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1、成才之路成才之路 生物生物路漫漫其修远兮路漫漫其修远兮 吾将上下而求索吾将上下而求索人教版人教版 选修选修1 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术专题五专题五课题课题3血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离专题五专题五课课 堂堂 合合 作作 探探 究究2思思 维维 创创 新新 升升 华华3知知 识识 体体 系系 构构 建建4课课 时时 作作 业业5课课 前前 预预 习习 导导 学学1课课 前前 预预 习习 导导 学学1.掌握提取生物大分子的基本过程和方法。掌握提取生物大分子的基本过程和方法。(重点重点)2理理解解凝凝胶胶色色谱谱法法、电电泳泳法法等等分分离离生生物物大大分分子子的的基基本本原原理。
2、理。(重、难点重、难点)3尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。一、凝胶色谱法一、凝胶色谱法1概概念念：也也称称做做_，是是根根据据_分离蛋白质的有效方法。分离蛋白质的有效方法。2原理原理当当_不不同同的的蛋蛋白白质质通通过过凝凝胶胶时时，相相对对分分子子质质量量_的的蛋蛋白白质质容容易易进进入入凝凝胶胶内内部部的的通通道道，路路程程_，移移动动速速度度_，而而相相对对分分子子质质量量_的的蛋蛋白白质质无无法法进进入入凝凝胶胶内内部部的的通通道道，只只能能在在_移移动动，路路程程_，移移动动速速度度_，从从而而使使_不不同的蛋白质分子得以分离。同的蛋白质分
3、子得以分离。分配色谱法分配色谱法 相对分子质量大小相对分子质量大小 相对分子质量相对分子质量 较小较小 较大较大 较慢较慢 较大较大 凝胶外部凝胶外部 短短 快快 相对分子质量相对分子质量 二、缓冲溶液二、缓冲溶液1作作用用：在在一一定定范范围围内内，抵抵制制_的的_对对溶溶液液pH的影响，维持的影响，维持pH_。2配配制制：由由_种种缓缓冲冲剂剂溶溶解解于于_中中配配制制而而成成，通通过过调调节节缓缓冲冲剂剂的的_就就可可以以得得到到不不同同pH范范围围内内使使用用的缓冲液。的缓冲液。外界外界酸和碱酸和碱相对稳定相对稳定12水水使用比例使用比例三、电泳三、电泳1概概念念：指指_在在电电场场的
4、的作作用用下下发发生生的的_的的过程。过程。2原原理理：在在一一定定的的_下下，_、_等等生生物物大大分分子子的的可可解解离离基基团团会会带带上上_或或_，在在_的的作作用用下下，这这些些带带电电分分子子会会向向着着与与其其所所带带电电荷荷_的电极移动。的电极移动。带电粒子带电粒子迁移迁移pH多肽多肽核酸核酸正电正电负电负电电场电场相反相反3作作用用：电电泳泳利利用用了了待待分分离离样样品品中中各各种种分分子子_的的差差异异及及分分子子本本身身的的_、_的的不不同同，使使带带电电分分子子产产生不同的生不同的_，从而实现样品中，从而实现样品中_的分离。的分离。4 方方 法法 ： 常常 用用 的的
5、 电电 泳泳 方方 法法 有有 _和和_。 测测 定定 蛋蛋 白白 质质 分分 子子 量量 时时 通通 常常 使使 用用_。带电性质带电性质大小大小形状形状迁移速度迁移速度各种分子各种分子琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胺电泳聚丙烯酰胺凝胺电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、实验操作四、实验操作蛋蛋白白质质的的提提取取和和分分离离一一般般分分为为四四步步：_、_、_和和_。1样品处理样品处理(1)红红细细胞胞的的洗洗涤涤：目目的的是是_。采采用用_离离心心，吸吸取取血血浆浆后后加加_洗洗涤涤，直直至至上上清清液液中中没没有有_，表明红细胞已洗涤干净。，表明红细胞已洗
