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1、DNA DNA 与与 蛋白质蛋白质 的的 相互作用相互作用2011.111研究意义研究意义生物分子之间的相互作用是生命现象发生生物分子之间的相互作用是生命现象发生的基础。一切生命过程都是生物分子之间的基础。一切生命过程都是生物分子之间或生物分子和其他物质分子之间进行接触，或生物分子和其他物质分子之间进行接触，相互作用，发生物理和化学变化所引起的。相互作用，发生物理和化学变化所引起的。因此，研究生物分子之间的相互作用可以因此，研究生物分子之间的相互作用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。蛋白质和核酸是构成生命体最为重要质。蛋白质和核酸是构成生命体最为重
2、要的两类生物大分子。蛋白质与核酸的相互的两类生物大分子。蛋白质与核酸的相互作用是分子生物学研究的中心问题之一。作用是分子生物学研究的中心问题之一。2前景与展望前景与展望1.1.很多细胞的生命活动涉及到特定的很多细胞的生命活动涉及到特定的DNADNA区段与特殊蛋白质区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用：结合因子之间的相互作用：DNADNA的复制和重组；的复制和重组；mRNAmRNA的转的转录和修饰；病毒的感染与增殖等录和修饰；病毒的感染与增殖等。2.2.随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究显得尤为重要。而基因表达调控是功能基因组
3、学的一个究显得尤为重要。而基因表达调控是功能基因组学的一个重要研究领域。而要深入研究基因表达调控的分子机制必重要研究领域。而要深入研究基因表达调控的分子机制必须要研究须要研究DNADNA与蛋白质的相互作用。与蛋白质的相互作用。3.3.在重组在重组DNADNA技术发展以来，已相继分离到大量的具有重要技术发展以来，已相继分离到大量的具有重要生物学意义的基因。在这种情况下科学工作者开始把自己生物学意义的基因。在这种情况下科学工作者开始把自己的研究兴趣逐渐转向的研究兴趣逐渐转向DNADNA结合蛋白这一课题上。结合蛋白这一课题上。 进一步研究进一步研究DNADNA蛋白质的相互作用需要生物学、化蛋白质的相
4、互作用需要生物学、化学、医学、物理学、计算机学、电子学等多学科的协作学、医学、物理学、计算机学、电子学等多学科的协作 。3作用类型作用类型 与单链与单链RNA结合结合 与茎环结构结合与茎环结构结合 与双链与双链DNA结合：普遍性结合结合：普遍性结合 特异性结合特异性结合4DNA与蛋白质复合物的结构与蛋白质复合物的结构生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以以核蛋白核蛋白（nucleoprotein）的形式存在。基因组）的形式存在。基因组DNA与蛋白质结合形成与蛋白质结合形成染色体（染色质染色体（染色质）。病毒）。病毒可以看成是游离的染色体。染色
5、质的基本结构单可以看成是游离的染色体。染色质的基本结构单位是位是核小体核小体（nucleosome）。核小体由组蛋白）。核小体由组蛋白核心（核心（H2A、H2B、H3和和H4各两分子构成八聚体）各两分子构成八聚体）和盘绕其上的和盘绕其上的DNA所构成。组蛋白所构成。组蛋白H1结合于连接结合于连接DNA上，使核小体相连。核小体还可以进一步压上，使核小体相连。核小体还可以进一步压缩成螺线管结构，螺线管结构再折叠形成染色单缩成螺线管结构，螺线管结构再折叠形成染色单体，染色单体结合非组蛋白形成体，染色单体结合非组蛋白形成染色体染色体。在病毒。在病毒颗粒和真核生物的染色体中，颗粒和真核生物的染色体中，D
6、NA通常以超螺旋通常以超螺旋和其他三级结构的形式存在，和其他三级结构的形式存在，DNA与蛋白质等的与蛋白质等的复合物则属于四级结构。复合物则属于四级结构。5结合特性结合特性1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。与硷基的旋转对称吻合。2.蛋白质和蛋白质和DNA的接触区只在的接触区只在DNA的一侧。的一侧。3.在结合过程中，蛋白质和在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。都有构像改变。4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与普遍性结合：蛋白
7、质中带正电荷氨基酸与DNA骨骨架的磷酸基团形成离子键。架的磷酸基团形成离子键。5. 特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷特定硷基接触。基接触。6蛋白质与蛋白质与DNA的普遍性结合的普遍性结合中中DNA的特点的特点 蛋白质与蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。及磷酸二酯键中的氧原子。 与与DNA碱基序列特异性无关碱基序列特异性无关结构的匹配性：结构的匹配性： 旋转对称性旋转对称性 特定距离的相反电荷特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力形成足够大的范德华力7P
