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1、11 高效液相色谱法高效液相色谱法 (HPLC) HighPerformanceLiquidChromatographyHighPerssureLiquidChromatographyHighSpeedLiquidChromatography1自学自学“薄层色谱法薄层色谱法”讨论题讨论题1.荧光薄层板的组分是什么？它是否用于荧光化合荧光薄层板的组分是什么？它是否用于荧光化合物的检测？物的检测？2.荧光薄层的展开动力？展开速度是否发生变化？荧光薄层的展开动力？展开速度是否发生变化？3.推导容量因子与比移值的关系？推导容量因子与比移值的关系？4.什么是过压薄层色谱法？什么是过压薄层色谱法？5.薄层
2、色谱扫描仪的工作原理。薄层色谱扫描仪的工作原理。2HPLC是是在在经经典典液液体体柱柱色色谱谱的的基基础础上上,在在色色谱谱理理论论指指引引下下，加加以以改改进进而而发发展展起起来来的的。特特别别是是GC迅迅速速成成为为一一种种仪仪器器分分析析方方法法和和社社会会需需要要分分离离分分析析难难挥挥发发复复杂杂样样品品促促进进了了HPLC的的发发展展。近近年年来来它它以以6-8%的的增增长长率率发发展展，目目前前年年发发表表论论文文数数已已超过超过GC。2000年仪器销售全球第一。年仪器销售全球第一。3特性特性经典经典LCTLC/PCHPLCHPLC优势优势进样进样人工加样人工加样点样点样进样器进
3、样器准确准确溶液流动溶液流动重力重力表面张力表面张力高压泵高压泵快速分离快速分离,重现性好重现性好检测和定量检测和定量 收集馏分检收集馏分检测测显色显色连续检测连续检测高灵敏度高灵敏度,自动化自动化实验结果实验结果棒式图棒式图斑点斑点色谱图色谱图五高一广五高一广表11.1三种不同形式液相色谱的这样特征4HPLC和经和经典典LC比较比较HPLC和经典LC主要差别在于高效固定相、输液设备和连续检测。从速率理论得到塔板方程：涡流扩散、流型效应和停滞流动相慢传质均与dp有关，小的dp有利于提高柱效。高效固定相的重要特征是颗粒细小。 固定相的慢传质与df有关，减少df有利于提高柱效。键合相色谱有效降低d
4、f，柱效进一步提高。5经典经典LC填料的缺陷填料的缺陷填料通常是粒度大、范围宽、不规则,不易填充均匀,扩散和传质阻力大,谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。HPLC填料（填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小,分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，df大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料多用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。(高效固定相带来什么新问题？)6使用高效填料带来两个新问题：柱流动阻力大大增大，需要采用高压泵输液表面能很大，采用专业的装柱技术目前经经典典LC主主要要用用于于制制备备，若若用用于
5、于分分析析则则采采用脱机或非连续检测。用脱机或非连续检测。HPLC的特征采用高高效效色谱柱、高高压压输液设备和高高灵灵敏敏度度检测器,从而实现了高效、高速和高灵敏度、定量准确,达到可与GC相媲美的分离分析性能。特别是结合计算机技术，HPLC已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器。78历史上出现不同的历史上出现不同的HPLC名称：名称：高压高压液相色谱液相色谱(HighPressureLiquidChromatography)高速高速液相色谱液相色谱(HighSpeedLiquidChromatography)高效高效液相色谱液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatog
6、raphy)总之，总之，HPLC与经典与经典LC相比相比,使用时更方便使用时更方便,对操作者的依赖性更小。对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和的高重现性和连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具有较高的准确性和精密度。有较高的准确性和精密度。经典经典LC的特点：简便，填料一次使用。的特点：简便，填料一次使用。9高效液相色谱仪基本装置高效液相色谱仪基本装置流动相进样阀注入样品液色谱柱检测器色谱处理机高压泵流出液1011高效液相色谱仪方框图高效液相色谱仪方框图流流动动相相高高压压泵泵进进样样器器色色谱谱柱柱检检测器测器积分仪积分仪流速控制流速控制阀进样
