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1、第十章第十章 酶的抑制及其酶的抑制及其动力学动力学第一节第一节 抑制作用及其分类抑制作用及其分类 一一 概念概念: 广义上说，凡是阻碍或降低酶促反应速度的作用称广义上说，凡是阻碍或降低酶促反应速度的作用称为抑制作用。为抑制作用。 1. 钝化或变性作用钝化或变性作用(inactivation or denaturation) 指酶蛋白受物理或化学因素的影响，部分或全部改指酶蛋白受物理或化学因素的影响，部分或全部改变酶的空间构像从而引起酶活性降低甚至丧失的现象。变酶的空间构像从而引起酶活性降低甚至丧失的现象。根据除去致变性因素后，酶活性是否可以恢复，变性作根据除去致变性因素后，酶活性是否可以恢复，
2、变性作用分为可逆和不可逆作用。用分为可逆和不可逆作用。v 特点特点: 变性后酶蛋白构象发生变化，但肽键不断裂变性后酶蛋白构象发生变化，但肽键不断裂2 抑制作用抑制作用(inhibition) 指酶的必需基团受某种化学物质的影响指酶的必需基团受某种化学物质的影响而被改变，导致酶活性降低或失活。而被改变，导致酶活性降低或失活。v特点特点: 抑制剂部分或全部接到功能基上或基抑制剂部分或全部接到功能基上或基团团 的性质发生改变。但酶蛋白并未变性。的性质发生改变。但酶蛋白并未变性。3 去激活作用去激活作用 加入金属鳌合剂后，去除金属离子结合，加入金属鳌合剂后，去除金属离子结合，使酶活性降低。使酶活性降低
3、。 二二 抑制程度抑制程度v以反应速度的变化来衡量：以反应速度的变化来衡量： 1 相对活力分数相对活力分数 (残余活力分数残余活力分数)： a= ViV0 2 抑制常数抑制常数(抑制率抑制率) ：i =1 - a = 1- ViV0 三三 抑制作用的分类：抑制作用的分类：1. 不可逆抑制不可逆抑制: 抑制剂与酶的某些必须基团以共价抑制剂与酶的某些必须基团以共价键形式结合，其抑制剂不能以物理键形式结合，其抑制剂不能以物理(超滤、透超滤、透析、电泳析、电泳)方法除去。方法除去。 2. 可逆抑制可逆抑制: 抑制剂与酶的某些必须基团以非共抑制剂与酶的某些必须基团以非共价键结合可用物理法除去。价键结合可
4、用物理法除去。（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别 * 物理方法处理：透析，超滤，凝胶过滤；物理方法处理：透析，超滤，凝胶过滤； * 动力学方法：动力学方法： 取不同量的酶加到含有等量取不同量的酶加到含有等量S和和I 的等体积反应体系的等体积反应体系中，测定反应初速度，以中，测定反应初速度，以v E作图作图 将酶与抑制剂预保温后，取不同量混合液加到将酶与抑制剂预保温后，取不同量混合液加到含有等含有等量量S的等体积反应体系中，测定初反应速度，以的等体积反应体系中，测定初反应速度，以v E作图作图 vE0不可逆不可逆v= k2 S E0 Km+ S 可逆
5、可逆E0v无无不可逆不可逆可逆可逆v=k E0第二节第二节 不可逆抑制作用机理不可逆抑制作用机理 一一 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂: v非专一性不可逆抑制剂作用于酶分子中的几类基团非专一性不可逆抑制剂作用于酶分子中的几类基团 v 酰化试剂酰化试剂: -SH 磺酰氯磺酰氯 -NH2 D(I)FP + E- -OH 酰化酰化 酸酐类酸酐类 -酚羟基酚羟基v 烷化剂烷化剂: 一般含有活泼的卤素基团。一般含有活泼的卤素基团。 -OH 碘代乙酸碘代乙酸 -COOH R-X FDNB + E- -SH 烷化烷化 溴乙酸溴乙酸 -咪唑基咪唑基 -S-CH3v 金属酶抑制剂：金属酶抑制剂： 能与
6、金属形成络合物，毒害以金属离子为活性中心的能与金属形成络合物，毒害以金属离子为活性中心的金属酶。如氰化物、硫化物、叠氮化物和金属酶。如氰化物、硫化物、叠氮化物和CO等等v重金属毒物：重金属毒物： 重金属盐类，包括重金属盐类，包括Hg、Pb、Ag、Cu等为蛋白沉淀剂；等为蛋白沉淀剂；或作用于含或作用于含 SH的酶的酶v有机汞，有机砷化合物：有机汞，有机砷化合物： 作用于酶分子中的作用于酶分子中的Cys巯基，如：路易斯毒气巯基，如：路易斯毒气(Lewisite)；解毒解毒(BAL，即二巯基丙醇即二巯基丙醇)v青霉素青霉素(Penicillin) ： 作用于糖肽转肽酶作用于糖肽转肽酶(glycope
