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1、1斑蝥临床应用及炮制研究斑蝥临床应用及炮制研究20102010版版中国药典中国药典饮片标准研究课题饮片标准研究课题 中药饮片质量标准平台建设子课题中药饮片质量标准平台建设子课题河南中医学院河南中医学院 张振凌张振凌 赵丽娜赵丽娜 王一硕王一硕 田连起田连起 石延榜石延榜 2概述v斑蝥入药始载于斑蝥入药始载于神农本神农本草经草经，为芫青科昆虫南，为芫青科昆虫南方大斑蝥方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑或黄黑小斑蝥小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体的干燥体1。v辛、热；有大毒。具有破辛、热；有大毒。具有破血消癥，攻毒蚀疮，引赤血消癥
2、，攻毒蚀疮，引赤发泡的作用。发泡的作用。v由于斑蝥素具有毒性，常由于斑蝥素具有毒性，常引起临床中毒，从古至今引起临床中毒，从古至今均需要炮制均需要炮制3主主 要要 内内 容容斑蝥临床应用研究斑蝥临床应用研究1斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究3斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究4 斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究7斑蝥药材及饮片质量标准的研究斑蝥药材及饮片质量标准的研究5碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准研究碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准研究61斑蝥米炒炮制工艺的研究斑蝥米炒炮制工艺的研究241.临床应用及药理研究
3、临床应用及药理研究v含有的斑蝥素含有的斑蝥素(Cantharidin, C10H12O4)具有较强具有较强的抗肿瘤活性，并且不降低白细胞，同时具有较强的抗肿瘤活性，并且不降低白细胞，同时具有较强的刺激；是重要的皮肤发泡剂。因而具有重要的药的刺激；是重要的皮肤发泡剂。因而具有重要的药用价值用价值。1.1、治疗癌症、治疗癌症 v斑蝥及提取物以及斑蝥素的衍生物等对治疗原发性斑蝥及提取物以及斑蝥素的衍生物等对治疗原发性肝癌疗效显著，明显优于手术治疗或放疗。肝癌疗效显著，明显优于手术治疗或放疗。v斑蝥及斑蝥素的衍生物对乳腺癌、食道癌、肺癌、斑蝥及斑蝥素的衍生物对乳腺癌、食道癌、肺癌、贲门癌、肠癌、等也有
4、一定疗效。贲门癌、肠癌、等也有一定疗效。 1.2、治疗神经性皮炎、疥癣、瘰疬、治疗神经性皮炎、疥癣、瘰疬v 外用刺激皮肤发泡外用刺激皮肤发泡52.药理研究药理研究2.1抗肿瘤机制抗肿瘤机制 v斑蝥素及其衍生物，分子量小，易入细胞内，产生细胞毒作用，具有较斑蝥素及其衍生物，分子量小，易入细胞内，产生细胞毒作用，具有较强的抗肿瘤作用，作用机制主要有：强的抗肿瘤作用，作用机制主要有：v抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡；抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡；v抑制肿瘤细胞的侵袭和转移；抑制肿瘤细胞的侵袭和转移；v抑制癌细胞脱氧核糖核酸抑制癌细胞脱氧核糖核酸(DNA)复制，增加放、化疗的敏感性。
5、并且具复制，增加放、化疗的敏感性。并且具有免疫增强和升高白细胞作用，这种独特的作用，早期可能由加速骨髓有免疫增强和升高白细胞作用，这种独特的作用，早期可能由加速骨髓成熟或释放所致，后期则可能与促造血干细胞的增殖并向粒一单核系祖成熟或释放所致，后期则可能与促造血干细胞的增殖并向粒一单核系祖细胞不断分化有关。细胞不断分化有关。2.2 抗纤维化和抗氧化损伤作用：抗纤维化和抗氧化损伤作用：v不同浓度的斑蝥素均能改变成纤维细胞的形态，抑制细胞增殖，成纤维不同浓度的斑蝥素均能改变成纤维细胞的形态，抑制细胞增殖，成纤维细胞数目明显下降，形态变得不规则，排列混乱，代谢产物增加。从而细胞数目明显下降，形态变得不
6、规则，排列混乱，代谢产物增加。从而证实斑蝥素能抑制证实斑蝥素能抑制NIH/373细胞的增殖，并且呈剂量依赖性。细胞的增殖，并且呈剂量依赖性。2.3 抗炎、抗病毒、抗菌、促雌激素样作用。抗炎、抗病毒、抗菌、促雌激素样作用。6第二部分第二部分 斑蝥米炒炮制工艺的研究斑蝥米炒炮制工艺的研究05版版中国药典中国药典规定米斑蝥的规定米斑蝥的炮制方法为取炮制方法为取净斑蝥与米拌炒，净斑蝥与米拌炒，至米呈黄棕色，取出，除去头、至米呈黄棕色，取出，除去头、翅、足。翅、足。斑蝥为毒性中药，斑蝥为毒性中药，该炮制方法较该炮制方法较为笼统，仅靠颜色对炮制程度进为笼统，仅靠颜色对炮制程度进行判断，没有量化具体的工艺参
7、行判断，没有量化具体的工艺参数数，饮片企业很难按此生产出安，饮片企业很难按此生产出安全、可控、稳定的产品。全、可控、稳定的产品。根据传统的炮制根据传统的炮制经验，结合现代经验，结合现代炮制设备，炮制设备，量化量化斑蝥米炒炮制工斑蝥米炒炮制工艺的参数，进行艺的参数，进行中试生产，制定中试生产，制定SOP，符合中药，符合中药现代化的要求现代化的要求。 7米斑蝥小批量米斑蝥小批量米斑蝥小批量米斑蝥小批量生产工艺生产工艺生产工艺生产工艺米斑蝥中试米斑蝥中试米斑蝥中试米斑蝥中试生产工艺生产工艺生产工艺生产工艺米斑蝥标准操作米斑蝥标准操作规程规程SOPSOP入锅入锅温度温度 200同时入锅同时入锅炒制炒制
8、24min米呈黄棕色、米斑蝥完好米呈黄棕色、米斑蝥完好红外测温仪红外测温仪滚筒滚筒内壁内壁温度温度300铁锅铁锅电加热炒药机电加热炒药机大米炒制大米炒制2min后，后，入斑蝥炒制入斑蝥炒制3min8v米炒斑蝥米炒斑蝥SOPSOPv1 1 适用范围适用范围v本标准适用于饮片车间生斑蝥、米炒斑蝥的操作。本标准适用于饮片车间生斑蝥、米炒斑蝥的操作。v2 2 职责职责v操作工：严格按本操作工：严格按本SOPSOP进行生斑蝥、米炒斑蝥操作。进行生斑蝥、米炒斑蝥操作。v3 3 内容内容v3.1 3.1 生斑蝥、米炒斑蝥前的准备生斑蝥、米炒斑蝥前的准备v3.1.13.1.1称量器具、红外测温仪、电热炒药机等
9、处于完好、清洁状称量器具、红外测温仪、电热炒药机等处于完好、清洁状态，生产用具齐全。态，生产用具齐全。v3.1.23.1.2工作间压差、温度、相对湿度符合生产工艺要求。工作间压差、温度、相对湿度符合生产工艺要求。v3.1.33.1.3以上要求均满足后，方可生产。以上要求均满足后，方可生产。v3.2 3.2 领料领料 v操作人员领取斑蝥、大米，核对品名、数量等。如有不符，严操作人员领取斑蝥、大米，核对品名、数量等。如有不符，严禁进入生产岗位，并按相关规定处理。禁进入生产岗位，并按相关规定处理。v3.3 3.3 净制：净制：v操作人员将斑蝥过操作人员将斑蝥过2 2号筛，筛除杂质，去除头、足、翅，即
10、为生号筛，筛除杂质，去除头、足、翅，即为生斑蝥。斑蝥。v3.4 3.4 称量：称量：v称取生斑蝥（除头、足、翅）称取生斑蝥（除头、足、翅）250g, 250g, 根据生斑蝥每根据生斑蝥每10kg10kg用大米用大米2kg2kg，称取大米，称取大米50g50g。v3.5 3.5 米炒：米炒：v将电热将电热炒药机温度设定在炒药机温度设定在400400，开机，用红外测温仪监测滚筒开机，用红外测温仪监测滚筒内壁底温度，待内壁底温度，待滚筒内壁温度升至滚筒内壁温度升至300300，立即投入大米，并开，立即投入大米，并开始计时，将大米炒始计时，将大米炒2min2min后立即投入生斑蝥，继续炒制后立即投入生
