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1、植物组织培养的应用：第四章第四章人工种子与植物脱毒 1. 人工种子人工种子（Artificial seed）定定义：是指将植物离体培养中产生是指将植物离体培养中产生的的胚胚状体或芽状体或芽包裹在含有养分和保护功能的包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳人工胚乳(Artificialendosperm)和和人工种皮人工种皮(Artificial seed coat)中形成的类似种中形成的类似种子子的颗粒。又称合成种子的颗粒。又称合成种子(Synthetic seed)或体细胞种子或体细胞种子(Somatic seed)。体细胞胚再生途径的应用：4.1 4.1 人工种子人工种子 在在结构上从外向里包括
2、三部分：结构上从外向里包括三部分：（1）人工种皮人工种皮外层，保护胚状体外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；量冲击；（2）人工胚乳人工胚乳，含有，含有必需的营养成分和某些植物激素；必需的营养成分和某些植物激素；（3）胚状体或芽胚状体或芽。 2.2.人工种子的人工种子的优点点 （1）便于运输和储藏（相对于试管苗）。）便于运输和储藏（相对于试管苗）。 （2）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通过过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子，使人工种子优越于天然种子优越
3、于天然种子。（3）可以固定杂种优势，可以固定杂种优势，保存珍贵稀有植物品种保存珍贵稀有植物品种。（4）利于快速繁殖，生产效率高）利于快速繁殖，生产效率高（尤其是没有种子（尤其是没有种子和种子昂贵的植物）。和种子昂贵的植物）。 3. 人工种子制作人工种子制作 （1）胚状体同步发育）胚状体同步发育控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的关键环节之一控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的关键环节之一，主要方法如下：，主要方法如下：抑制剂法抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如5-氨基尿嘧氨基尿嘧啶），去除抑制剂后细胞可以同步发育啶），去除抑制剂后细胞可以同
4、步发育(S期始）。期始）。低温法低温法：低温处理使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，使分裂：低温处理使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，使分裂指数提高，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化指数提高，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化(G1期始）。期始）。渗透压法渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。通气法通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培养基中通入过在培养
5、基中通入3-5%乙烯乙烯+CO2或氮气控制细胞同步分裂。或氮气控制细胞同步分裂。分离筛选法分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。（2）人）人工种皮制作工种皮制作 理想的人工种皮理想的人工种皮(Artifical seed coat)应该具有应该具有保护保护胚状体的功能，并且具有胚状体的功能，并且具有无毒无毒、良好的、良好的通气性通气性、抗抗污染污染、适合运输适合运输等特点。等特点。 最早采用的材料是最早采用的材料是聚氧乙烯聚