7、阀进样温度效应温度效应121314旋转式六通阀 a)取样位（load）b)进样位（injection）151617一一般般来来说说，色色谱谱和和电电泳泳仪仪的的仪仪器器流流程程基基本本相相同同。从从构构成成仪仪器器的的功功能能块块可可分分为为六六大大系系统统：流流动动相相供供给给和和输输送送系系统统、进进样样系系统统、分分离离系系统统、检检测测系系统统、记记录录或或数数据据处处理理系系统统和和辅辅助助控控制制系系统统。由由于于流流动动相相的的性性质质不不同同，流流路路系系统统的的仪仪器器结构有所不同。但记录和数据处理系统相同。结构有所不同。但记录和数据处理系统相同。色谱检测器色谱检测器色谱数据
8、处理色谱数据处理18流 动 相供 给 和输送进样分离检测记录、数据处理色谱工作站（计算机）：控制显示温 度 控制收集 流路系统（分析单元）：高、低压流路流路系统（分析单元）：高、低压流路 电路系统（控制单元）：信号传输与处理电路系统（控制单元）：信号传输与处理19色谱检测器色谱检测器（对流出物进行连续检测）（对流出物进行连续检测）检测器实际上是一种换能装置,它将流动相中组分含量的变化,转变成可测量的电信号(通常是电压),然后输入记录器。从原理分析，任何一种分析鉴定方法都可能色谱检任何一种分析鉴定方法都可能色谱检测器测器。理想的检测器应该是灵敏度高、线性范围大、对所有待测组分相同响应。一般检测器
9、分为；热学、光学、电学、电化学。检测器总体性质检测器：热导、示差折射、电导溶质性质检测器：氢焰、紫外、荧光通用检测器与选择型检测器浓度型检测器和质量型检测器20检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。检测器的线性范围检测器的线性范围大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y=ac,只有在在三三个个数数量量级级的的浓浓度度范范围围内内满满足足0.98 1.02的的线线性性响响应应的的检检测测器器才是线性的才是线性的。灵敏度灵敏度色谱分析中有三种不同的灵敏度表示法,检测器本身的灵敏度,整个色谱体系的浓
10、度灵敏度和质量灵敏度色谱体系的浓度灵敏度和质量灵敏度。对于定量分析来说,重要的是色谱体系的灵敏度,因为它还包括柱子和仪器的其它部分的影响。21检测器的灵敏度(CD),实际上指检测限,即通常指相当于两倍噪音信号的溶质浓度。而色谱体系的最小检测限应是柱外效应10%的最大进样体积所对应的二倍于噪音峰高所对应的样品浓度。而色谱分析最重要的是色谱体系的质量灵敏度,最小可测量：m=2CCD,C是柱内效应的标准偏差。或m=6.25e(1k),e是柱外效应的标准偏差。检测器的色区展宽检测器的色区展宽对于毛细管气相色谱和高效液相色谱，检测器的色区展宽是柱外效应的一个主要来源。一般仪器厂商在设计时已把检测器的色区
11、展宽减少到最低程度。22色谱数据处理色谱数据处理分离柱检测器记录仪积分仪色谱工作站色谱仪信号输出方框图色谱数据处理通过色谱数据处理通过ADC转换器转换器,把模拟把模拟信号转换成数字信号信号转换成数字信号,然后采用色谱软件处然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。理给出色谱图等信息。数据处理原理：数据处理原理：峰的检测峰的检测数据采集数据采集基线校正和重叠峰的分离基线校正和重叠峰的分离自动处理自动处理人工修正人工修正23峰的检测峰的检测峰峰的的检检测测和和判判别别是是依依据据在在基基线线的的讯讯号号水水平平上上，预预设设一一个个“阈阈值值”，超超过过该该值值时时，判判别别为为峰峰可可开开始始检检测
12、测。一一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：切线色谱峰的判断最小面积依依照照信信号号斜斜率率的的变化检测信号变化检测信号依依照照积积分分面面积积检检测峰信号测峰信号24保留时间和峰面积的计算基线校正和重叠峰的分离基线校正和重叠峰的分离在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能完全分离的情况。通常采用谷谷规则或预设基线漂移值参数来解决25色谱仪色谱仪自动定性自动定性和定量分析和定量分析定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时,一般通过保留值来识别峰。但由于各种因素的影响,在重复多次分析中,保留值会有一定的