11、斑蝥，继续炒制3min3min，停停止炒制，立即出锅，此时大米为棕黄色，放凉。拣去大米。炒止炒制，立即出锅，此时大米为棕黄色，放凉。拣去大米。炒制过程共制过程共5min5min，用红外测温仪监测滚筒内壁温度范围在，用红外测温仪监测滚筒内壁温度范围在280-280-320320。v3.6 3.6 称量：称重米斑蝥，计算收率。称量：称重米斑蝥，计算收率。v3.7 3.7 包装：将米斑蝥定量包装，贴上标签，注明品名、批号、包装：将米斑蝥定量包装，贴上标签，注明品名、批号、生产日期等。生产日期等。v3.8 3.8 清场：生产操作完毕，及时清场，将垃圾妥善处理，确保清场：生产操作完毕，及时清场，将垃圾妥
12、善处理，确保现场没有残留物。现场没有残留物。 米炒斑蝥米炒斑蝥SOP9验证验证 由浙江中医药大学中药饮片厂生产出由浙江中医药大学中药饮片厂生产出9 9批批样品样品，说明本操作规程可行。，说明本操作规程可行。 10第三部分第三部分 斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究近年来相继近年来相继有多篇文章有多篇文章 报道了采用报道了采用HPLCHPLC法测定法测定斑蝥素含量斑蝥素含量 缺点：准确缺点：准确度不高，重度不高，重现性差，使现性差，使用不普及用不普及建立斑蝥建立斑蝥素的素的HPLCHPLC含量测定含量测定方法方法 20052005版药版药典收载斑典收载斑蝥素的含蝥素的含
13、量测定方量测定方法为法为GCGC法法11斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究 药材药材 v大、小净斑蝥大、小净斑蝥 根据根据大小斑蝥的特征大小斑蝥的特征进行挑拣，分档，除去杂质，进行挑拣，分档，除去杂质，其中一份除去头、足、翅，即为大、小生斑蝥。粉碎成粗粉，备其中一份除去头、足、翅，即为大、小生斑蝥。粉碎成粗粉，备用。用。v头、足、内外翅头、足、内外翅 因小斑蝥饮片的头、足、内外翅不易剥离，因小斑蝥饮片的头、足、内外翅不易剥离，故选故选大斑蝥进行各部位的剥离，大斑蝥进行各部位的剥离，粉碎成粗粉，备用。粉碎成粗粉，备用。v米炒斑蝥米炒斑蝥 取净
14、斑蝥与米置锅内，用文火加热，拌炒至米呈黄棕取净斑蝥与米置锅内，用文火加热，拌炒至米呈黄棕色，取出，去米。每色，取出，去米。每100g100g斑蝥，用米斑蝥，用米20g20g。规定药材温度规定药材温度110110，加热加热2min2min。粉碎成粗粉，备用。粉碎成粗粉，备用。12斑蝥各部位重量比例表斑蝥各部位重量比例表样品样品头重头重% %足重足重% %内翅内翅重重% %外翅重外翅重% %头、足、翅总头、足、翅总重重% %胸腹部胸腹部重重% %1 15.805.808.278.271.951.9513.1913.1929.2129.2169.6269.622 25.815.819.169.161
15、.581.5810.2510.2526.8026.8071.8271.823 36.196.197.367.362.272.2712.6312.6328.4528.4570.5270.524 45.635.637.357.351.741.7410.2610.2624.9824.9874.3174.315 55.425.428.388.381.781.7810.2210.2225.8025.8073.7973.796 67.397.3911.2411.242.262.2611.3311.3332.2232.2266.7966.797 77.967.968.178.172.312.3111.891
16、1.8930.3330.3367.8867.88平均重量平均重量比例比例% %6.316.318.568.561.981.9811.4011.4028.2628.2670.6870.6813含量测定结果含量测定结果 斑蝥中斑蝥中头足翅总重仅占头足翅总重仅占28.26%28.26%，而其所含，而其所含斑蝥素在斑蝥素在生品中占生品中占0.16%0.16%，且头足翅很，且头足翅很难完全粉碎，临床不去头足难完全粉碎，临床不去头足翅易引起病人恶心呕吐，故翅易引起病人恶心呕吐，故可以可以认为其为非药用部位。认为其为非药用部位。 通过比较可知，通过比较可知，斑蝥素斑蝥素含量：生斑蝥饮片含量：生斑蝥饮片斑蝥药
17、斑蝥药材材米炒斑蝥。米炒斑蝥。这说明这说明米炒米炒炮制使斑蝥中的斑蝥素含量炮制使斑蝥中的斑蝥素含量减少，毒性降低，减少，毒性降低，同时由于同时由于头足翅中斑蝥素含量较低，头足翅中斑蝥素含量较低，导致同等重量下斑蝥药材中导致同等重量下斑蝥药材中的含量低于生斑蝥饮片中斑的含量低于生斑蝥饮片中斑蝥素含量。蝥素含量。 南方大斑蝥和黄黑小斑南方大斑蝥和黄黑小斑蝥中斑蝥素含量相差不明显，蝥中斑蝥素含量相差不明显，故可将两者一起炮制。故可将两者一起炮制。 14第四部分第四部分 斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究文献报道认为芫菁科豆芫菁属、斑芫菁属昆文献报道认为芫菁科豆芫菁属、斑
18、芫菁属昆虫中含有的斑蝥素分为虫中含有的斑蝥素分为游离和结合两部分游离和结合两部分，并且总斑蝥素远远高于游离斑蝥素的含量。并且总斑蝥素远远高于游离斑蝥素的含量。 05版药典规定的氯仿直接浸提法，没有得到总斑蝥素的含量 结合斑蝥素在结合斑蝥素在酸水解条件下酸水解条件下还原为游离的还原为游离的斑蝥素斑蝥素通过预试验，证明斑蝥中不仅含有氯仿浸提的通过预试验，证明斑蝥中不仅含有氯仿浸提的游离斑蝥素，还含有酸水解提取的结合斑蝥素。游离斑蝥素，还含有酸水解提取的结合斑蝥素。 药材及饮片中药材及饮片中总斑蝥素的研究总斑蝥素的研究15总斑蝥素总斑蝥素提取方法的考察提取方法的考察0.5mol/LH0.5mol/L
19、H2 2SOSO4 4溶溶液调液调PHPH至至2 2左右左右样品粗样品粗粉粉0.4g0.4g蒸馏水蒸馏水10ml10ml提取液提取液上清液上清液离心离心7070水浴水浴加热加热30min30min酸液酸液至分液漏斗至分液漏斗至蒸发皿至蒸发皿5050水浴挥干水浴挥干甲醇定容至甲醇定容至5ml容量瓶容量瓶超声超声15min15min氯仿萃取氯仿萃取4 4次次第一法第一法16超声处理超声处理1515分钟分钟静置静置26h26h样品粗样品粗粉粉0.4g0.4g三氯甲烷三氯甲烷10ml10ml提取液提取液至分液漏斗至分液漏斗至蒸发皿至蒸发皿5050水浴挥干水浴挥干甲醇定容至甲醇定容至5ml容量瓶容量瓶盐
20、酸溶液（盐酸溶液（PH=1PH=1）10ml10ml氯仿萃取氯仿萃取4 4次次静置静置26h26h超声处理超声处理1515分钟分钟第二法第二法第三法第三法第四法第四法17结果结果 将上述四种方法所得供试品溶液，按色谱条件进样，计将上述四种方法所得供试品溶液，按色谱条件进样，计算各样品中总斑蝥素的含量。算各样品中总斑蝥素的含量。提取方法提取方法第一法第一法第二法第二法第三法第三法第四法第四法总斑蝥素含量总斑蝥素含量（% %）1.371.371.601.601.601.601.611.61 为使斑蝥素转移完全，对该法中三氯甲烷的萃取次数为使斑蝥素转移完全，对该法中三氯甲烷的萃取次数及洗涤次数进行考
21、察，结果表明，萃取五次和洗涤五次转及洗涤次数进行考察，结果表明，萃取五次和洗涤五次转移完全。移完全。 按照该法对药渣进行提取，提取液中未检测到斑蝥素，按照该法对药渣进行提取，提取液中未检测到斑蝥素，表明提取完全。表明提取完全。18第四法正交设计实验考察第四法正交设计实验考察水平水平因素因素A A盐盐酸酸PHPHB B超声功率超声功率(W)(W)C C 超声超声时间时间（minmin）D D 三三氯氯甲甲烷烷用量用量（mlml）1 12 23 3PH=1PH=1PH=2PH=2PH=3PH=3300 300 400400500500101015152020101020203030因素水平表因素水