6、氧乙烯，但是具有一定毒性、，但是具有一定毒性、易溶解于水等不足。目前采用易溶解于水等不足。目前采用海藻酸盐（钠、钙）海藻酸盐（钠、钙）较较多，多，其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，例如：性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，例如：水性营养成分易流失、表面易结团等。水性营养成分易流失、表面易结团等。因此，开发理因此，开发理想的人工种皮材料仍是一个重要课题。想的人工种皮材料仍是一个重要课题。（3）人工胚乳配制）人工胚乳配制 人工胚乳人工胚乳(Artifical endosperm)主要包括无机盐主要包括
7、无机盐、碳水化合物、蛋白质等（如、碳水化合物、蛋白质等（如MS培养基成分培养基成分），为胚），为胚胎胎发育提供营养保证发育提供营养保证。 由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以还由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以还要加入要加入防腐剂、抗菌素、农药防腐剂、抗菌素、农药等成分。等成分。藻酸钠藻酸钠等水溶性凝胶与等水溶性凝胶与Ca2+进行离子交换后凝固进行离子交换后凝固（4） 包埋包埋 方法主要有以下两种：方法主要有以下两种： 干燥法干燥法：这是比：这是比较早较早的一种包埋方法。将胚状体的一种包埋方法。将胚状体置于置于23、70%左右相对湿度左右相对湿度、黑暗条件下逐渐、黑暗条件下逐渐干燥，
8、然后用干燥，然后用聚氧乙烯聚氧乙烯等种皮材料包裹。等种皮材料包裹。 水凝胶法水凝胶法：这是：这是目前比较常用目前比较常用的一种方法。用的一种方法。用海海的特点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓的特点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓度与络合时间控制。度与络合时间控制。海藻酸海藻酸钠包埋示意包埋示意图包埋液（人工胚乳）制备：2%-4%的海藻酸钠+营养物、生长因子等如MS。将成熟的体细胞胚胎与包被液相混合，然后将其滴入（只允许一个通过）适当浓度的氯化钙溶液中，经过络合作用（生成海藻酸钙）的造形过程，在20-30分钟内形成内含细胞胚、有一定硬度的雏形人工种子。（5）人工种子的）人工种子的储存存一
9、般将人工种子贮藏在一般将人工种子贮藏在47低温、相对湿度小低温、相对湿度小于于67%的条件下。实际上随贮的条件下。实际上随贮藏时间的延长藏时间的延长,人工人工种子的萌发率会显著下降。种子的萌发率会显著下降。 4. 人工种子制作人工种子制作存在的存在的问题 （1）人工种皮性能不尽人意。 （2）还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工胚乳。（3）胚状体储藏阶段的休眠控制；（4）如何保证长期储藏而又不影响萌发率；（5）制作流程较繁琐、成本高。（6）许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚。4.2 植物脱毒植物脱毒 植物脱毒植物脱毒 为什么？（植物病毒及其危害） 怎么脱毒（方法）？ 如何鉴定？1、植物病
10、毒及其危害、植物病毒及其危害烟草花叶病毒烟草花叶病毒TMV当病毒侵染寄主植物后，感病植物代当病毒侵染寄主植物后，感病植物代谢异常，异常，使植物的使植物的叶片黄化，褪叶片黄化，褪绿，皱缩，卷曲，卷曲； 使植株使植株矮化，坏死矮化，坏死；使使果果实减少或畸形减少或畸形。植物病毒的危害植物病毒的危害2、植物脱毒方法、植物脱毒方法方法：方法：物理方法：物理方法：高温、低温处理法高温、低温处理法，X射线、紫外射线、紫外线使病毒钝化线使病毒钝化化学方法：化学方法：抑制剂，如放线菌酮、抑制剂，如放线菌酮、8-鸟嘌呤、三氯唑核苷等鸟嘌呤、三氯唑核苷等生物方法生物方法：茎尖培养、微体嫁接，愈伤组织、珠心胚、花药
11、培养茎尖培养、微体嫁接，愈伤组织、珠心胚、花药培养2.1 物理方法物理方法原理：原理：在在35-50热处理下，理下，病毒活性被有效病毒活性被有效钝化，失去化，失去浸染能力，但宿主浸染能力，但宿主细胞胞伤害害较小。小。此方法主要此方法主要对一些一些圆形、形、线形病毒有效，而形病毒有效，而对杆状病毒无效，而且杆状病毒无效，而且处理理时间较长，易使植物受到，易使植物受到损伤。常用常用2种种处理方式：理方式：温温汤处理：理： 50热水水处理几分理几分钟到几小到几小时，适用于离体，适用于离体材料和休眠器官。材料和休眠器官。热风处理：理：以以35-40热风处理植物几十分理植物几十分钟至数天。至数天。2.1
