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1、化学药品质量标准分析方法验证河南省食品药品检验所闻京伟2005年6月药品质量标准分析方法验证指导原则 收载于中国药典2000年版二部与2005年版二部附录化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 国食药监注2005106号关于发布化学药关于发布化学药物稳定性研究等物稳定性研究等1616个技术指导原则的通知个技术指导原则的通知 二二五年三月十八日五年三月十八日发布发布方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用，并成为质量研究和质量控制的组成部分。只有经过验证的分析方法才能用于控制药品质量，因此方法验证是制订质量标准的基础。方法验证是药物研究过程中的重要内容。 药品质量标准分析方法验证的目的是判断
2、采用的分析方法是否科学、合理，是否能有效控制药品的内在质量。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。在下述情况下，分析方法需经验证1、建立药品质量标准；2、药品生产工艺变更；3、制剂的组分变更；4、对原分析方法进行修订时。 方法验证理由、过程和结果均应记载在药品标准起草说明或修订说明中。需验证检测项目的分类 根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求，可将需验证的检测项目分为四类： 1、鉴别 鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其它物质，用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性。 需验证检测项目
3、的分类2、杂质检查（限度试验、定量试验） 杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质，如有机杂质、无机杂质等。 杂质检查又可分为限度试验和定量试验两种情况。用于限度试验的分析方法验证侧重专属性和检测限。用于定量试验的分析方法验证强调专属性、准确度和定量限。需验证检测项目的分类3、定量测定 定量测定包括含量测定、制剂的溶出度（释放度）测定等，由于此类项目对准确性要求较高，故所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性。需验证检测项目的分类4、其他特定检测项目。 其他特定检测项目包括粒径分布、旋光度、分子量分布等，由于这些检测项目的要求与鉴别、杂质检查、定量测定等有所不同，对于这些项目的分析方法验
4、证应有不同的要求。验证内容 1 1、准确度；、准确度； 2 2、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）；、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）； 3 3、专属性；、专属性； 4 4、检测限；、检测限； 5 5、定量限；、定量限； 6 6、线性；、线性； 7 7、范围；、范围； 8 8、耐用性。、耐用性。一、准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值接近的程度。 一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验等。对于制剂一般以回收率试验来进行验证。 准确度应在规定的范围内测试。一、准确度1含量测定方法的准确度 原料药
5、 可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。一、准确度1含量测定方法的准确度 制剂 可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定结果进行比较。一、准确度2 2杂质定量测定的准确度杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果如不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或与另一成熟的方法进行比较，如药典
6、标准方法或经过验证的方法。经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的响应因子或对原料在不能测得杂质或降解产物的响应因子或对原料药的相对响应因子情况下，药的相对响应因子情况下，可在线测定杂质的相可在线测定杂质的相关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）。料药的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）。应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（重量比（%）或面积比（）或面积比（
7、%）。）。一、准确度3 3数据要求数据要求在规定范围内，至少用在规定范围内，至少用9 9个测定结果进行评价，例个测定结果进行评价，例如，设计如，设计3 3个不同浓度，每个浓度各分别制备个不同浓度，每个浓度各分别制备3 3份份供试品溶液，进行测定。应报告已知加入量的回供试品溶液，进行测定。应报告已知加入量的回收率（收率（%），或测定结果平均值与真实值之差及其），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。相对标准偏差或可信限。用于药品的含量测定时，样品浓度应设定于含量用于药品的含量测定时，样品浓度应设定于含量100100的的2020之间；之间；用于溶出（释放）曲线考察时，样品浓度应设定
8、用于溶出（释放）曲线考察时，样品浓度应设定于全曲线范围的上、中、下部位。于全曲线范围的上、中、下部位。 二、精密度精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度包括：重复性、中间精密度和重现性。含量测定和杂质的定量测定应考虑方法的精密度。二、精密度1重复性在相同条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性； 在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价，例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试溶液，进行测定。或100%的浓度水平，用至少测定6次的结果进行评价。二、精密度2中间精密度在同一个实
