌合连接分子结合； PCRPCR扩增嵌合连接分子中的扩增嵌合连接分子中的DNA(DNA(一般为质粒一般为质粒DNA)DNA)。 4 4、关键环节、关键环节 免疫免疫-PCR-PCR技术的关键环节是嵌合连接分子的制技术的关
78、键环节是嵌合连接分子的制备。嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位备。嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒质粒DNADNA结合，其基本原理与结合，其基本原理与ELISAELISA和免疫酶染色相和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNADNA，在操作反应中形成抗原抗体，在操作反应中形成抗原抗体- -连接分子连接分子-DNA-DNA复合物，复合物，通过通过PCRPCR扩增扩增DNADNA来判断是否存在特异性抗原。来判断是否存在特异性抗原。（
79、十五）（十五）MSPMSP甲基化特异甲基化特异PCRPCR 一般调控区保持甲基化状态，基因不表达一般调控区保持甲基化状态，基因不表达直接干扰转录因子和启动子识别位点的结合直接干扰转录因子和启动子识别位点的结合与转录抑制因子结合引起基因沉默与转录抑制因子结合引起基因沉默改变染色质的结构改变染色质的结构概念：概念： MSP MSP甲基化特异甲基化特异PCRPCR是用对苯二酚和亚硫酸氢是用对苯二酚和亚硫酸氢钠处理氢氧化钠变性的基因组钠处理氢氧化钠变性的基因组DNADNA，使得未甲基化使得未甲基化的的C C转化为转化为T T。按照。按照C C转换转换T T后的基因序列设计出来后的基因序列设计出来的引物扩出目的基因。由于甲基化的引物扩出目的基因。由于甲基化CpGCpG岛中的岛中的C C不不能被转化为能被转化为T T，用以上的引物将不会扩出目的基因。用以上的引物将不会扩出目的基因。通过上述手段就能达到识别基因组通过上述手段就能达到识别基因组DNADNA甲基化与否甲基化与否的目的。的目的。DNA甲基化的分析