22、平表 通过预试验，分别对通过预试验，分别对盐酸盐酸PHPH值、超声功率、超声时间、值、超声功率、超声时间、三氯甲烷用量三氯甲烷用量四个因素，选用四个因素，选用L L9 9（3 34 4）正交试验表对酸水解）正交试验表对酸水解超声法提取工艺进行筛选优化。超声法提取工艺进行筛选优化。 19总斑蝥素提取方法总斑蝥素提取方法L L9 9（3 34 4）正交实验及实验结果）正交实验及实验结果 实验实验号号因因 素素总斑蝥素含量总斑蝥素含量（% %）A A盐盐酸酸PHPH值值B B超声功率超声功率(W)(W)C C超声超声时间时间（minmin）D D三三氯氯甲甲烷烷用量用量（mlml）1 11 1 (P
23、H=(PH=1)1)1(1(300W)300W)1(1(10min)10min)1(1(10ml)10ml)1.321.322 21 12(2(400W)400W)2(2(15min)15min)2(2(20ml)20ml)1.291.293 31 13(3(500W)500W)3(3(20min)20min)3(3(30ml)30ml)1.511.514 42 2 (PH=(PH=2)2)1 12 23 31.431.435 52 22 23 31 11.001.006 62 23 31 12 21.311.317 73 3 (PH=(PH=3)3)1 13 32 20.390.398 83
24、 32 21 13 30.440.449 93 33 32 21 10.410.41K1K14.12 4.12 3.14 3.14 3.07 3.07 2.73 2.73 K2K23.74 3.74 2.73 2.73 3.13 3.13 2.99 2.99 K3K31.24 1.24 3.23 3.23 2.90 2.90 3.38 3.38 SjSj1.63 1.63 0.05 0.05 0.01 0.01 0.07 0.07 总和总和9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.20 9.109.1020方方 差差 分分 析析 表表 方差来源方差来源离差平方和
25、离差平方和自由度自由度均值均值F F值值显显著性著性A A1.6321 1.6321 2 2 0.8160 0.8160 172.00 172.00 *B B0.0474 0.0474 2 2 0.0237 0.0237 4.99 4.99 D D0.0714 0.0714 2 2 0.0357 0.0357 7.52 7.52 误差误差C C0.0095 0.0095 2 2 0.0047 0.0047 综合考虑确定总斑蝥素最佳工艺为：综合考虑确定总斑蝥素最佳工艺为：A A1 1B B2 2C C2 2D D1 1。即：取三氯甲烷和即：取三氯甲烷和 PH=1PH=1的盐酸溶液各的盐酸溶液各1
26、0ml10ml，超声，超声处理（功率处理（功率100W100W，频率，频率40kHz40kHz）1515分钟。分钟。 21验证验证 分别取同批次斑蝥药材样品粗粉分别取同批次斑蝥药材样品粗粉0.3g0.3g各各3 3份，精密称份，精密称定，按优选的提取工艺提取总斑蝥素，定，按优选的提取工艺提取总斑蝥素，结果得各批次含量结果得各批次含量的相对平均偏差为的相对平均偏差为0.76%，证明总斑蝥素采用此提取工艺，证明总斑蝥素采用此提取工艺提取可行。提取可行。 斑蝥素是一种酸酐，能与体内的斑蝥素是一种酸酐，能与体内的Na,MgNa,Mg等金属元素结合，形成斑蝥等金属元素结合，形成斑蝥素钠盐或镁盐等。这些素
27、钠盐或镁盐等。这些斑蝥酸的结合物在酸性环境中能够游离出斑蝥斑蝥酸的结合物在酸性环境中能够游离出斑蝥酸或者斑蝥素酸或者斑蝥素，故，故采用酸水解的方法提取总斑蝥素采用酸水解的方法提取总斑蝥素。 实验过程中发现实验过程中发现斑蝥药材粉末总是在酸水层，不在氯仿层，故可斑蝥药材粉末总是在酸水层，不在氯仿层，故可以采用萃取的方式分取氯仿层提取液以采用萃取的方式分取氯仿层提取液。并采用正交实验设计优选出总。并采用正交实验设计优选出总斑蝥素的提取工艺。斑蝥素的提取工艺。 22斑蝥不同部位及米炒前后总斑蝥素含量比较研究斑蝥不同部位及米炒前后总斑蝥素含量比较研究 药材药材 斑蝥药材、米炒斑蝥及斑蝥头、足、内外翅部
28、分样品斑蝥药材、米炒斑蝥及斑蝥头、足、内外翅部分样品同同“第二部分实验第二部分实验3 3中样品中样品”。供试品溶液的制备供试品溶液的制备按照实验按照实验1 1中优选提取工艺制备中优选提取工艺制备色谱条件色谱条件 流动相：甲醇水流动相：甲醇水(23:77)(23:77)，流速流速1.0ml/min1.0ml/min，检测波长，检测波长230nm230nm，柱温：，柱温：3030精密称取斑蝥素对照品精密称取斑蝥素对照品2.18mg2.18mg，置，置2ml2ml容量瓶内，少量甲醇容量瓶内，少量甲醇超声使溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，备用。超声使溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，备用。 对照品溶液的制备对照
29、品溶液的制备23含量测定结果含量测定结果 斑蝥中斑蝥中头足翅总重占头足翅总重占28.2%28.2%，而其所含总，而其所含总斑蝥素斑蝥素占占0.61%0.61%，含量较低，进一，含量较低，进一步证明步证明其为非药用部位。其为非药用部位。 通过比较可知，总通过比较可知，总斑斑蝥素含量：生斑蝥饮片蝥素含量：生斑蝥饮片斑蝥药材斑蝥药材米炒斑蝥。米炒斑蝥。与与其斑蝥素含量趋势一致。其斑蝥素含量趋势一致。 这说明米炒炮制不但这说明米炒炮制不但使斑蝥素含量减少，而且使斑蝥素含量减少，而且总斑蝥素含量也减少，推总斑蝥素含量也减少，推测结合斑蝥素的存在。测结合斑蝥素的存在。 24第五部分第五部分 斑蝥药材及饮片
30、质量标准研究斑蝥药材及饮片质量标准研究 本次质量标准的制定，共收集本次质量标准的制定，共收集斑蝥药材斑蝥药材1616批次，生斑蝥批次，生斑蝥1010批次，米炒斑蝥批次，米炒斑蝥1515批次批次。 经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定分别为芫青科昆经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定分别为芫青科昆虫南方大斑蝥虫南方大斑蝥Mylabris phalerataMylabris phalerata Pallas Pallas 或黄黑小斑蝥或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Mylabris cichorii Linnaeus Linnaeus 的的干燥体、去除头足翅及杂质的干燥体、去除头足
31、翅及杂质的净制加工品或米炒炮制加工品净制加工品或米炒炮制加工品。 实验实验1.1.样品的收集与鉴定样品的收集与鉴定 25编号编号样品名称样品名称规格等级规格等级批号批号产地产地样品重样品重g g提供单位提供单位1 1斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y080822Y080822贵州贵州200200浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂2 2斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y080820Y080820云南云南200200浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂3 3斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y080821Y080821云南云南200200浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂4 4斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y08