9、验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度； 为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。二、精密度3重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。当分析方法将被法定标准采用，应进行重现性试验。应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。三、专属性专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法、有机溶剂残留量测定等均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用多
10、个方法予以补充。 三、专属性1鉴别反应应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。需确证含被分析物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。三、专属性2杂质检查 作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性。在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离和检出，并具适当的准确度与精密度。三、专属性2 2杂质检查杂质检查在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过与另一种已证明合理
11、但分离或检测原理不同、通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱峰纯度检查。峰纯度检查。 三、专属性3、含量测定含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果。在杂质可
12、获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果。三、专属性3 3、含量测定、含量测定在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另一个经验证了的或药典方法进行比较，对比两种一个经验证了的或药典方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。
13、必要时进行色谱峰纯度检测定，比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。分。 三、专属性2 2含量测定和杂质测定含量测定和杂质测定 在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的或药典方法比较结果。验证了的或药典方法比较结果。用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解或氧化的用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降
14、解途径。解途径。含量测定方法应比对二法的结果，杂质检查应比含量测定方法应比对二法的结果，杂质检查应比对检出的杂质个数，必要时可采用二极管阵列检对检出的杂质个数，必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行峰纯度检查。测和质谱检测，进行峰纯度检查。三、专属性专属性验证常见主要问题验证方法不科学。主要是破坏性试验条件选择不合理，往往出现破坏条件太剧烈或使用破坏条件无效。破坏条件选择参考标准：能出现杂质峰，主成分峰的峰面积约相当于破坏前的8090，并能与产生的杂质峰很好的分离。四、检测限四、检测限检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵
15、敏的检测能力。因此对杂质限度试验，需证明方法具有足够低的检测限，以保证检出需控制的杂质。药品的鉴别试验和杂质检查方法，均应通过测试确定方法的检测限。常用的方法如下。四、检测限四、检测限1非仪器分析目视法（直观法 ）检测限的测定是通过对一系列已知浓度被测物的试样进行分析，并以能准确、可靠检测被测物的最小量或最低浓度来建立。用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。四、检测限四、检测限2 2信噪比法信噪比法用用于于能能显显示示基基线线噪噪音音的的分分析析方方法法，即即把把已已知知低低浓浓度度试试样样测测出出的的信信号号与与噪噪声声信信号号进进行行比比较较，计计算算可可检检出出的的最
16、最低低浓浓度度或或量量。一一般般以以信信噪噪比比为为3 3：1 1时时相相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。应的浓度或注入仪器的量确定检测限。其其他他方方法法有有基基于于工工作作曲曲线线的的斜斜率率和和响响应应的的标标准准偏偏差进行计算的方法等。差进行计算的方法等。无无论论用用何何种种方方法法，均均应应用用一一定定数数量量的的试试样样，其其浓浓度度为为近近于于或或等等于于检检测测限限，进进行行分分析析，以以可可靠靠地地测测定检测限。定检测限。五、定量限定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低量，定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。其测定结果应具一定准确
17、度和精密度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。保证含量很少的杂质能够被准确测出。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。方法的定量限。常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为1010 1 1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。五、定量限1、直观法直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。定