13、变化,可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。“时间窗时间窗”法法(TimeWindow)：tRt对整个色谱图上各个峰的保留值都设定相同区间“时间窗”，规定图中各个峰保留时间的变化范围。该法设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。“时间带时间带”法法(TimeBand):tR(1a%)对每个需识别的定量峰，都设定一个保留时间的相对变动范围。该设置较麻烦，但对不同峰可给出不同的变动范围，对识别相邻峰的分辨率较好，同时用于编组定量分析也很方便。26色谱数据处理机和色谱工作站的差别色谱数据处理机和色谱工作站的差别色谱数据处理系色谱数据处理系统统/机，积分仪机，积分仪功能：色谱数据处理功
14、能：色谱数据处理ADC模数转换接口模数转换接口色谱工作站色谱工作站功能：色谱数据处理功能：色谱数据处理控制仪器参数控制仪器参数ADC和和DAC模数转换模数转换接口接口27色谱智能化和专家系统简介色谱智能化是新一代色谱仪的发展方向,其特点是代替人的部分智能,选择分析方法和确定最佳色谱条件,并有条件地进行部分组分定性工作。这项工作不仅要求计算机技术,更重要的是,要加强色谱的基础理论研究,提高色谱操作技术,特别是制备出性能稳定的色谱柱,这样才能使操作规范化,以实现人工智能色谱。色谱专家系统是色谱智能化的一个重要组成部分,它从人工智能和数值计算方法出发开展研究,应包括以下几大部分：分离模式和柱系统的选
15、择；预处理方法和检测器的选择；分离条件最优化；在线色谱峰的定性和定量；色谱硬件的诊断。28色谱柱（固定相、填料）色谱柱（固定相、填料） 色色谱谱柱柱是是色色谱谱仪仪的的心心脏脏（起起分分离离作作用用），其其核核心心是是优优质质固固定定相相（填填料料） 。进进行行色色谱谱分分离离的的首首要要工工作作是是选选择择性性能能良良好好的的色色谱谱柱柱，即即在在确确定定的的分分离离条条件件下下分分离离效效率高和分析时间短的色谱柱。率高和分析时间短的色谱柱。 色谱柱的选择应考虑色谱柱的选择应考虑： 固定相类型的选择固定相类型的选择, , 主要取决于样品分离模式；主要取决于样品分离模式； 柱柱填填料料的的结结
16、构构, , 主主要要指指颗颗粒粒的的形形状状大大小小、均均匀匀性性、比表面、平均孔径和孔容等；比表面、平均孔径和孔容等； 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度 色谱柱的牌号色谱柱的牌号/ /厂商。厂商。29色谱柱的结构色谱柱的结构 色谱柱由柱管、填料、密封圈、过滤板、柱头等组成。应特别注意柱头规格及无死体积连接柱头规格及无死体积连接的特性。 柱规格 制备柱 分析柱分析柱 微径柱液相色谱 (Microbore HPLC) 毛细管液相色谱 (Capillary HPLC) 快速柱：高效短柱，如4.630mm, 3mODS柱 整体柱（Monolithic column)3
17、0整体柱整体柱(monolithiccolumn)是一种用有机或无机聚合是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相,具有制具有制备简单、重现性好、多孔性优越、能实现快速、高效备简单、重现性好、多孔性优越、能实现快速、高效分离等优点。分离等优点。制备技术制备技术:硅胶整体柱，如硅胶整体柱，如Merck公司的公司的ChromolithPerformanceRP-C18、SilicaROD和和PrepROD；有机聚合物整体柱，如有机聚合物整体柱，如BIASeparations的的CIM(ConvectiveInteractionMedai)
18、等聚合物整体柱等聚合物整体柱应用应用：高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)、毛细管电色谱、毛细管电色谱(CEC)、微柱液相色谱、微柱液相色谱(-HPLC)、固相萃取等系统上、固相萃取等系统上,成功地应用于生命科学、药物成功地应用于生命科学、药物学、环境科学等领域的分离分析。学、环境科学等领域的分离分析。31何为无死体积柱头连接？无限直径效应（无限直径柱）？32柱填料1 1填料的特性填料的特性1）基质材料 无机基体：硅胶、氧化铝、氧化锆和二氧化钛等 交联聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等 复合材料：无机基体复合一层聚合物 2）形状：球形和不规则 硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。此外