12、.1 高温处理（热疗法）高温处理（热疗法）2.1.2 低温处理：低温处理：低温能使病毒活力下降，失去感染力。低温能使病毒活力下降，失去感染力。一些化学试剂可以抑制病毒一些化学试剂可以抑制病毒DNA复制和繁殖。复制和繁殖。包括：包括： 放线菌酮、三氯唑核苷、放线菌酮、三氯唑核苷、 8-鸟嘌呤、孔雀绿等鸟嘌呤、孔雀绿等但化学试剂可能对植物也有一定毒害作用，所以但化学试剂可能对植物也有一定毒害作用，所以应用广泛。应用广泛。2.2 化学脱毒法化学脱毒法2.3 生物脱毒法生物脱毒法原理：原理：幼嫩的茎尖幼嫩的茎尖(0.20.5mm)、根尖等生、根尖等生长点是不含病点是不含病毒的，因毒的，因为：茎尖分生速
13、度快于病毒增殖和茎尖分生速度快于病毒增殖和传播速度；播速度；茎尖分生茎尖分生组织未分化，无未分化，无维管管组织，而病毒在植物体，而病毒在植物体内主要是通内主要是通过维管管组织或胞或胞间连丝来来传播的。播的。该法法优点：点： 脱毒效果好、周期短、效率高脱毒效果好、周期短、效率高。不足：微茎尖不足：微茎尖难剥离，剥离，组培培难度大。度大。提示：提示：茎尖培养与高温茎尖培养与高温处理相理相结合脱毒效果更好。合脱毒效果更好。2.3.1 茎尖培养法茎尖培养法virus-freetissuevirus particlesfound here2.3 生物脱毒法生物脱毒法将将0.141.0mm茎尖嫁接在无病毒
14、茎尖嫁接在无病毒实生苗砧木上生苗砧木上。无病毒砧木来源：常用无病毒砧木来源：常用热处理法理法获得得适用情况：无法或特适用情况：无法或特难组织培养成植株的植物，如木本培养成植株的植物，如木本果果树。2.3.2 微体嫁接法微体嫁接法愈愈伤组织细胞分裂快，病毒复制能力减退或胞分裂快，病毒复制能力减退或丧失，失，因此因此也可也可获得无病毒苗木得无病毒苗木。由无病毒由无病毒细胞胞产生的愈生的愈伤组织可以可以获得无病毒苗木；得无病毒苗木；2.3.3 愈伤组织诱导法愈伤组织诱导法2.3 生物脱毒法生物脱毒法 利用种子珠心胚可以培养具有母侏利用种子珠心胚可以培养具有母侏遗传特性的无病毒特性的无病毒苗木，因苗木
15、，因为珠心胚是不珠心胚是不带病毒的病毒的。2.3.4 珠心胚培养法珠心胚培养法 通通过花花药培养培养获得得单倍体植株，再利用秋水仙素倍体植株，再利用秋水仙素处理理使染色体加倍，从而使染色体加倍，从而获得无病毒苗木，得无病毒苗木，why？2.3.5 花药培养法花药培养法马铃薯脱毒试管苗3 脱毒植物效果鉴定脱毒植物效果鉴定再生植株后，一般再生植株后，一般应在在1818个月以内个月以内进行病行病毒毒检测，因因为病毒在植物体内的病毒在植物体内的潜伏期一般潜伏期一般在在6 61212个月个月。病毒病毒检测的方法：的方法：3.13.1直接直接检测法法观察脱毒后植株茎、叶等器官生察脱毒后植株茎、叶等器官生长
16、情况，有情况，有无病毒引起的症状。无病毒引起的症状。3.23.2指示植物指示植物鉴定定（ indicator plant test）指示植物指示植物： 对病毒反病毒反应敏感、症状明敏感、症状明显的植物。如的植物。如烟草、烟草、马铃薯、葡萄、柑桔等。薯、葡萄、柑桔等。方法：方法：（1）摩擦接种法：摩擦接种法：用脱毒植物叶片中汁液与金用脱毒植物叶片中汁液与金刚砂或石英沙摩擦指示植物叶片，冲冼砂或石英沙摩擦指示植物叶片，冲冼 培养数天，培养数天，观察有无出察有无出现病毒感染症状。病毒感染症状。（2）嫁接法：）嫁接法：木本植物病毒不通过汁液传播。将木本植物病毒不通过汁液传播。将脱毒植物茎尖微嫁接在指示
17、植物砧木上，观察有脱毒植物茎尖微嫁接在指示植物砧木上，观察有无出现病毒感染症状。无出现病毒感染症状。3.3.3电镜检测 (Electron Microscopy)超薄切片技超薄切片技术负染技术免疫电镜技术杆状烟草花叶病毒杆状烟草花叶病毒TMV电镜下下检测病毒形病毒形态、大小及大小及结构构制片技制片技术包括：包括：3.4 抗抗血清血清检测法法病毒蛋白抗原免疫病毒蛋白抗原免疫动物，物，获得含特异得含特异结合抗体合抗体的血清，再与脱毒植物是否的血清，再与脱毒植物是否发生血清反生血清反应检测：酶联免疫吸附免疫吸附测定定 (EnzymeLinked(EnzymeLinkedImmunoImmuno SorbentSorbentAssay,Assay,ELISAELISA) )3.53.5分子分子检测技技术核酸核酸杂交技交技术 (Southern blot)PCRPCR扩增技增技术利用已知病毒利用已知病毒DNADNA序列序列设计引物或探引物或探针，检测脱毒植物脱毒植物谢 谢！