6、涤干净。(2)血血红红蛋蛋白白的的释释放放：在在_和和_的的作作用用下下，红红细胞破裂，释放出血红蛋白。细胞破裂，释放出血红蛋白。样品处理样品处理 粗分离粗分离 纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定去除杂蛋白去除杂蛋白低速短时间低速短时间生理盐水生理盐水黄色黄色蒸馏水蒸馏水甲苯甲苯(3)分分离离血血红红蛋蛋白白溶溶液液：把把混混合合液液离离心心后后，将将试试管管中中的的液液体体用用滤滤纸纸过过滤滤，除除去去_，于于分分液液漏漏斗斗中中静静置置片片刻刻后后，分离出下层的分离出下层的_。(4)透透析析：透透析析袋袋能能使使小小分分子子自自由由进进出出，而而将将大大分分子子物物质质保保留在袋内。留在袋内。脂溶性
7、沉淀层脂溶性沉淀层红色透明液体红色透明液体2凝胶色谱操作凝胶色谱操作(1)凝凝胶胶色色谱谱柱柱的的制制作作：准准备备材材料料加加工工橡橡皮皮塞塞安安装装色色谱谱柱。柱。(2)凝胶色谱柱的装填。凝胶色谱柱的装填。(3)样样品品的的加加入入和和洗洗脱脱。其其基基本本过过程程是是调调节节缓缓冲冲液液面面加加入入蛋蛋白白质质样样品品调调节节缓缓冲冲液液面面洗洗脱脱收收集集分分装装蛋蛋白白质质。至至此此，血红蛋白即可得到粗分离。血红蛋白即可得到粗分离。3 纯纯 度度 鉴鉴 定定 ： 在在 鉴鉴 定定 的的 方方 法法 中中 ， 使使 用用 最最 多多 的的 是是_。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶
8、电泳 五、操作提示五、操作提示1红红细细胞胞的的洗洗涤涤：_、_与与_十十分分重重要要。洗洗涤涤次次数数过过少少，无无法法除除去去_；离离心心速速度度_和时间和时间_会使会使_等一同沉淀，达不到分离效果。等一同沉淀，达不到分离效果。2色色谱谱柱柱填填料料的的处处理理：商商品品凝凝胶胶使使用用前前需需直直接接放放在在_中中膨膨胀胀，可可以以将将加加入入其其中中的的湿湿凝凝胶胶用用_，加速膨胀。加速膨胀。3凝凝胶胶色色谱谱柱柱的的装装填填：在在装装填填凝凝胶胶柱柱时时，不不能能有有_存存在在。因因其其能能搅搅乱乱洗洗脱脱液液中中蛋蛋白白质质的的_，降降低低分离效果。分离效果。4蛋蛋白白质质的的分分
9、离离：如如果果_，说说明色谱柱制作成功。明色谱柱制作成功。洗涤次数洗涤次数离心速度离心速度离心时间离心时间血浆蛋白血浆蛋白过高过高过长过长白细胞白细胞洗脱液洗脱液沸水浴加热沸水浴加热气泡气泡洗脱次序洗脱次序红色区带均匀一致地移动红色区带均匀一致地移动 红细胞破碎后混合液中含有什么成分？红细胞破碎后混合液中含有什么成分？红红细细胞胞破破碎碎混混合合液液中中不不仅仅含含有有血血红红蛋蛋白白，而而且且还还含含有有细细胞胞破碎物、脂质、甲苯等。破碎物、脂质、甲苯等。教材教材P70“旁栏思考题旁栏思考题”凝凝胶胶实实际际上上是是一一些些微微小小的的多多孔孔球球体体，小小球球体体内内部部有有许许多多贯贯穿
10、穿的的通通道道。相相对对分分子子质质量量较较大大的的蛋蛋白白质质分分子子不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，只只能能分分布布在在颗颗粒粒之之间间，通通过过的的路路程程较较短短，移移动动速速度度较较快快；相相对对分分子子质质量量较较小小的的蛋蛋白白质质分分子子比比较较容容易易进进入入凝凝胶胶内内的的通通道道，通通过过的的路路程程较较长长，移移动动速速度度较较慢慢。因因此此，样样品品中中相相对对分分子子质质量量较较大大的的蛋蛋白白质质先先流流出出，相相对对分分子子质质量量中中等等的的分分子子后后流流出出，相相对对分分子子质质量量最最小小的的分分子子最最后后流流出出，从从而而使使各各种种相相对
11、对分分子子质质量量不不同同的分子得以分离。的分子得以分离。如如果果凝凝胶胶装装填填得得不不够够紧紧密密、均均匀匀，就就会会在在色色谱谱柱柱内内形形成成无无效效的的空空隙隙，使使本本该该进进入入凝凝胶胶内内部部的的样样品品分分子子从从这这些些空空隙隙中中通通过过，搅搅乱洗脱液的流动次序，从而影响分离的效果。乱洗脱液的流动次序，从而影响分离的效果。课课 堂堂 合合 作作 探探 究究(一一)依据蛋白质的特性的差异依据蛋白质的特性的差异蛋蛋白白质质的的理理化化性性质质(如如形形状状、大大小小、电电荷荷性性质质和和多多少少、溶溶解解度度、吸吸附附性性质质、亲亲和和力力等等)千千差差万万别别，由由此此可可