19、还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无机金属氧化物等。3334 这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在能在7070以下，以下，pH2pH28 8范围内正常范围内正常工作工作，应用广泛. 硅烷化（SiOSiC）键合固定相制备反应如下： （最常见类型！）（最常见类型！）353 3）粒度及分布范围）粒度及分布范围4 4）孔径和耐压性）孔径和耐压性 一一般般硅硅胶胶的的孔孔径径在在60-125A, 60-125A, 但但大大孔孔硅硅胶胶的的孔孔径径为为300-300-1000A1000A。硅胶填料的产品差异主要取决于：硅胶填料的产品差异主要取决于： 微粒基质的制备过程差异；微
20、粒基质的制备过程差异； 基质和键合物反应的差异；基质和键合物反应的差异； 柱装填技术专利的差异。柱装填技术专利的差异。 一些键合键新技术： （1 1）RXRX技术技术 (Tx technology) “ (Tx technology) “碱性脱活碱性脱活”（2 2）SBSB技术技术 (Stabilized Bonding) “ (Stabilized Bonding) “高覆盖量高覆盖量”（3 3）封端技术）封端技术 (End-Capping) (End-Capping)361 1）为什么要封端？）为什么要封端？2 2）聚合物柱的特点？）聚合物柱的特点？封端封端 常规常规 聚合物聚合物37固定
21、相类型 (Stationary phase)1）按色谱保留原理把填料分为：吸附剂、离子交换剂、涂敷固定液、分级孔径或交联度填料等。2）按特性分类 硅胶：极性吸附剂 键合固定相键合固定相 （为什么要键合？）（为什么要键合？） 采采用用硅硅胶胶表表面面键键合合技技术术, , 对对硅硅胶胶微微粒粒表表面面进进行行修修饰饰- -硅硅烷烷化化, , 使使得得硅硅胶胶表表面面带带有有不不同同的的功功能能团团, 以适应不同的分离需要。目前在色谱填料中, 键合相约占78%(其中C18占反相色谱的72%), 硅胶约占10%)。A.基质：200-300m2/g的硅胶；聚合物, 如聚苯乙烯和聚乙烯醇胶等。38键合相
22、类型烷烷基基：C C1 1、C C2 2、C C3 3、C C4 4、C C6 6、C C8 8、C C1212、C C1616、C C1818、C C2222等等反相柱；反相柱；苯基：C C6 6H H5 5-, -, 含有含有 - - 相互作用；相互作用；氰氰基基：-(CH-(CH2 2) )3 3-CN, -CN, 带带有有给给电电子子作作用用、羟羟基基的的氢氢键键作作用；正相、反相均可。用；正相、反相均可。氨氨基基：-(CH-(CH2 2) )3 3-NH-NH2 2, , 弱弱阴阴离离子子型型键键合合相相, , 可可用用于于糖糖分分析。析。 其其它它极极性性键键合合相相还还有有：二二
23、醇醇基基Lichrosorb Lichrosorb DIOLDIOL；硝硝基基Nucleosil-NONucleosil-NO2 2；二甲胺基；二甲胺基Nucleosil-NMeNucleosil-NMe2 2等。等。C. C. 键合层（单层和聚合物）键合层（单层和聚合物）39柱性能测试 : 应指定色谱条件和检测物质1理论塔板高度2峰不对称因子：应小于或等于1.23相对保留值和分配比的重现性：精密度应优于5%和10%4柱阻力因子： = 0.1Pt0dp2(109L2)，多孔填料500-10005. 折合塔板高度40流动相流动相 (Mobile phase)流流动动相相（淋淋洗洗剂剂、洗洗脱脱剂
24、剂）是是影影响响液液相相色色谱谱分分离离的的一一个个非非常常重重要要的的实实验验因因素素。改改变变流流动动相相的的性性质质和和组组成成将将改改变变溶溶质质组组分分的的保保留留值值、分分离离选选择择性性和和柱柱效效。 在在实实际际工工作作中中，流流动动相相的的可可选选择择范范围围较较大大是是液液相相色色谱的一个显著特点。谱的一个显著特点。 流流动动相相的的选选择择和和优优化化是是大大多多数数液液相相色色谱谱分分析析的的主主要要研研究究工工作作，在在合合理理的的时时间间内内, , 所所用用的的流流动动相相要要能能使样品各组分达到足够的分离。使样品各组分达到足够的分离。1 1）什么溶剂适合于液相色谱