32、1210Y081210不详不详2020陕西中医学院陕西中医学院5 5斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y081212Y081212不详不详3030天津中医药大学天津中医药大学6 6斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y081214Y081214不详不详2525江西中医学院江西中医学院7 7斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y090115Y090115不详不详130130成都中医药大学成都中医药大学8 8南方大斑蝥南方大斑蝥大大Y080418AY080418A不详不详10001000河南中医学院河南中医学院9 9黄黑小斑蝥黄黑小斑蝥小小Y080418BY080418B不详不详10001000河南中医学院河南中医学院1010斑蝥
33、斑蝥大小混装大小混装Y090209Y090209广西广西100.8100.8市售市售1111斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y090210Y090210郑州郑州9797市售市售1212斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y090218Y090218洛阳洛阳96.396.3市售市售1313斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y090221-1Y090221-1禹州禹州1 1100100市售市售1414斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y090221-2Y090221-2禹州禹州2 2100100市售市售1515斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y090221-3Y090221-3安国安国100100市售市售1616斑蝥斑蝥大小混装大小混装Y090
34、221-4Y090221-4亳州亳州100100市售市售斑蝥药材样品来源表斑蝥药材样品来源表26生斑蝥样品来源表生斑蝥样品来源表编编号号样品名称样品名称规格等规格等级级批号批号产地产地样品样品重重（g g）提供单位提供单位1 1生斑蝥生斑蝥统货统货S080822S080822贵州贵州5050浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂2 2生斑蝥生斑蝥统货统货S080820S080820云南云南1 1100100浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂3 3生斑蝥生斑蝥统货统货S080821S080821云南云南2 2100100浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂4 4大生斑蝥大生斑蝥统货统
35、货S080418AS080418A河南河南500500河南中医学院河南中医学院5 5小生斑蝥小生斑蝥统货统货S080418BS080418B河南河南500500河南中医学院河南中医学院6 6生斑蝥生斑蝥统货统货S090115S090115成都成都2020成都中医药大学成都中医药大学7 7生斑蝥生斑蝥统货统货S090221-1S090221-1禹州禹州1 1100100市售市售8 8生斑蝥生斑蝥统货统货S090221-2S090221-2禹州禹州2 2100100市售市售9 9生斑蝥生斑蝥统货统货S090221-3S090221-3安国安国100100市售市售1010生斑蝥生斑蝥统货统货S090
36、221-4S090221-4亳州亳州100100市售市售27米炒斑蝥样品来源表米炒斑蝥样品来源表编编号号样品名称样品名称规格等级规格等级批号批号采购地采购地重量重量/g/g炮制生产单位炮制生产单位净制米炒顺序净制米炒顺序1 1米炒斑蝥米炒斑蝥大小混装大小混装080822080822贵州贵州200200浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂米拌炒去头足翅米拌炒去头足翅2 2米炒斑蝥米炒斑蝥大小混装大小混装080820080820云南云南100100浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂米拌炒去头足翅米拌炒去头足翅3 3米炒斑蝥米炒斑蝥大小混装大小混装080821080821云南云南20020
37、0浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂米拌炒去头足翅米拌炒去头足翅4 4米炒斑蝥米炒斑蝥大小混装大小混装081210081210陕西陕西1515陕西中医学院陕西中医学院去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒5 5米炒斑蝥米炒斑蝥大小混装大小混装081212081212天津天津1212天津中医药大学天津中医药大学去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒6 6米炒斑蝥米炒斑蝥大小混装大小混装081214081214江西江西1212江西中医学院江西中医学院去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒7 7米炒大斑蝥米炒大斑蝥大大080418A080418A河南河南10001000河南中医学院河南中医学院去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒8
38、 8米炒小斑蝥米炒小斑蝥小小080418B080418B河南河南10001000河南中医学院河南中医学院去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒9 9米炒大斑蝥米炒大斑蝥大大090114-1090114-1贵州贵州143.7143.7浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒1010米炒小斑蝥米炒小斑蝥小小090114-2090114-2贵州贵州52.652.6浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒1111米炒大斑蝥米炒大斑蝥大大0901131-10901131-1云南云南67.267.2浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂去头足翅米拌炒去头足翅
39、米拌炒1212米炒小斑蝥米炒小斑蝥小小0901131-20901131-2云南云南41.241.2浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒1313米炒大斑蝥米炒大斑蝥大大0901132-10901132-1云南云南167.1167.1浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒1414米炒小斑蝥米炒小斑蝥小小0901132-20901132-2云南云南64.764.7浙江中医药大学饮片厂浙江中医药大学饮片厂去头足翅米拌炒去头足翅米拌炒1515米炒斑蝥米炒斑蝥大小混装大小混装090221-4090221-4亳州亳州1010亳州市售亳州市售去头足