12、提提取取和和分分离离各各种种蛋白质。蛋白质。血红蛋白提取和分离的方法血红蛋白提取和分离的方法 (二二)蛋白质的分离方法：凝胶色谱法蛋白质的分离方法：凝胶色谱法1概概念念：凝凝胶胶色色谱谱法法也也称称做做分分配配色色谱谱法法，是是根根据据相相对对分分子质量大小分离蛋白质的有效方法。子质量大小分离蛋白质的有效方法。2原原理理：大大多多数数凝凝胶胶由由糖糖类类化化合合物物构构成成的的小小球球体体，内内部部有有许许多多贯贯穿穿的的通通道道，当当不不同同的的蛋蛋白白质质通通过过凝凝胶胶时时，相相对对分分子子质质量量较较小小的的蛋蛋白白质质容容易易进进入入凝凝胶胶内内部部的的通通道道，路路程程较较长长移移
13、动动速速度度较较慢慢；而而相相对对分分子子量量较较大大的的蛋蛋白白质质无无法法进进入入凝凝胶胶内内部部的的通通道道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。(三三)缓冲溶液缓冲溶液1作作用用：在在一一定定范范围围内内，缓缓冲冲溶溶液液能能够够抵抵制制外外界界的的酸酸和和碱对溶液碱对溶液pH的影响，维持的影响，维持pH基本不变。基本不变。2配配制制：通通常常由由12种种缓缓冲冲剂剂溶溶解解于于水水中中配配制制而而成成。调调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。(四四)电泳电泳
14、1概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。2原原理理：许许多多重重要要的的生生物物大大分分子子，如如多多肽肽、核核酸酸等等都都具具有有可可解解离离的的基基团团，在在一一定定pH下下，这这些些基基团团会会带带上上正正电电或或负负电电。在在电电场场的的作作用用下下，这这些些带带电电分分子子会会向向着着与与其其所所带带电电荷荷相相反反的的电电极极移移动动。电电泳泳利利用用了了待待分分离离样样品品中中各各种种分分子子带带电电性性质质的的差差异异以以及及分分子子本本身身的的大大小小、形形状状的的不不同同，使使带带电电分分子子产产生生不不同同的的迁迁移移速度
15、，从而实现样品中各种分子的分离。速度，从而实现样品中各种分子的分离。电电泳泳利利用用了了除除哪哪些些性性质质外外使使样样品品中各种分子分离中各种分子分离()A带电性质差异带电性质差异B分子的大小分子的大小C分子的形状分子的形状 D分子的变性温度分子的变性温度 解解析析 电电泳泳是是指指带带电电粒粒子子在在电电场场作作用用下下发发生生迁迁移移的的过过程程，带带电电性性质质不不同同、分分子子的的大大小小和和形形状状不不同同都都会会影影响响带带电电粒粒子子在在电电场中的迁移速度。场中的迁移速度。 答案答案 D导学号导学号 06350412利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来利用凝胶色谱法，什么样
16、的蛋白质先洗脱出来()A相对分子质量大的相对分子质量大的 B溶解度高的溶解度高的C相对分子质量小的相对分子质量小的 D所带电荷多的所带电荷多的 答案答案 A 解解析析 凝凝胶胶色色谱谱法法是是根根据据相相对对分分子子质质量量的的大大小小分分离离蛋蛋白白质质的的有有效效方方法法。相相对对分分子子质质量量较较小小的的蛋蛋白白质质能能进进入入凝凝胶胶内内部部通通道道，路路程程较较长长，移移动动速速度度较较慢慢；相相对对分分子子质质量量大大的的蛋蛋白白质质，路路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。导学号导学号 06350413蛋蛋白白质质的的提提取取和和分分离离一一