25、？）什么溶剂适合于液相色谱？2 2）流动相如何影响色谱分离？）流动相如何影响色谱分离？问题：问题：41高效液相色谱流动相溶剂的物化性质（部分）42合适选择性溶剂合适选择性溶剂液液相相色色谱谱溶溶剂剂选选择择范围范围液相色谱流动相溶剂的选择步骤：液相色谱流动相溶剂的选择步骤： 选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等 选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品，2 k 5；复杂样品，0.5 k 20 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的值所有溶剂所有溶剂合适物理性质溶剂合适物理性质溶剂合适保留值溶剂合适保留值溶剂43流动相溶剂的选择流动相溶剂的选择 考虑溶剂的实实用用要要求求：在实际操
26、作中所选用的流动相能保证色谱系统的分离过程可重复进行：溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求；溶剂应当不干扰检测器的工作；在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。1与色谱系统的适应性：溶剂要有一定的化学稳定性, 不与固定相和样品组分起反应。2溶剂的纯度（包括毒性和价格） HPLC级：色谱淋洗剂，波长透光率 A.R.级：主成分及杂质含量443 3溶溶剂剂的的粘粘度度要要小小： 一般 约为(0.4-0.5) mPas , 最大也不超过 2mPas。粘度大, 流动相传质慢, 柱效下降；同时柱压增大。 4 4与与检检测测器器匹匹配配：UV检测要求mp的背景吸收要
27、低, 所用溶剂的截止波长 (T10%对应的波长)要与之相匹配。而RI检测则要求溶剂的折光指数与溶质的差别要大, 以利于检测。5 5沸沸点点低低：对制备色谱, 采用低沸点溶剂时的固体残留物少, 有利于提高纯度。6 6其其他他要要求求：溶剂对样品要有一定的溶解度。mp用前要脱气处理。便于更换和清洗。45液相色谱中的溶剂强度1.1. 溶溶剂剂强强度度是是描描述述色色谱谱性性能能的的主主要要指指标标，表表示示溶溶剂剂对对样样品品的的洗洗脱脱能能力力，它它决决定定于于溶溶剂剂与与溶溶质质之之间间分分子子的的作作用用力力。目目前前还还没没有有一一个个统统一一标标准准描描述述不不同同类类型型液液相相色色谱谱
28、体体系系中中的的溶溶剂剂强强度度，而而是是采采用用相相对对极极性性和和溶溶解解度度参参数等作为溶剂强度指标。数等作为溶剂强度指标。1)溶解度参数（参见溶剂选择性）2)极性参数P 根据固定相和流动相的极性大小, 人们把液相色谱分成： 正相色谱正相色谱：固定相极性大于流动相 (包括硅胶吸附色谱) 反相色谱反相色谱：固定相极性小于流动相46正正相相色色谱谱：增增加加溶溶剂剂极极性性，保留时间增大或变小？保留时间增大或变小？反反相相色色谱谱：增增加加溶溶剂剂极极性性，保留时间又如何变化？保留时间又如何变化？47洗脱强度与溶剂极性分分子子之之间间相相互互作作用用有有色色散散力力、偶偶极极作作用用、氢氢键
29、键和和介介电电作作用用。某某一一溶溶质质与与其其它它分分子子相相互互作作用用大大小小的的程程度度可可以以用用极极性性大大小小表表示示。极极性性越越大大, , 它它与与其其它它分分子子的的作作用用力力越越大大。 “极极性性”溶溶剂剂容容易易吸吸收收和和溶解溶解“极性极性”物质。物质。溶剂洗脱强度溶剂洗脱强度指流动指流动相中溶剂的洗脱能力相中溶剂的洗脱能力, 它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中, “溶剂洗脱溶剂洗脱强度强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。48溶剂强度图反相色谱THF/H2OACN/H2OMeOH/H2O020406080100正相
30、色谱正相色谱020406080100甲醇戊烷异丙基氯二氯甲烷乙醚乙腈00.150.30.450.60.7549混合溶剂的极性混合溶剂的极性在在液液相相色色谱谱中中, , 一一般般溶溶剂剂的的极极性性变变化化二二个个单单位位, , 溶溶质质的的分分配配比比差差不不多多能能有有十十倍倍的的变变化化。通通过过溶溶剂剂强强度度参参数数的的计计算算, , 可可以以较较好好地地较较快快地地选选择择合合适适溶溶剂剂或或调整流动相的极性范围。如：调整流动相的极性范围。如：正正相相色色谱谱：k k2 2 / / k k1 1 = = exp exp (P(P1 1P P2 2)/2)/2反反相相色色谱谱：k k