7、ptide transpeptidase ) 的的Ser羟基羟基v 氧化剂：包括一些弱氧化剂或光敏剂氧化剂：包括一些弱氧化剂或光敏剂 过甲酸过甲酸 -咪唑基咪唑基 光敏剂光敏剂 + E- -SH 氧化氧化 四硫硫酸钠四硫硫酸钠 - -OHv 还原剂还原剂: -S-S- 含含-SH化合物化合物 2 -SH v其它修饰剂：重氮化、硝化、酯化等其它修饰剂：重氮化、硝化、酯化等v注意：酰化试剂或烷化剂等一般全部或部分以共注意：酰化试剂或烷化剂等一般全部或部分以共价方式结合到酶上；但氧化剂或还原剂是改变或价方式结合到酶上；但氧化剂或还原剂是改变或修饰基团的性质。修饰基团的性质。二二 专一性不可逆抑制专一
8、性不可逆抑制 (一一) Ks型：型： 是根据底物的化学结构设计的，是酶的底物类似物，是根据底物的化学结构设计的，是酶的底物类似物，可被酶结合但不能被酶作用，分子中含活泼基团，可修饰可被酶结合但不能被酶作用，分子中含活泼基团，可修饰酶的必需基团。酶的必需基团。 E + S ES E-I Ks抑制剂的专一性，取决于抑制剂与活性中心必需基抑制剂的专一性，取决于抑制剂与活性中心必需基团，以及与活性中心之外同类基团形成非共价络合物的解团，以及与活性中心之外同类基团形成非共价络合物的解离常数之比：离常数之比： 只有只有Ks中心中心/ Ks非中心非中心 10-3 才有应用价值才有应用价值 亲和标记试剂亲和标
9、记试剂vTLCK（对甲苯磺酰对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮，胰酶抑制剂）赖氨酰氯甲酮，胰酶抑制剂）vTPCK（对甲苯磺酰对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮，胰凝乳酶抑制剂苯丙氨酰氯甲酮，胰凝乳酶抑制剂)(二二) Kcat 型型(又称自杀性底物又称自杀性底物) 根据酶的作用机理设计的，不仅结构和底物根据酶的作用机理设计的，不仅结构和底物类似，且是酶的天然底物，可被酶结合和催化。类似，且是酶的天然底物，可被酶结合和催化。其中含一个潜伏性基团，由于酶的催化而暴露或其中含一个潜伏性基团，由于酶的催化而暴露或活化，从而集中攻击酶的活性中心。又称酶的自活化，从而集中攻击酶的活性中心。又称酶的自杀性底物杀性底物(
10、Suicidal substrate) E + Si Ks ESi Kcat EI Ki E-I Ks: ESi的解离常数；的解离常数； Kcat： ESi转化为转化为EI的催化常数的催化常数 抑制作用的关键取决于抑制作用的关键取决于Kcat，Kcat越高抑越高抑制程度高制程度高 vKcat型抑制剂比型抑制剂比Ks具有更高的专一性：具有更高的专一性： Kcat型抑制剂是酶的底物，不仅被酶结合，型抑制剂是酶的底物，不仅被酶结合，而且能被酶催化。可区分具有相同底物，但催化而且能被酶催化。可区分具有相同底物，但催化机制不同的酶机制不同的酶 Kcat型抑制剂只能形成于酶反应中心，因而型抑制剂只能形成于
11、酶反应中心，因而专一性攻击酶活性中心基团。专一性攻击酶活性中心基团。 例如某些机磷农药：敌敌畏、敌百虫、乐果等例如某些机磷农药：敌敌畏、敌百虫、乐果等 (RO)2 - P -X O(S) v O2N- - O-P OC2H5 肝氧化酶肝氧化酶 O2N- - O-P OC2H5 S OC2H5 O OC2H5 (对硫磷对硫磷) 胆碱酯酶胆碱酯酶 (对氧磷对氧磷) Ks O2N- -O- P OC2H5 O OC2H5SerO-O2N- - OH（对硝基酚）对硝基酚）（磷酸化胆碱酯酶）（磷酸化胆碱酯酶）PAM（解磷定）解磷定）为胯化物为胯化物 -CH=NO-P OC2H5 N OC2H5 CH3E