40、翅米拌炒去头足翅米拌炒28 由于由于斑蝥是毒剧药材，临床用量较少，斑蝥是毒剧药材，临床用量较少，几乎所有中药饮片企几乎所有中药饮片企业在申报业在申报GMPGMP认证过程中均没有上报此生产品种，认证过程中均没有上报此生产品种， 由于由于每次炮制量太小每次炮制量太小，饮片生产企业无法用炒药机进行机械，饮片生产企业无法用炒药机进行机械化生产，无法通过设备控制生产条件。化生产，无法通过设备控制生产条件。 除除浙江中医药大学饮片厂生产的样品和河南中医学院炮制的浙江中医药大学饮片厂生产的样品和河南中医学院炮制的样品样品，我们请各地中医药院校炮制教研室的专家教授们采购，我们请各地中医药院校炮制教研室的专家教
41、授们采购当当地市售米炒品或采购生斑蝥自己加工炮制地市售米炒品或采购生斑蝥自己加工炮制作为样品来源，但鉴作为样品来源，但鉴于斑蝥是毒剧药不能随意购买，因此于斑蝥是毒剧药不能随意购买，因此斑蝥的来源和数量斑蝥的来源和数量受到了受到了限制。限制。29斑蝥药材斑蝥药材 南方大斑蝥南方大斑蝥 体型较大，呈长圆形，长体型较大，呈长圆形，长1.51.52.5cm2.5cm，宽，宽0.50.51cm1cm。头及口器向下垂，有较大的复眼及触角各。头及口器向下垂，有较大的复眼及触角各1 1对，触角对，触角多已脱落。背部具革质鞘翅多已脱落。背部具革质鞘翅1 1 对，黑色，有对，黑色，有3 3条黄色或棕黄色的条黄色或
42、棕黄色的横纹；鞘翅下面有棕褐色薄膜状透明的内翅横纹；鞘翅下面有棕褐色薄膜状透明的内翅2 2 片。胸腹部乌黑片。胸腹部乌黑色，胸部有足色，胸部有足3 3对。有特殊的臭气。对。有特殊的臭气。 黄黑小斑蝥黄黑小斑蝥 体型较小，长体型较小，长1 11.5cm1.5cm。南方大斑蝥南方大斑蝥 黄黑小斑蝥黄黑小斑蝥 伪品斑蝥伪品斑蝥实验实验2.2.斑蝥药材及饮片性状、显微鉴别研究斑蝥药材及饮片性状、显微鉴别研究 性状鉴别性状鉴别30大生斑蝥大生斑蝥 小生斑蝥小生斑蝥生斑蝥生斑蝥 南方大斑蝥南方大斑蝥 体型较大，头足翅偶有残留。头部去除后的体型较大，头足翅偶有残留。头部去除后的断面不整齐，边缘黑色，中心土黄
43、色。有特殊的臭气。断面不整齐，边缘黑色，中心土黄色。有特殊的臭气。 黄黑小斑蝥黄黑小斑蝥 体型较小。体型较小。31 米炒斑蝥米炒斑蝥 南方大斑蝥南方大斑蝥 体型较大，头足翅偶有残留。色乌黑发亮，体型较大，头足翅偶有残留。色乌黑发亮，头部去除后的断面不整齐，边缘黑色，中心灰黄色。质脆易碎，头部去除后的断面不整齐，边缘黑色，中心灰黄色。质脆易碎，有米炒后的焦香气。有米炒后的焦香气。 黄黑小斑蝥黄黑小斑蝥 体型较小。体型较小。 32 显微鉴别显微鉴别 刚毛刚毛 横纹肌纤维横纹肌纤维 复眼碎片复眼碎片 体壁碎片体壁碎片 气管壁碎片气管壁碎片主要特征主要特征 由于米炒斑蝥与生斑蝥、斑蝥药材均为动物昆虫，
44、其基由于米炒斑蝥与生斑蝥、斑蝥药材均为动物昆虫，其基本组织相同，没有根本区别，显微鉴别很难区分，故没有收本组织相同，没有根本区别，显微鉴别很难区分，故没有收载显微鉴别项。载显微鉴别项。33 因因20052005年版药典方法提取时间较长，取样量较多易出现年版药典方法提取时间较长，取样量较多易出现脱尾等，故对脱尾等，故对20052005版药典版药典TLCTLC鉴别供试品溶液制备方法进行如鉴别供试品溶液制备方法进行如下考察：下考察： 对提取方法的选择对提取方法的选择 从左至右从左至右: : 1 1、斑蝥素、斑蝥素5ul5ul； 2 2、3 3、20052005药典法提取样品；药典法提取样品； 4 4
45、、斑蝥素、斑蝥素3ul 3ul 5 5、6 6、超声法提取样品、超声法提取样品 超声法时间短、更便捷，故采用超声提取法。超声法时间短、更便捷，故采用超声提取法。实验实验3.3.斑蝥药材及饮片斑蝥药材及饮片TLCTLC鉴别鉴别34对取样量的选择对取样量的选择从左至右：从左至右：1 1 、2 2、3 3 、4 3g4 3g样品；样品；5 5、斑蝥素、斑蝥素5ul5ul； 6 6、7 2g7 2g样品样品 取样量为取样量为3g3g者，色谱中有拖尾现象，故将取样量减少为者，色谱中有拖尾现象，故将取样量减少为2g2g。35对石油醚沸程的选择对石油醚沸程的选择从左至右：从左至右：1 1、6 6、斑蝥素、斑
46、蝥素5ul5ul；2 2、3 3、石油醚（、石油醚（60609090）4 4、5 5、石油醚（、石油醚（30306060） 两种石油醚对斑蝥素斑点的分离度、拖尾情况均无影响，两种石油醚对斑蝥素斑点的分离度、拖尾情况均无影响，但石油醚（但石油醚（30306060）挥发性较好，故仍选用石油醚（）挥发性较好，故仍选用石油醚（30306060）。）。 36 取本品粉末取本品粉末2g2g，加三氯甲烷加三氯甲烷20ml20ml，超声处理（功率，超声处理（功率400W400W，频率频率40KHz40KHz）1515分钟，分钟，滤过，滤液蒸干，残渣用石油醚（滤过，滤液蒸干，残渣用石油醚（30306060）洗）
47、洗2 2次，每次次，每次5ml5ml，小心倾去上清液，残渣加三氯甲烷，小心倾去上清液，残渣加三氯甲烷1ml1ml使溶解，作为供试品溶液。使溶解，作为供试品溶液。供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取斑蝥素对照品取斑蝥素对照品, ,加三氯甲烷制成每加三氯甲烷制成每1ml1ml含含5mg 5mg 的溶液，的溶液，作为对照品溶液。作为对照品溶液。对照品溶液的制备对照品溶液的制备37 考察了不同展距对薄层斑点的考察了不同展距对薄层斑点的RfRf值的影响，值的影响，为使为使其适中故选择其展距为其适中故选择其展距为8cm8cm。 8cm6cm5cm对展距的选择对展距的选择 展开展开展开剂：三氯甲烷丙酮展开剂
48、：三氯甲烷丙酮(49:1)(49:1) 显色剂：显色剂：0.10.1 溴甲酚绿乙醇溶液溴甲酚绿乙醇溶液38TLCTLC耐用性考察耐用性考察薄层板的选择薄层板的选择 分别对青岛海洋化工厂生产的分别对青岛海洋化工厂生产的预制板（预制板（10*20cm10*20cm）、手工铺制）、手工铺制板（板（10*20cm10*20cm）、手工铺制板（）、手工铺制板（10*10cm10*10cm）进行考察，各板薄层进行考察，各板薄层斑点的分离度及拖尾情况良好。因选择展距为斑点的分离度及拖尾情况良好。因选择展距为6cm6cm，故，故选用宽选用宽度为度为10cm10cm的预制板的预制板。 青岛海洋预制板青岛海洋预制
49、板（10*20cm） 手工铺板（手工铺板（10*20cm） 手工铺板（手工铺板（10*10cm） 39湿度的考察湿度的考察 根据硫酸根据硫酸- -水溶液相对湿度表，配制水溶液相对湿度表，配制58.9%58.9%、26.2%26.2%浓度的浓度的硫酸水溶液，在密闭的干燥器中分别造成相对湿度为硫酸水溶液，在密闭的干燥器中分别造成相对湿度为20%20%、80%80%的环境，的环境，在不同湿度下薄层斑点的分离度及拖尾情况良好。在不同湿度下薄层斑点的分离度及拖尾情况良好。 不同不同浓浓度的硫酸水溶液度的硫酸水溶液相对湿度相对湿度% %202035358080硫酸浓度硫酸浓度% %58.958.951.0
50、51.026.226.2水溶液相对密度水溶液相对密度d d4 425251.481.481.401.401.191.1920%36%80%40温度的考察温度的考察 分别在分别在441010（冰箱）、室温（冰箱）、室温条件下展开，条件下展开，在不同温度下主斑点的分离度及拖尾情况良好在不同温度下主斑点的分离度及拖尾情况良好。 441010（冰箱）（冰箱） 1919（室温）（室温） 41 斑蝥有芫青科昆虫南方大斑蝥斑蝥有芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerataMylabris phalerata Pallas Pallas 或黄黑小斑蝥或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii
51、Mylabris cichorii Linnaeus Linnaeus 两个品种，故对南两个品种，故对南方大斑蝥和黄黑小斑蝥两个品种样品分别进行鉴别。方大斑蝥和黄黑小斑蝥两个品种样品分别进行鉴别。 从左至右：从左至右：1 1、云南、云南1 1斑蝥药材；斑蝥药材；2 2、云南、云南2 2 米炒斑蝥；米炒斑蝥； 3 3、斑蝥素；、斑蝥素；4 4、 生小斑蝥；生小斑蝥； 5 5、米炒小斑蝥；、米炒小斑蝥；6 6、生大斑蝥；、生大斑蝥；7 7、米炒大斑蝥、米炒大斑蝥 结果显示这两个品种的鉴别情况一致。结果显示这两个品种的鉴别情况一致。 多来源品种的鉴别多来源品种的鉴别 42定性鉴别定性鉴别 精密吸取上
52、述斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥各批样品的供精密吸取上述斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥各批样品的供试品溶液及斑蝥素对照品溶液各试品溶液及斑蝥素对照品溶液各5l,5l,分别点于同一硅胶分别点于同一硅胶G G薄层薄层板上。板上。 以氯仿以氯仿: :丙酮丙酮(49:1)(49:1)为展开剂，展开，展距为展开剂，展开，展距6cm6cm，晾干，喷，晾干，喷以以0.1%0.1%溴甲酚绿乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。溴甲酚绿乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。 供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的斑点。斑点。 斑蝥药材定性鉴别（从左至右斑蝥药材定性鉴别（从左
53、至右斑蝥药材定性鉴别（从左至右斑蝥药材定性鉴别（从左至右1 1 1 17 7 7 7为各批斑蝥药材为各批斑蝥药材为各批斑蝥药材为各批斑蝥药材 8 8 8 8为斑蝥素）为斑蝥素）为斑蝥素）为斑蝥素）43生斑蝥定性鉴别（从左至右生斑蝥定性鉴别（从左至右生斑蝥定性鉴别（从左至右生斑蝥定性鉴别（从左至右1 1 1 16 6 6 6为各批生斑蝥为各批生斑蝥为各批生斑蝥为各批生斑蝥 7 7 7 7为斑蝥素）为斑蝥素）为斑蝥素）为斑蝥素） 44米炒斑蝥饮片定性鉴别米炒斑蝥饮片定性鉴别米炒斑蝥饮片定性鉴别米炒斑蝥饮片定性鉴别（从左至右（从左至右（从左至右（从左至右1 1 1 110101010为各批米炒斑蝥为
54、各批米炒斑蝥为各批米炒斑蝥为各批米炒斑蝥 11111111为斑蝥素为斑蝥素为斑蝥素为斑蝥素 1212121213131313为大、为大、为大、为大、小斑蝥小斑蝥小斑蝥小斑蝥 1414141415151515为大、小米炒斑蝥）为大、小米炒斑蝥）为大、小米炒斑蝥）为大、小米炒斑蝥） 根据要求对根据要求对TLCTLC鉴别进行耐用性考察，其结果稳定，重现鉴别进行耐用性考察，其结果稳定，重现性高，故质量标准中均收载性高，故质量标准中均收载TLCTLC鉴别项。鉴别项。 但该但该TLCTLC色谱条件下，仅显斑蝥素色谱点，成分较单一，色谱条件下，仅显斑蝥素色谱点，成分较单一，无无法区别斑蝥药材、生斑蝥与米炒斑
55、蝥法区别斑蝥药材、生斑蝥与米炒斑蝥。 45按照中国药典附录按照中国药典附录 K K灰分测定法对各批次样品进行灰分测定法对各批次样品进行总灰分总灰分及酸不溶灰分及酸不溶灰分测定。测定。 实验实验4.4.斑蝥药材及饮片水分、灰分和浸出物含量检查斑蝥药材及饮片水分、灰分和浸出物含量检查按照中国药典附录按照中国药典附录 H H水分测定法第三法减压干燥法对各水分测定法第三法减压干燥法对各批次样品进行批次样品进行水分水分的测定。的测定。按照中国按照中国药药典附典附录录AA浸出物浸出物测测定法中冷浸法定法中冷浸法测测定各批次定各批次样样品品的的水溶性浸出物、醇溶性浸出物水溶性浸出物、醇溶性浸出物。4647
56、因因斑蝥及米炒斑蝥为毒剧药材，不入汤剂多入丸散，且其有效成分斑斑蝥及米炒斑蝥为毒剧药材，不入汤剂多入丸散，且其有效成分斑蝥素易升华蝥素易升华，在浸出物测定中，干燥过程使斑蝥素升华，因此，无论醇浸，在浸出物测定中，干燥过程使斑蝥素升华，因此，无论醇浸出物、还是水浸出物都不包含游离斑蝥素成分，故出物、还是水浸出物都不包含游离斑蝥素成分，故未对其浸出物的含量进未对其浸出物的含量进行限度要求。行限度要求。 斑蝥作为斑蝥作为生长在植物叶片上的成虫，不易掺附杂质生长在植物叶片上的成虫，不易掺附杂质，并且，并且经净制（去经净制（去头足翅）和炒制后灰分含量没有明显改变头足翅）和炒制后灰分含量没有明显改变，酸不
57、溶性灰分含量有些降低但，酸不溶性灰分含量有些降低但并不稳定，因而在质量标准中并不稳定，因而在质量标准中未将灰分、酸不溶灰分的检查作为检查项目。未将灰分、酸不溶灰分的检查作为检查项目。 斑蝥中所斑蝥中所含斑蝥素具有升华性，含斑蝥素具有升华性，8484即开始升华，即开始升华，故无法用烘干法测故无法用烘干法测定其水分；甲苯法要求样品量较多（取样量要约含有定其水分；甲苯法要求样品量较多（取样量要约含有1 14ml4ml水分，而米斑水分，而米斑蝥为炒制品，水分含量较低，样品需要几十克）；由于是毒剧药，一般使蝥为炒制品，水分含量较低，样品需要几十克）；由于是毒剧药，一般使用单位采购量、库存量均少，本次浙江
58、中医药大学饮片厂所提供的三批样用单位采购量、库存量均少，本次浙江中医药大学饮片厂所提供的三批样品，其中一批为品，其中一批为100g100g，用甲苯法测定其水分含量样品量就显不足；气相法，用甲苯法测定其水分含量样品量就显不足；气相法测定需要专门的仪器设备；最后测定需要专门的仪器设备；最后选用减压干燥法测定各批次样品的水分含选用减压干燥法测定各批次样品的水分含量，结果证明斑蝥中水分含量较低，量，结果证明斑蝥中水分含量较低，但减压干燥法本身准确度不高，因此但减压干燥法本身准确度不高，因此质量标准中质量标准中均不设水分限度检查均不设水分限度检查。48色谱条件色谱条件对照品溶液的制备对照品溶液的制备 精
59、密称取斑蝥素对照品精密称取斑蝥素对照品2.18mg2.18mg，置，置2ml2ml容量瓶内，加甲醇至容量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，备用。刻度，摇匀，备用。实验实验5.5.斑蝥药材及饮片斑蝥素、总斑蝥素含量测定斑蝥药材及饮片斑蝥素、总斑蝥素含量测定流动相：甲醇水流动相：甲醇水(23:77)(23:77)，流速流速1.0ml/min1.0ml/min，检测波长，检测波长230nm230nm，柱温：，柱温：3030供试品溶液的制备供试品溶液的制备斑蝥素斑蝥素 取本品粉末约取本品粉末约1g1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密称定，置具塞锥形瓶中，用三氯甲烷作溶剂，用三氯甲烷作溶剂，超声处理（功率超声处
60、理（功率400W400W，频率，频率40kHz40kHz）2 2次（次（30ml30ml，30ml30ml），每次），每次1515分钟分钟，提取，提取液滤过，用少量三氯甲烷分次洗涤容器，滤液和洗液滤入同一蒸发皿中，挥液滤过，用少量三氯甲烷分次洗涤容器，滤液和洗液滤入同一蒸发皿中，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀, ,即得。即得。49总斑蝥素总斑蝥素 取本品粗粉约取本品粗粉约0.3g0.3g，精密称定，置，精密称定，置50ml50ml具塞锥形瓶中，具塞锥形瓶中，加三氯甲加三氯甲烷烷10ml,10ml,再加盐