31、2 2 / / k k1 1 = = exp exp (P(P2 2P P1 1)/2)/2 在在液液相相色色谱谱常常用用混混合合溶溶剂剂作作流流动动相相。混混合合溶溶剂剂的的PP具有加和性：具有加和性： PPabab = = a aPPa a b bPPb b , , 为为某某一一溶溶剂剂的的体体积积分数。分数。50溶剂选择性分类 一般地说, 改变溶剂比例可调节流动相的极性, 从而使得组分的容量因子落在合适的范围内。但由于分子间相互作用的类型相同, 分离因子变化不大。因此专门研究了各种溶剂的选择性, 并将常用溶剂进行分类。51质子给予体偶极相互作用质子接受体溶剂选择性分类三角形图溶剂选择性分
32、类三角形图XeXdXn12345678纯质子接受体强偶极中性化合物纯质子给予体521 组：脂肪醚（纯质子接受体）2 组：脂肪醇（质子接受-给予体）3 组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化）4 组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体）5 组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距）6 组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈7 组：芳烃、芳醚、硝基甲烷8 组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）53质子给予体偶极相互作用质子接受体反相色谱中的溶剂选择性反相色谱中的溶剂选择性1甲醇2TFH345乙腈67水854质子给予体偶极相互作用质子接受体正相色谱中的溶剂选择性正相色谱中的溶剂选择性醚1234二氯乙烷5乙腈67
33、8CHCl38主溶剂：己烷主溶剂：己烷55 按溶剂分子的特殊作用类型分类按溶剂分子的特殊作用类型分类, , 采用三个不同的常数表示：采用三个不同的常数表示： Xe( Xe(接受质子参数接受质子参数)易与含羟基的分子作用易与含羟基的分子作用( (如酸类、酚类如酸类、酚类) )； Xd( Xd(给质子参数给质子参数)易与碱性化合物作用易与碱性化合物作用( (如胺、亚砜等如胺、亚砜等) )； Xn(Xn(强强偶偶极极参参数数)易易与与偶偶极极距距较较大大的的溶溶质质分分子子作作用用( (如如硝硝基基化化合物、腈、亚砜和胺类等合物、腈、亚砜和胺类等) )。 通通常常把把常常用用溶溶剂剂分分成成八八组组
34、。同同一一组组溶溶剂剂的的三三个个选选择择性性参参数数相相近近，其其选选择择性性相相似似。当当某某一一溶溶剂剂不不能能提提供供足足够够的的分分离离选选择择性性时时, , 那那么么更更换换同同组组的的其其它它溶溶剂剂亦亦不不能能提提高高选选择择性性。改改变变溶溶剂剂时时, , 只只有有从从距距离离较较远远的的溶溶剂剂组组挑挑选选, , 才才可可能能使使选选择择性性有有较较大大变变化化。因因为为当当溶溶剂剂和和样样品品分分子子的的各各种种相相互互作作用用的的相相对对重重要要性性发发生生明明显显变变化化时时, , 流流动动相的选择性才会发生最大程度的改变。相的选择性才会发生最大程度的改变。56流动相
35、的优化流动相的优化流动相的优化主要是考察流动相组成对保留时间、分离因子和分离度等参数的影响。 使用混合溶剂最大优点是：获得最佳的分离选择性；保持流动相的低粘度, 从而保证高的柱效。 在在吸吸附附色色谱谱中中混混合合溶溶剂剂选选择择规规则则：混合溶剂中极性强的组分含量大或小时, 有最大的值；能与溶质发生氢键作用的溶剂, 有较好的分离选择性。57梯度洗脱技术梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的基本原理梯度洗脱的基本原理梯度洗脱（溶剂程序）梯度洗脱（溶剂程序）：通过改变流动相的组成：通过改变流动相的组成来调整组分的来调整组分的kk值，改变分离因子值，改变分离因子