12、H + 第三节第三节 可逆抑制作用动力学可逆抑制作用动力学 一一 四种基本动力学类型：四种基本动力学类型： 1. 竞争性抑制：竞争性抑制： E + S K1 ES K2 E + P + K-1 I E K1S ES Ki K-i K-1 EI Ki I K-i EIm=3,n=3K2EI: K-iK1SKiIK-1K2KiIE= (k-1+k2)k-iES= k1k-iSEI=(k-1+k2)ki IK2K-iK-1K-iE:ES: E K1S ES K-1 Ki I K-I EIK2 V = k2ES = k2ESES E0 = k2 E0 S k-1+k2 (1+ ki I ) + S k
13、1 k-i Vm= k2 E0 Ki = k-iki Km = k-1+k2 k1 V = Vm S = Vm S Km(1+ I ) + S Km+ S Kiv动力学常数的求取：动力学常数的求取： 1 = 1 + Km (1+ I ) 1 V Vm Vm Ki Sv相交于相交于纵轴一点，一点，Vm不不变；Km增大增大1/V1/S1/Vm1/Km-1/KmIv抑制率：抑制率： Vm S km(1+I /ki)+ S I /Ki i = 1-a =1 Vi / V0 =1- Vm S = 1+I /ki+S /Km km+ S v若若I不变，不变， 抑制率抑制率i与与S 成反比；若成反比；若S
14、， i=0 即：底物量极大时，可解除竞争性抑制即：底物量极大时，可解除竞争性抑制v注意注意: 过渡态类似物：酰苷五磷酸（过渡态类似物：酰苷五磷酸（AP5A) 为腺苷激酶过为腺苷激酶过 渡态底物类似物：渡态底物类似物：ATP+AMP 2ADP 某些竞争性抑制剂并不是底物的结构类似物。如：某些竞争性抑制剂并不是底物的结构类似物。如： 水杨酸是水杨酸是NADH为辅酶的脱氢酶或以为辅酶的脱氢酶或以ATP为底物的肌酸激酶为底物的肌酸激酶的竞争性抑制剂，但结构与的竞争性抑制剂，但结构与NADH或或ATP不同不同A-P-P-P P-AA-P-P-P-P-P-A腺苷激酶腺苷激酶 竞争性抑制的特点：竞争性抑制的
15、特点：v阻碍底物与游离阻碍底物与游离酶结合，具有合，具有竞争关系争关系v竞争性抑制剂可以是底物的基态类似物、竞争性抑制剂可以是底物的基态类似物、过渡态类似物或其它非底物结构类似物。过渡态类似物或其它非底物结构类似物。v双倒数作双倒数作图相交于相交于纵轴一点一点vVm不不变；Km增大增大v抑制率抑制率i与与S 成反比；若成反比；若S ， i=02.非竞争性抑制：非竞争性抑制： E + S K1 ES K2 E + P + K-1 + I I Ki K-i Ki K-i EI + S K1 ESI K-1 v特点：底物与抑制剂在与酶结合的过程中互不干扰特点：底物与抑制剂在与酶结合的过程中互不干扰
16、四个解离常数四个解离常数 : Ks= K-1 = K-1 =ks K1 K1 Ki= K-i = K-i = Ki Ki Ki n=4 m=5 用迅速平衡理论：用迅速平衡理论：K2 Ki, Km Km)(KiKm) 非竞争非竞争+竞争抑制竞争抑制 非竞争非竞争+反竞争抑制反竞争抑制 I对对E的亲和力高于的亲和力高于ES I对对ES的亲和力高于的亲和力高于E I1/V1/S-1/Km-1/Km1/Vm1/VmI E Ks ES Ki Ki EI Ks ESIV= VmS /(1+I /Ki) Km ( 1+I /Ki ) + S 1+I /Ki ( -Ki , Ki-Ki ) Ki Vm Ki
17、Vm 混合型抑制的特点：混合型抑制的特点：v 抑制抑制剂可与可与E或或ES复合物复合物结合，底物、抑制合，底物、抑制剂与与酶的的结合并非互不干合并非互不干扰（Ks Ks; Ki Ki)v双倒数作双倒数作图相交于第二或第三象限一点，相交于第二或第三象限一点，vKm、Vm 都减小，但比例不同都减小，但比例不同v抑制率抑制率: i= 1-vi/v0 = Km+ S1 +1 (Km/Ki+ S/Ki) /Iv四种基本动力学的关系：四种基本动力学的关系：Ki，竞争性抑制，竞争性抑制，Km=Km(1+ IKi) Vm = VmKi ，反竞争性抑制，反竞争性抑制，Km=Km(1+IKi) Vm= Vm(1+