18、量限一般通过对一系列含有已知浓度被测物的试样进行分析，在准确度和精密度都符合要求的情况下，来确定被测物能被定量的最小量。五、定量限2 2、信噪比法、信噪比法用用于于能能显显示示基基线线噪噪音音的的分分析析方方法法，即即把把已已知知低低浓浓度度试试样样测测出出的的信信号号与与噪噪声声信信号号进进行行比比较较，计计算算出出可检出的最低浓度或量。一般可信噪比为可检出的最低浓度或量。一般可信噪比为1010：1 1。其其他他方方法法有有基基于于工工作作曲曲线线的的斜斜率率和和响响应应的的标标准准偏偏差进行计算的方法等。差进行计算的方法等。无无论论用用何何种种方方法法，均均应应用用一一定定数数量量的的试试
19、样样，其其浓浓度度为为近近于于或或等等于于定定量量限限，进进行行分分析析，以以可可靠靠地地测测定定量限。定定量限。六、线性线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。测物浓度直接呈正比关系的程度。应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备样品的方法进行测定，至少制备5 5份供试样品。以份供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观测得的响应信号作为被测物浓度的函数
20、作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。归计算。七、范围范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据剂型和分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。1、原料药和制剂含量测定，范围应为测试浓度的80%120%；七、范围2 2、制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的、制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的70%70%130%130%；3 3、溶出度的溶出量测定，范围应为限度的、溶出度的溶出量测定，范围
21、应为限度的20%20%，4 4、释放度中如规定了限度范围，则应为下限的、释放度中如规定了限度范围，则应为下限的- -20%20%至上限的至上限的20%20%；5 5、杂质测定范围应根据初步实测，拟订为规定限、杂质测定范围应根据初步实测，拟订为规定限度的度的20%20%。如果含量测定与杂质检查同时用百分归一化法，如果含量测定与杂质检查同时用百分归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的则线性范围应为杂质规定限度的-20%-20%至含量限度至含量限度（或上限）的（或上限）的20%20%。八、耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方
22、法时就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。八、耐用性典型的变动因素有：1、被测溶液的稳定性，样品的提取次数、时间等。2、液相色谱法中，流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速等。八、耐用性3、气相色谱法，不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。项项目目内容内容鉴别鉴别杂质测杂质测定定含量含量测测定及定及溶出量溶出量测测定定定量定量限度限度准确度准确度+ + +精密度精密度+ +重复性重复性+ +
23、 +中中间间精密精密度度+ + +专专属性属性检测检测限限定量限定量限线线性性范范围围耐用性耐用性附表 检验项目和验证内容方法再验证 在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析方法发生部分改变等，均有必要对分析方法再次进行全面或部分验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证。 再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。 方法再验证当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。 方法再验证当制剂的处方组成改变、辅料变更时，可能会影响鉴别的专
24、属性、溶出度和含量测定的准确度，因此需要对鉴别、含量测定方法再验证。当原料药产地来源发生变更时，可能会影响杂质检查和含量测定的专属性和准确度，因此需要对杂质检查方法和含量测定方法进行再验证。 方法再验证当质量标准中某一项目分析方法发生部分改变时，如采用高效液相色谱法测定含量时，检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，证明修订后分析方法的合理性、可行性。 方法再验证已有国家标准的药品质量研究中，基于申报的原料药合成工艺、制剂处方中的辅料等一般无法保证与已上市药品的一致性，需对质量标准中部分项目进行方法的再验证。 方法再验证是对分析方法的完善过程，应根据实
25、际改变情况进行再验证，从而保证所采用的分析方法能够控制药品的内在质量。 有关方法验证值得关注的几个问题1、并非每个检测项目的分析方法都需进行所有内容的验证，但同时也要注意验证内容应充分，足以证明采用的分析方法的合理性。如杂质限度试验一般需要验证专属性和检测限，而对于精密度、线性、定量限等涉及定量测定的项目，则一般不需要进行验证。 有关方法验证值得关注的几个问题2 2、方法验证应注重整体性和系统性。、方法验证应注重整体性和系统性。例如，对于鉴别项目所需要的专属性，一般一种例如，对于鉴别项目所需要的专属性，一般一种分析方法不太可能完全鉴别被分析物，此时采用分析方法不太可能完全鉴别被分析物，此时采用
26、两种或两种以上分析方法可加强鉴别项目的整体两种或两种以上分析方法可加强鉴别项目的整体专属性。专属性。 如如原原料料药药含含量量测测定定采采用用容容量量分分析析法法时时，由由于于方方法法本本身身原原因因，专专属属性性略略差差，但但假假如如在在杂杂质质检检测测时时采采用用了了专专属属性性较较强强的的色色谱谱法法，则则一一般般认认为为整整个个检检测测方法也具有较强的专属性。方法也具有较强的专属性。有关方法验证值得关注的几个问题3、越来越多的新方法不断被用于质量控制中，对于这些方法如何进行验证需要具体情况具体分析，而不能机械照搬指导原则。谢谢！联系 ：0371-63388287电子信箱；wenjwwt