8、r-DNA特异性结合中特异性结合中DNA的特点的特点大沟内存在特异性识别信息大沟内存在特异性识别信息氨基酸与碱基对共平面氨基酸与碱基对共平面氨基酸和碱基对之间形成氢键氨基酸和碱基对之间形成氢键 8Pr-DNA普遍结合中Pr的特点 -折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合可能是折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合可能是通过识别小沟结构实现通过识别小沟结构实现1.富含脯氨酸和碱性氨基酸富含脯氨酸和碱性氨基酸 组蛋白有重复的组蛋白有重复的SPKK：Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP序列与序列与A-T碱基对结合碱基对结合;KPRGRPK序列也能与小序列也能与小沟沟A-T结合
9、结合2.碱性螺旋碱性螺旋 组蛋白组蛋白H1的的C端端57个氨基酸个氨基酸 Lys和和Gly,Lys在螺旋两侧，在螺旋两侧，Gly夹在中间夹在中间3.蛋白磷酸化作用蛋白磷酸化作用 SP X X： Ser磷酸化磷酸化;TPKK： Tyr磷酸化磷酸化 磷酸化后和磷酸化后和DNA结合能力下降结合能力下降;磷酸化失去氢键磷酸化失去氢键9Pr-DNA特异性结合中特异性结合中Pr的特点的特点1.蛋白质多形成二聚体蛋白质多形成二聚体2.HTH （helix-turn-helix）复合物复合物3.同源盒结构同源盒结构 (同源盒基因均含有同源盒基因均含有180bp的高度保守序列，位于靠近的高度保守序列，位于靠近3
10、端的分散的端的分散的外显子上。这段序列编码外显子上。这段序列编码60个氨基酸的同源结构域。个氨基酸的同源结构域。HD折叠成折叠成4个个-螺旋结构。螺旋结构。X-射线晶体学研究表明螺旋射线晶体学研究表明螺旋与与平行，螺旋平行，螺旋与前与前2个个基本垂直，基本垂直，螺旋和它们之间的转折形成螺旋和它们之间的转折形成HTH结构结构 )4.亮氨酸拉链亮氨酸拉链(leucine zipper)结构结构 (一种蛋白质中常见的结构模体，由一组一种蛋白质中常见的结构模体，由一组(通常是通常是45个个)重复片段组成，每个重复片重复片段组成，每个重复片段的第段的第7个氨基酸残基均为亮氨酸，两条含有此模体的多肽链可形
11、成卷曲螺旋结构个氨基酸残基均为亮氨酸，两条含有此模体的多肽链可形成卷曲螺旋结构) 5.锌指结构锌指结构10基因表达过程中基因表达过程中的的DNA与蛋白质的相互作用与蛋白质的相互作用复制：拓扑异构酶、解旋酶、单链结合蛋白、引物合成酶、复制：拓扑异构酶、解旋酶、单链结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等酶和蛋白质的参与。聚合酶及连接酶等酶和蛋白质的参与。转录：转录：RNA聚合酶；聚合酶；翻译：氨酰翻译：氨酰-tRNA合成酶、肽基转移酶；参与折叠和加工合成酶、肽基转移酶；参与折叠和加工的酶。的酶。（蛋白质与（蛋白质与RNA的相互作用）的相互作用）11两个概念顺式作用元件（顺式作用元件（cis-
12、acting element）：存在于存在于基因旁侧序列中能够影响基因表达的序列，包括基因旁侧序列中能够影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。其启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。其本身不编码任何蛋白质，它仅仅提供一个作用位本身不编码任何蛋白质，它仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。element反式作用因子（反式作用因子（trans-acting ）：指能指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶蛋白基因转录效率的蛋白心序列上参与
13、调控靶蛋白基因转录效率的蛋白质质。12DNA与蛋白质之间的相互作用与蛋白质之间的相互作用是指顺式作是指顺式作用元件与反式作用因子之间的特异性识别用元件与反式作用因子之间的特异性识别与结合，从与结合，从DNA复制、转录、翻译、基因复制、转录、翻译、基因表达调控到染色质的组装，都涉及到表达调控到染色质的组装，都涉及到DNA与蛋白质的相互作用。大部分结合蛋白有与蛋白质的相互作用。大部分结合蛋白有自己的自己的DNA结合结构域，主要分为结合结构域，主要分为leu拉链、拉链、螺旋螺旋-转角转角-螺旋、螺旋螺旋、螺旋-环环-螺旋螺旋-锌指结构以锌指结构以及同质异形结构域几种结构模式，它们靠及同质异形结构域几