18、 IKi)Ki=Ki，非竞争性抑制，非竞争性抑制， Km=Km Vm= Vm(1+ IKi)KiKi，Ki Ki 非竞争非竞争+反竞争反竞争 Ki Ki 非竞争非竞争+竞争竞争v混合型抑制是四种基本动力学总方程混合型抑制是四种基本动力学总方程V= VmS /(1+I /Ki) Km ( 1+I /Ki ) + S 1+I /Ki E Ks ES Ki Ki EI Ks ESI二二 抑制常数的抑制常数的Ki（Ki）求取求取:(一一)计算法：双倒数作图计算法：双倒数作图 + 计算计算 加入单一固定浓度的加入单一固定浓度的I，测定反应初速度测定反应初速度v与与S 的的关系，双倒数作图得一直线。其斜率
19、或纵截距与无关系，双倒数作图得一直线。其斜率或纵截距与无I时时的直线之比，除少数外，一般为的直线之比，除少数外，一般为1+ I/Ki或或1+ I/Ki，带带入入I可求取可求取Ki或或Ki。v竞争性抑制：斜率之比竞争性抑制：斜率之比=1+ I/Ki；纵截距之比纵截距之比=1v非竞争性抑制：斜率之比非竞争性抑制：斜率之比=纵截距之比纵截距之比= 1+ I/Kiv反竞争性抑制：斜率之比反竞争性抑制：斜率之比= 1；纵截距之比；纵截距之比= 1+ I/Kiv混合型抑制：斜率之比混合型抑制：斜率之比= 1+ I/Ki； 纵截距之比纵截距之比= 1+ I/Ki v优点：简便快速优点：简便快速 缺点：误差较
20、大缺点：误差较大 (二二) Dixon作图法作图法(1/V I):vDixon作图法：作图法： 将将S固定在不同的浓度，求每一个固定在不同的浓度，求每一个S下下V0与与I的关系，然后以的关系，然后以1/V对对I作图得一组直线，直线作图得一组直线，直线交点的横坐标为交点的横坐标为Ki值。值。v设底物浓度为设底物浓度为S1时，反应初速度为时，反应初速度为V1； 底物浓度为底物浓度为 S2时，为时，为V2， 并且并且S1 S2 则各种可逆抑制时的动力学常数求取如下：则各种可逆抑制时的动力学常数求取如下： 竞争性抑制竞争性抑制 ： 1 = 1 + Km (1+IKi) 1 V Vm Vm S 1 -
21、1 = Km (1+IKi) 1 - (1+IKi) 1 V1 V2 Vm S1 S2v若两直线有交点，则应有若两直线有交点，则应有:1/V1=1/V2 1 - 1 = - I ( 1 - 1 ) S1 S2 Ki S1 S2 I = - Kiv即：交点的横坐标为即：交点的横坐标为-Ki(-Ki,1/Vm)1/VIS1S2非竞争性抑制：非竞争性抑制：1 = 1 (1+ I) + Km (1+ I ) 1V Vm Ki Vm Ki S I= - Ki反竞争性抑制：反竞争性抑制： 1 = Km 1 + 1 (1+ I ) V Vm S Vm Ki以以Dixon法得到一组平线法得到一组平线所以，无法
22、求得所以，无法求得Ki值。值。S2S1 (-Ki , 0)1VI1VS1S2I 混合型抑制：混合型抑制： 1 = Km 1 (1+ I /Ki ) + 1 (1+ I/Ki) V Vm S Vmv注意：注意： Dixion作图法求取的是作图法求取的是Ki值，而不能得到值，而不能得到Ki值。值。S2I Ki Ki S2I-Ki1V (三三) Cornish-Bowden 作图法作图法(S/V I)： 在双倒数方程两侧乘以在双倒数方程两侧乘以S，再以再以S/V I作作图，所得直线相交于一点，交点横坐标为图，所得直线相交于一点，交点横坐标为-Ki。v反竞争性抑制：反竞争性抑制： 1 = Km 1 +
23、 1 (1+ I ) V Vm S Vm Ki 方程两侧乘以方程两侧乘以S，得：得： S = Km + S (1+ I ) V Vm Vm Ki S1 - S2 = S1 (1+ I ) - S2 (1+ I )=0 , I= - Ki V1 V2 Vm Ki Vm Ki S/VIS1S2(-Ki,Vm/Km)v混合型抑制：混合型抑制： S = S (1+ I /Ki ) + Km (1+ I/Ki) V Vm Vm 当当S1 /V1= S2/V2时，时， I= - KivCornish-Bowden作图法求取的是作图法求取的是Ki值值.S1I Ki Ki S2-KiS/VS2 Ki Ki S