17、般般分分为为四四步步：样样品品处处理理、粗粗分分离离、纯化和纯度鉴定。纯化和纯度鉴定。提取和分离血红蛋白的实验操作提取和分离血红蛋白的实验操作 (二二)凝胶色谱操作的主要步骤凝胶色谱操作的主要步骤3纯度鉴定纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判判断断纯纯化化的的蛋蛋白白质质是是否否达达到到要要求求，需需要要进进行行蛋蛋白白质质纯纯度度的的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。4结果分析与评价结果分析与评价 蛋蛋白白质质提提取取和和分分离离分分为为哪哪几几步步( )A样样品品处处理理、凝凝胶胶色色谱谱操操作作、
18、SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化样品处理、凝胶色谱操作、纯化C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 解解析析 蛋蛋白白质质的的提提取取和和分分离离分分为为样样品品处处理理、粗粗分分离离、纯纯化化、纯纯度度鉴鉴定定四四步步。A中中凝凝胶胶色色谱谱操操作作及及SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶电泳为实验操作过程中的技术。胶电泳为实验操作过程中的技术。 答案答案 C导学号导学号 06350414相相对对分分子子质质量量不不同同的的蛋蛋白白质质在在凝凝胶胶中中的的行行进进
19、过过程程，可可表表示示为下图中哪一个为下图中哪一个() 答案答案 B导学号导学号 06350415 解解析析 本本题题考考查查对对凝凝胶胶色色谱谱法法分分离离蛋蛋白白质质原原理理的的理理解解，蛋蛋白白质质相相对对分分子子质质量量越越大大，越越容容易易通通过过凝凝胶胶间间隙隙而而先先被被洗洗脱脱，蛋白质相对分子质量越小则易进入凝胶内部而后被洗脱。蛋白质相对分子质量越小则易进入凝胶内部而后被洗脱。思思 维维 创创 新新 升升 华华一、蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析一、蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析特特别别提提示示：凝凝胶胶色色谱谱的的原原理理是是相相对对分分子子质质量量小小的的蛋蛋白白质质进进
20、入入凝凝胶胶孔孔道道，路路程程长长，移移动动速速度度慢慢；而而相相对对分分子子质质量量大大的的蛋蛋白白质质在在凝凝胶胶外外部部移移动动，路路程程短短，移移动动快快，这这种种现现象象又又称称分分子子筛筛效效应。应。相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小直径大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径大于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径运动方式运动方式垂直向下运动垂直向下运动无规则的扩散运动无规则的扩散运动运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路程运动路程较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从凝胶柱中洗脱出来先从凝胶柱中洗脱出来后从凝胶柱中洗脱出来后从凝胶柱中洗脱出来二、样品处理、分离与纯化的目的不同二、样品处理、分离与纯化的目的不同目的目的红细胞洗涤红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红分离血红蛋白溶液蛋白溶液经过离心使血红蛋白经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开与其他杂质分离开透析透析除去样品中相对分子质量较小的杂质除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化纯化除去相对分子质量较大的蛋白质除去相对分子质量较大的蛋白质 答案答案 较慢较快较慢较快pH带电性质凝胶色谱法带电性质凝胶色谱法