36、值，以达到值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。最短时间内得到最佳分离的目的。为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐？在液相色谱中最低温度和最高温度受到流动相的黏度和沸点的限制；同时它的温度效应比较小。581 1梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点（1 1）改善分离）改善分离, , 加快分析速度；加快分析速度；（2 2）改改善善峰峰形形, , 减减少少拖拖尾尾, , 有有利于痕量组分的检测；利于痕量组分的检测；（3 3）增加峰容量；）增加峰容量；（4 4）强强烈烈滞滞留留的的组组分分不不容容易易残残留留在柱上在柱上, , 保持柱性能长期良好；保持柱性能长期良好；
37、（5 5）下下次次分分析析时时, , 流流动动相相需需要要一一段段平平衡衡时时间间；不不同同溶溶剂剂的的UVUV吸吸收收程程度稍有差异度稍有差异, , 可能会引起基线漂移。可能会引起基线漂移。592梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的主要条件 A A 流动相流动相/ /弱溶剂组成；弱溶剂组成； B B 流动相流动相/ /强溶剂组成；强溶剂组成； 梯度时间；梯度时间； 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。梯度曲线：线性、凸型或凹型等。强溶剂A%time125603 3梯度洗脱的基本原理梯度洗脱的基本原理 L.R.Snyder L.R.Snyder建立了线性梯度洗脱方程：建立了线性梯度洗脱方程： ln k =
38、lnkln k = lnk0 0 b(t/tb(t/t0 0) )这里这里, k, k为梯度洗脱过程中任一时刻的容量因子；为梯度洗脱过程中任一时刻的容量因子； t t为梯度时间；为梯度时间； b b为斜率为斜率-梯度连续变化的斜率；梯度连续变化的斜率； t t0 0为死时间。为死时间。而洗脱时而洗脱时 k k和和kk0 0 与溶液组成间的关系为：与溶液组成间的关系为： ln k = lnkln k = lnk0 0 S S 式式中中 为为强强溶溶剂剂在在洗洗脱脱液液所所占占的的体体积积分分数数；S S是是与与强强溶溶剂剂和和试试样样有关的参数。对有关的参数。对RPLCRPLC分离小分子，分离小
39、分子，S S一般为一般为3-53-5。 k k0 0 为为 = 0 = 0时的时的PP值。值。结合上面二式结合上面二式, , 得得61 b = (b = ( StSt0 0) / t t) / t t0 0 = V = V0 0/t/t 在在梯梯度度完完成成时时, , t t = = t tG G 。此此时时, , 为为A A和和B B两两溶溶液液中中强强洗脱剂组成的差洗脱剂组成的差, , 即即 = = , , 这时：这时： b = b = V V0 0/(t/(tG GF) F) / t / tG G 为梯度变化速率为梯度变化速率, S, S值可由前式求得。值可由前式求得。可可见见, , b
40、 b值值是是可可以以求求出出的的。求求出出b b值值后后, , 可可以以初初步步确确定定一一下下各各种种物物质质的的kk值值, , 为为更更好好地地选选择择分分离离条条件件提提供供依依据。据。 确定最佳化的梯度分离条件的实现步骤确定最佳化的梯度分离条件的实现步骤：在在全全浓浓度度范范围围内内进进行行梯梯度度洗洗脱脱, , 要要确确信信欲欲分分离离物物质质在在梯度变化范围内可以被洗脱，初步观察分离物的位置；梯度变化范围内可以被洗脱，初步观察分离物的位置；确定梯度使用范围确定梯度使用范围, , 的大小；的大小；62选择几个梯度洗脱时间选择几个梯度洗脱时间t tG G, , 确定确定S S值；值；确
41、定确定t tG G下的最佳值下的最佳值( (小的小的t tG G, , 大的流速大的流速) )；可可以以进进行行非非线线性性梯梯度度洗洗脱脱, , 使使欲欲分分离离物物与与其其它它物物质质尽可能分开；尽可能分开； 若若分分离离效效果果不不好好, , 可可以以调调整整pHpH值值、盐盐类类型型、有有机机溶溶剂组成等方法使分离物的峰与其它峰尽可能分开。剂组成等方法使分离物的峰与其它峰尽可能分开。 梯度操作注意事项梯度操作注意事项： 两个流动相溶剂要能互溶，即极性不要相差太大两个流动相溶剂要能互溶，即极性不要相差太大 吸吸附附色色谱谱只只能能是是在在小小范范围围内内变变化化，因因此此在在吸吸附附色色谱谱中中很少用梯度洗脱很少用梯度洗脱（为什么？）（为什么？） 折射检测器不适应于梯度洗脱折射检测器不适应于梯度洗脱（为什么？）（为什么？）63高效液相色谱柱的装填高效液相色谱柱的装填（资料）（资料）64