24、1I-KiS/V三三 其他类型的可逆抑制其他类型的可逆抑制:(一一)部分抑制部分抑制 (partial inhibition): v完全抑制：完全抑制：EI或或ESI 为死端产物为死端产物, I, i=100%v部分抑制：部分抑制：ESI 部分分解部分分解 E + I+P, I, i k2 部分非竞争性抑制部分非竞争性抑制: E + S Ks ES k2 E + P + + I I Ki Ks Ki EI + S ESI k2 E + P +I 部分混合型抑制部分混合型抑制 ： k2 k2 Ks Ks Ki Ki 部分竞争性抑制部分竞争性抑制 ： 有少量有少量ESI形成，但形成，但k2 =k2
25、 ,Ki Ki ,Ks k2v部分抑制的公式推导：部分抑制的公式推导： Ki = k-i / ki = ES I ESI = ES I ESI Ki V = k2 ES+k2 ESI = k2 ES(1+ k2 I ) k2 Ki Vm ( 1+ k2 I / k2Ki ) S = 1+ I / Ki Km (1+ I / Ki ) + S 1+ I / Kiv 部分混合型部分混合型抑制方程抑制方程 k2 =0 完全混合型抑制方程完全混合型抑制方程 Vm ( 1+ k2 I / k2Ki ) SV = 1+ I / Ki Km (1+ I / Ki ) + S 1+ I / Kivk2= k2
26、 时，为部分竞争抑制：时，为部分竞争抑制： V= Vm S Km( 1+I/Ki )+ S 1+I/Ki Vm不变，不变，Km增大增大(KiKi) Ki, 完全竞争抑制完全竞争抑制 Km减小减小,Vm减小减小(k2 k2) k2=0, 完全反竞争抑制完全反竞争抑制 Km不变不变,Vm减小减小(k2 k2) k2=0, 完全非竞争抑制完全非竞争抑制 Vm ( 1+ k2 I / k2Ki ) SV = 1+ I / Ki Km /(1+ I /Ki) + Sv Ki时，部分反竞争抑制：时，部分反竞争抑制：v Ki=Ki时，部分非，部分非竞争抑制：争抑制： V= Vm(1+k2 I /k2Ki)S
27、 (Km+S) (1+I/Ki)(二二)底物抑制底物抑制负前馈：负前馈： E + S Ks ES k2 E + P + S ES2v例如：例如：PEP过量抑制丙酮酸激酶过量抑制丙酮酸激酶: PEP(磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸) 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 丙酮酸丙酮酸 ADP+Pi ATPv F-6-P+ ATP 磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶 F-1,6-2P 过量的过量的F-6-P抑制磷酸果糖激酶抑制磷酸果糖激酶1/V1/S(三三) 产物抑制产物抑制 负反馈负反馈1. 若若 P 升高，则升高，则 V 降低降低2. P从酶上释放时缓慢，对酶占位时间长，使底物从酶上释放时缓慢，对酶占位时间长，使底物
28、 无法和反应中心结合。（类似竞争性抑制剂）无法和反应中心结合。（类似竞争性抑制剂）1. 双底物反应中，产物可和非正常中间物形成死端双底物反应中，产物可和非正常中间物形成死端 产物产物(dead end product)，不能分解出正常产物不能分解出正常产物 P + EAB EABP P + EA EAP 死端产物死端产物 P + FB FBP正常正常 : NAD+ (A)+ 乳酸乳酸(B) 丙酮酸丙酮酸(P) + NADH(Q)异常异常 : ENAD+ (EA) +丙酮酸丙酮酸(P) EAP v 总结总结: 不可逆不可逆 非专一性非专一性 专一性专一性抑制抑制 竞争抑制竞争抑制 非竞争抑制非竞争抑制 完全抑制完全抑制 反竞争抑制反竞争抑制 混合抑制混合抑制 可逆可逆 部分抑制部分抑制 产物抑制产物抑制 底物抑制底物抑制 基本基本类型类型