61、酸溶液（再加盐酸溶液（PH=1PH=1）10ml10ml，超声处理（功率，超声处理（功率400W400W，频率，频率40kHz40kHz）1515分钟分钟，置，置分液漏斗中，分取三氯甲烷层，分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取酸液再用三氯甲烷振摇提取5 5次次（10ml,10ml,5ml,3ml,3ml10ml,10ml,5ml,3ml,3ml），残渣和容器用三氯甲烷洗涤），残渣和容器用三氯甲烷洗涤5 5次，每次次，每次3ml3ml，合，合并三氯甲烷液，抽滤，容器用三氯甲烷洗涤并三氯甲烷液，抽滤，容器用三氯甲烷洗涤5 5次，每次次，每次3ml3ml，滤液和洗液置同，滤液和洗液置
62、同一蒸发皿中，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至一蒸发皿中，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。摇匀，即得。 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l10l，注入液相色谱仪，测，注入液相色谱仪，测定，即得。定，即得。含量测定含量测定供试品溶液的制备供试品溶液的制备5051 根据以上实验测定结果，将斑蝥药材斑蝥素含量计算平均根据以上实验测定结果，将斑蝥药材斑蝥素含量计算平均值，下浮值，下浮20% 20% 为为0.51%0.51%，综合考虑规定，综合考虑规定斑蝥药材中斑蝥素含量斑蝥药材中斑蝥素含量限
63、度标准为不得少于限度标准为不得少于0.50%0.50%； 生斑蝥因去除了重量近生斑蝥因去除了重量近30%30%的头足翅，而头足翅斑蝥素的头足翅，而头足翅斑蝥素含量又很低，因此斑蝥素含量升高，故含量又很低，因此斑蝥素含量升高，故规定其斑蝥素含量规定其斑蝥素含量限度标准为不得少于限度标准为不得少于0.65%0.65%； 将米炒斑蝥饮片斑蝥素含量计算平均值为将米炒斑蝥饮片斑蝥素含量计算平均值为0.54%0.54%，上浮，上浮20%20%，为，为0.65%0.65%，规定，规定米炒斑蝥中斑蝥素应不得高于米炒斑蝥中斑蝥素应不得高于0.650.65、总斑总斑蝥素含量计算平均值为蝥素含量计算平均值为1.42
64、%1.42%，下浮，下浮20%20%为为1.13%1.13%，综合考虑规，综合考虑规定定总斑蝥素以斑蝥素计不得少于总斑蝥素以斑蝥素计不得少于1.0%1.0%。5253第六部分第六部分 碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准的研究碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准的研究 采用采用低浓度的药用氢氧化钠溶液炮制斑蝥低浓度的药用氢氧化钠溶液炮制斑蝥，可以使斑蝥素，可以使斑蝥素在虫体内转化成斑蝥酸钠在虫体内转化成斑蝥酸钠，以达到降低毒性，保留斑蝥抗癌活以达到降低毒性，保留斑蝥抗癌活性的目的，其作用优于米炒法。这也是利用了炮制辅料使毒性性的目的，其作用优于米炒法。这也是利用了炮制辅料使毒性成分结构改变，同时与毒性成分生成
65、盐而使毒性降低的原理。成分结构改变，同时与毒性成分生成盐而使毒性降低的原理。 实验实验1.1.碱制斑蝥饮片的制备及斑蝥素提取工艺研究碱制斑蝥饮片的制备及斑蝥素提取工艺研究54 碱制斑蝥的制备碱制斑蝥的制备 v最优碱制方案为最优碱制方案为A A2 2B B2 2C C3 3，即，即以以6 6倍于原药材量的倍于原药材量的0.75%NaOH0.75%NaOH水溶水溶液，液，50506060浸渍浸渍6 6小时后低温干燥小时后低温干燥。 实验因素水平表实验因素水平表水平水平 因素因素 A B CA B C 浸渍时间浸渍时间 浸渍温度浸渍温度 碱液浓度碱液浓度1 A1 12h B1 301 A1 12h
66、B1 3040 C1 0.25%40 C1 0.25%2 A2 6h B2 502 A2 6h B2 5060 C2 0.50%60 C2 0.50%3 A3 3h B3 703 A3 3h B3 7080 C3 0.75%80 C3 0.75%55样品粗样品粗粉粉0.4g0.4g蒸馏水蒸馏水10ml10ml提取液提取液上清液上清液离心离心7070水浴水浴加热加热30min30min酸液酸液至分液漏斗至分液漏斗至蒸发皿至蒸发皿5050水浴挥干水浴挥干甲醇定容至甲醇定容至5ml容量瓶容量瓶氯仿萃取氯仿萃取4 4次次0.5mol/LH0.5mol/LH2 2SOSO4 4溶溶液调液调PHPH至至2
67、 2左右左右超声超声15min15min振摇振摇10min, 10min, 静置静置5min5min超声法：超声法：振摇法：振摇法： 斑蝥素斑蝥素提取方法的考察提取方法的考察 比较提取方法比较提取方法, ,结果表明超声提取效率最高。结果表明超声提取效率最高。56v超声时间的选择超声时间的选择提取提取时间时间峰面峰面积积5min5min84548584548515min15min91543191543125min25min836809836809 超声法提取工艺的优化超声法提取工艺的优化v超声次数的选择超声次数的选择 提取次数提取次数峰面峰面积积1 1次次9154319154312 2次次102
68、39071023907v浸渍时间的选择浸渍时间的选择 浸浸渍时间渍时间峰面峰面积积0h0h113312011331202h2h9685239685234h4h102588810258886h6h1025816102581657v洗液的选择洗液的选择 洗液洗液平均峰面积平均峰面积石油醚洗提取石油醚洗提取12599461259946石油醚：无水乙醇洗提取石油醚：无水乙醇洗提取921930921930石油醚洗液石油醚洗液3328133281石油醚：无水乙醇洗液石油醚：无水乙醇洗液159959159959 表明石油醚洗提取表明石油醚洗提取效率最高，但石油醚效率最高，但石油醚洗液中仍有斑蝥素的洗液中仍有
69、斑蝥素的存在，故选不用洗液存在，故选不用洗液提取。提取。 超声法提取工艺的确定超声法提取工艺的确定 通过单因素循环法对提取方法、提取次数、提通过单因素循环法对提取方法、提取次数、提取时间、浸渍时间和洗液进行了考察取时间、浸渍时间和洗液进行了考察, ,确定最佳提确定最佳提取工艺为超声取工艺为超声15min15min提取提取2 2次，不浸渍，不用洗液。次，不浸渍，不用洗液。 58 Agilent HC-C18 Agilent HC-C18色谱柱（色谱柱（4.64.6250mm250mm）, , 流动相：甲醇水流动相：甲醇水(30:70)(30:70)， 流速流速1.0ml/min1.0ml/min
70、，检测波长，检测波长230nm230nm，柱温：，柱温：3030。实验实验2.HPLC2.HPLC法测定碱制斑蝥饮片中斑蝥素含量法测定碱制斑蝥饮片中斑蝥素含量 仪器与材料仪器与材料仪器仪器 日本岛津日本岛津LC-2010ATLC-2010AT高效液相色谱仪高效液相色谱仪样品样品 实验室自制碱制斑蝥三批实验室自制碱制斑蝥三批 色谱条件色谱条件59标准曲线的绘制标准曲线的绘制v对照品溶液的制备对照品溶液的制备 精密称取斑蝥素对照品精密称取斑蝥素对照品1.32mg1.32mg，置，置2ml2ml容量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，备用。容量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，备用。 进样量(g)1.322.643.