14、种结构模式，它们靠对对DNA螺旋大沟中的氢键的特异识别，螺旋大沟中的氢键的特异识别，以以非共价键与非共价键与DNA结合，来执行不同的功能。结合，来执行不同的功能。13经典举例操纵子（操纵子（operon）：是指原核生物中由一个或多个相关：是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。启动子（启动子（promoter）：与基因表达启动相关的顺式作用：与基因表达启动相关的顺式作用元件，是结构基因的重要成分。它是一段位于转录起始位元件，是结构基因的重要成分。它是一段位于转录起始位点点5端上游区大约端上游区大约100200bp以内
15、的具有独立功能的以内的具有独立功能的DNA序列，能活化序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板聚合酶，使之与模板DNA准确地相结准确地相结合并具有转录起始的特异性。合并具有转录起始的特异性。RNA聚合酶（聚合酶（polymerase）：以一条：以一条DNA链或链或RNA为模为模板催化由核苷板催化由核苷-5-三磷酸合成三磷酸合成RNA的酶。是催化以的酶。是催化以DNA为为模板（模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因的酶。因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为的遗传信息转录为RNA有
16、关，所以也称转录酶。有关，所以也称转录酶。 14催化催化转录转录的的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组聚合酶是一种由多个蛋白亚基组成的复合酶。成的复合酶。全酶（全酶（holoenzyme）的组成是的组成是2。亚基与亚基与RNA聚合酶的四聚体核心聚合酶的四聚体核心（2）的形成有关；）的形成有关；亚基含有核苷三磷酸的亚基含有核苷三磷酸的结合位点；结合位点；亚基含有与亚基含有与DNA模板的结合位点；模板的结合位点；而而Sigma因子只与因子只与RNA转录的起始有关，与链的转录的起始有关，与链的延伸没有关系，一旦转录开始，延伸没有关系，一旦转录开始，因子就被释放，因子就被释放，而链的延伸则由四聚体而链
17、的延伸则由四聚体核心酶核心酶（core enzyme）催化。所以，催化。所以，因子的作用就是识别转录的起始位因子的作用就是识别转录的起始位置，并使置，并使RNA聚合酶结合在聚合酶结合在启动子启动子部位。部位。 15正调控与负调控原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为负转录调控（据调控机制的不同可分为负转录调控（negative transcription regulation）和正转录调控）和正转录调控（positive transcription regulation）。负调控）。负调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白系统中
18、，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor）,起着阻止结构基因转录的作用。起着阻止结构基因转录的作用。根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏两根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏两大类。正调控系统中，调节基因的产物是激活蛋大类。正调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（白（activator）。根据激活蛋白的作用特征又可）。根据激活蛋白的作用特征又可分为正控诱导系统和正控阻遏系统。分为正控诱导系统和正控阻遏系统。16诱导诱导: 在某些代谢物或化合物的作用下，基因由原来的关闭在某些代谢物或化合物的作用下，基因由原来的关闭状态转变为工作状态状态转变为工作状态诱导物诱导物：能引起诱导发生的分
19、子能引起诱导发生的分子可诱导基因可诱导基因：诱导调节中被活化的基因：诱导调节中被活化的基因阻遏阻遏：在某些代谢物或化合物的作用下，基因由原来的工作：在某些代谢物或化合物的作用下，基因由原来的工作状态转变为关闭状态状态转变为关闭状态阻遏物阻遏物：能导致阻遏发生的分子能导致阻遏发生的分子可阻遏基因可阻遏基因：阻遏调节中被关闭的基因：阻遏调节中被关闭的基因特殊代谢物调控的分子机理特殊代谢物调控的分子机理 特殊代谢物是特殊代谢物是调控蛋白的变构剂，与调控蛋白结合可调控蛋白的变构剂，与调控蛋白结合可使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响
20、。的影响。1718原核生物基因转录调控的原核生物基因转录调控的4种类型种类型（a）负控诱导系统负控诱导系统 有活性的调节蛋白对结有活性的调节蛋白对结构基因实行负调控，阻遏构基因实行负调控，阻遏转录的进行；诱导物使调转录的进行；诱导物使调节蛋白失去活性从操纵基节蛋白失去活性从操纵基因上脱离，成为可诱导。因上脱离，成为可诱导。19（b）正控诱导系统）正控诱导系统 无活性的调节蛋白无活性的调节蛋白不能与操纵基因结合，不能与操纵基因结合，转录不能进行；只有转录不能进行；只有与小分子诱导物结合与小分子诱导物结合后成为活性调节蛋白，后成为活性调节蛋白，才可与操纵基因结合，才可与操纵基因结合，对结构基因实行
21、正调对结构基因实行正调控，转录可进行。控，转录可进行。20（c）负控阻遏系统）负控阻遏系统 无活性的调节蛋白无活性的调节蛋白不能与操纵基因结合，不能与操纵基因结合，转录可进行；辅阻遏转录可进行；辅阻遏物使该蛋白活化，与物使该蛋白活化，与操纵基因结合，对结操纵基因结合，对结构基因进行负调控，构基因进行负调控，转录不进行。转录不进行。21（d）正控阻遏系统）正控阻遏系统 活性蛋白可与操纵活性蛋白可与操纵基因结合，对结构基基因结合，对结构基因实行正调控，转录因实行正调控，转录可进行；当辅阻遏物可进行；当辅阻遏物与之结合成无活性调与之结合成无活性调节蛋白后，从操纵基节蛋白后，从操纵基因脱离，转录不进行
22、，因脱离，转录不进行，成为可阻遏。成为可阻遏。22乳糖操纵子模型P-启动子，启动子，RNA聚合酶的结合聚合酶的结合位点。位点。R-regulated gene,调节基因调节基因,转转录翻译生成调节蛋白，调节蛋录翻译生成调节蛋白，调节蛋白可以与白可以与O相结合，阻止相结合，阻止RNA聚合酶向下滚动，转录关闭，聚合酶向下滚动，转录关闭，即负调控。即负调控。O-operator，操纵基因，调节，操纵基因，调节蛋白的结合位点。蛋白的结合位点。P与与O有部分有部分重叠。重叠。S-structural gene,结构基因，结构基因，表达功能蛋白。这里的结构基表达功能蛋白。这里的结构基因决定了三种酶，这三种
23、酶协因决定了三种酶，这三种酶协调参与乳糖的调节。调参与乳糖的调节。23葡萄糖效应：葡萄糖效应：在葡萄糖存在的情况下，乳糖、山在葡萄糖存在的情况下，乳糖、山梨醇等碳源不被同时利用，即葡萄糖阻遏了一些梨醇等碳源不被同时利用，即葡萄糖阻遏了一些诱导酶的生成，也称分解代谢物抑制诱导酶的生成，也称分解代谢物抑制在同时存在葡萄糖和乳糖的培养基中培养细菌，在同时存在葡萄糖和乳糖的培养基中培养细菌，细菌优先利用葡萄糖作为碳源，葡萄糖耗尽后才细菌优先利用葡萄糖作为碳源，葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖。表现为开始利用乳糖。表现为二次生长二次生长E.coli在含有葡萄糖的培养基中生长良好，在只含在含有葡萄糖的培养基中生
24、长良好，在只含有乳糖的培养基中开始时生长不好，直到合成了有乳糖的培养基中开始时生长不好，直到合成了能够利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为能够利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为碳源的能力才开始生长。碳源的能力才开始生长。一种很一种很经济经济的调节方式的调节方式24DNA与蛋白质相互作用的研究方法与蛋白质相互作用的研究方法凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验DNaseI足迹试验足迹试验甲基化干扰试验甲基化干扰试验体内足迹试验体内足迹试验酵母单杂交技术酵母单杂交技术染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术噬菌体展示技术噬菌体展示技术核酸适体技术核酸适体技术生物信息学方法生物信息学方法蛋白质芯片技术及纳米技术
25、蛋白质芯片技术及纳米技术25凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）,是体外分析是体外分析DNA与蛋白质相互作与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。其基本原理是：用的一种特殊的凝胶电泳技术。其基本原理是：蛋白质与蛋白质与DNA结合后将大大增加相对分子质量，结合后将大大增加相对分子质量，而凝胶电泳中而凝胶电泳中DNA朝正电极移动的距离与其相对朝正电极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比。因此，没有结合蛋白的分子质量的对数成正比。因此，没有结合蛋白的DNA片段跑得快，而与蛋白质形成复合物的片段跑得快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。由于受到阻滞而跑得慢。该法简单、快捷，是分离纯化特定该法简单、快捷，是分离纯化特定DNA结合蛋白结合蛋白质的经典实验方法。另外，也可用于研究与蛋白质的经典实验方法。另外，也可用于研究与蛋白质相结合的质相结合的DNA序列的特异性。序列的特异性。26Thanks!27