71、965.286.607.9210.5613.2峰面积分值68754133654192279258388324053388372506555633139 在在1.321.3213.2g13.2g范围范围内线性关系良好，回归方内线性关系良好，回归方程为程为 Y=47532X+7443.7Y=47532X+7443.7，R R2 2=0.9998=0.9998。60方法学考察方法学考察稳定性稳定性重复性重复性加样回收率加样回收率精密度精密度RSD=0.3%RSD=0.3%RSD=1.04%RSD=1.04%RSD=3.06%RSD=3.06%RSD=2.7RSD=2.7% %61样品含量测定结果样品
72、含量测定结果实验编号实验编号样品重量样品重量 斑蝥素含量斑蝥素含量 （）（）平均含量（）平均含量（）斑蝥酸钠含量（）斑蝥酸钠含量（） 0807220808040808080.21020.20480.20250.20270.20390.20380.20360.20360.20371.991.991.901.901.961.942.042.052.061.961.932.052.582.542.70含量测定含量测定 精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10l10l，按，按色谱条件进样，计算样品中斑蝥素含量色谱条件进样，计算样品中斑蝥素含量 供试品溶液的制备供试品
73、溶液的制备按照实验按照实验1 1中优选的提取工艺制备中优选的提取工艺制备62斑蝥素标准品色谱图斑蝥素标准品色谱图 碱制斑蝥中斑蝥素色谱图碱制斑蝥中斑蝥素色谱图 以上结果证明，由于采用碱提法提取，斑蝥中总斑蝥素含以上结果证明，由于采用碱提法提取，斑蝥中总斑蝥素含量较高，斑蝥酸钠含量也大大高于游离斑蝥素含量。无疑量较高，斑蝥酸钠含量也大大高于游离斑蝥素含量。无疑碱制斑蝥既能最大限度地保留斑蝥素，提高抗肿瘤活性，碱制斑蝥既能最大限度地保留斑蝥素，提高抗肿瘤活性，同时又能降低毒性。同时又能降低毒性。是斑蝥炮制的较好方法是斑蝥炮制的较好方法。63测定各种无机元素的含量，推测结合斑蝥素的存在形式测定各种无
74、机元素的含量，推测结合斑蝥素的存在形式3本研究证明，本研究证明，斑蝥含有结合斑蝥含有结合状态的斑蝥素状态的斑蝥素，但斑蝥素究竟但斑蝥素究竟是与何种元素是与何种元素结合而存在？结合而存在？ 21斑蝥素是一种斑蝥素是一种酸酐，能与体酸酐，能与体内的内的Na,Mg等等元素结合元素结合，形形成斑蝥素钠盐成斑蝥素钠盐或镁盐等。或镁盐等。 这些这些斑蝥酸斑蝥酸的结合物在的结合物在酸性环境中酸性环境中能够游离出能够游离出斑蝥酸或者斑蝥酸或者斑蝥素斑蝥素。第七部分第七部分 斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究 原子吸收法原子吸收法64 分分别别取各批次取各批次样样品粉末品粉末0.3
75、g0.3g于消解罐中，精密称定，依次于消解罐中，精密称定，依次加入加入浓浓硝酸硝酸6ml6ml，过过氧化氧化氢氢2ml2ml，放入，放入微波消解微波消解仪仪中，按微波消中，按微波消解程序表解程序表进进行消解，待整个消解系行消解，待整个消解系统统冷却后，取出消解罐，打冷却后，取出消解罐，打开罐盖，用少量去离子水吹洗消解罐盖子和杯壁，在开罐盖，用少量去离子水吹洗消解罐盖子和杯壁，在电电炉上蒸炉上蒸发浓缩发浓缩溶液至溶液至约约1 mL1 mL，冷却，将溶液移入容量瓶中，用去离子，冷却，将溶液移入容量瓶中，用去离子水定容至水定容至50mL50mL，作，作为为测测定定铜铜(Cu)(Cu)、锰锰(Mn)(
76、Mn)、铅铅(Pb)(Pb)、镉镉(Cd)(Cd)、砷砷(As)(As)、汞、汞(Hg)(Hg)元素的供元素的供试试品溶液品溶液。 另取上述母液另取上述母液5ml5ml，移入，移入50ml50ml容量瓶中，用去离子水定容容量瓶中，用去离子水定容至刻度，作至刻度，作为为测测定定锌锌(Zn)(Zn)、铁铁(Fe)(Fe)、镁镁(Mg)(Mg)、钙钙(Ca)(Ca)、钾钾(K)(K)元素的供元素的供试试品溶液品溶液。 随同随同试样试样做空白做空白试验试验。Step Step 功率功率(W) Ramp(min) Temp () Hold(min)(W) Ramp(min) Temp () Hold(m
77、in)1 800 5 120 11 800 5 120 12 800 3 150 32 800 3 150 33 800 4 180 253 800 4 180 25 微波消解样品微波消解样品65 分别采用分别采用火焰、石墨炉、氢化物发生火焰、石墨炉、氢化物发生- -冷原子吸收法冷原子吸收法测定铜测定铜(Cu)(Cu)、锰、锰(Mn)(Mn)、锌、锌(Zn)(Zn)、铁、铁(Fe)(Fe)、镁、镁(Mg)(Mg)、钙、钙(Ca)(Ca)、钾、钾(K) (K) ，铅铅(Pb)(Pb)、镉、镉(Cd)(Cd)、砷、砷(As)(As)，汞，汞(Hg) (Hg) 。 方法与结果方法与结果66 标准曲线
78、的绘制标准曲线的绘制 精密吸取各对照品溶液，按照仪器的操作条件，进行测精密吸取各对照品溶液，按照仪器的操作条件，进行测定，进样量定，进样量20l20l，计算线性回归方程和相关系数。，计算线性回归方程和相关系数。 67 含量测定含量测定 精密吸取各供试品溶液，按照仪器的操作条件，进行测精密吸取各供试品溶液，按照仪器的操作条件，进行测定，进样量定，进样量20l20l，计算含量。，计算含量。 68 结果表明，各样品中均含有以上十一种微量元素，且其结果表明，各样品中均含有以上十一种微量元素，且其含含量高低为：量高低为：K KMgMgFeFeCaCaZnZnMnMnCuCuPbPbAsAsHgHgCdC
79、d。 在斑蝥各样品中，在斑蝥各样品中， AsAs、HgHg、PbPb的含量的含量以头足翅最高，斑蝥以头足翅最高，斑蝥药材、生斑蝥次之，米炒斑蝥最低；药材、生斑蝥次之，米炒斑蝥最低； CdCd、K K、ZnZn的含量的含量以生斑蝥最高，斑蝥药材、米炒斑蝥次之，以生斑蝥最高，斑蝥药材、米炒斑蝥次之，头足翅最低；头足翅最低； CuCu、MgMg的含量的含量以米炒斑蝥最高，头足翅最低；以米炒斑蝥最高，头足翅最低； MnMn的含量的含量以斑蝥药材最高，生斑蝥次之，米炒斑蝥和头足以斑蝥药材最高，生斑蝥次之，米炒斑蝥和头足翅约等，最低；翅约等，最低； FeFe的含量的含量以斑蝥药材最高，米炒斑蝥最低；以斑蝥
80、药材最高，米炒斑蝥最低； CaCa的含量的含量以头足翅最高，米炒斑蝥、斑蝥药材次之，生斑以头足翅最高，米炒斑蝥、斑蝥药材次之，生斑蝥最低。蝥最低。69 结合斑蝥素结构的推断结合斑蝥素结构的推断 根据各批次样品中结合斑蝥素的含量，将其百分含量换算根据各批次样品中结合斑蝥素的含量，将其百分含量换算成摩尔含量后，与它们体内成摩尔含量后，与它们体内MgMg、MnMn、CaCa、ZnZn、CuCu、K K微量元素微量元素含量进行相关性研究。含量进行相关性研究。 结果提示斑蝥体内结合斑蝥素可能结果提示斑蝥体内结合斑蝥素可能以斑蝥酸镁、斑蝥酸钾及少以斑蝥酸镁、斑蝥酸钾及少量斑蝥酸锌存在量斑蝥酸锌存在，但还待
81、进一步研究。，但还待进一步研究。70斑蝥素和总斑蝥素含量：生斑蝥饮片斑蝥素和总斑蝥素含量：生斑蝥饮片斑蝥药材斑蝥药材米炒斑蝥。米炒斑蝥。斑蝥素的含量远远小于总斑蝥素的斑蝥素的含量远远小于总斑蝥素的含量。斑蝥头足翅中斑蝥素和总斑蝥素含量较低，含量。斑蝥头足翅中斑蝥素和总斑蝥素含量较低，为非药用部位。为非药用部位。制定米炒斑蝥的制定米炒斑蝥的制定米炒斑蝥的制定米炒斑蝥的SOPSOPSOPSOP，为中药饮片厂执行，为中药饮片厂执行，为中药饮片厂执行，为中药饮片厂执行GMPGMPGMPGMP管理，管理，管理，管理，提供了技术标准。提供了技术标准。提供了技术标准。提供了技术标准。结结结结 论论论论以以以
82、以HPLCHPLCHPLCHPLC法代替法代替法代替法代替GCGCGCGC法，测定斑蝥素和总斑蝥素，法，测定斑蝥素和总斑蝥素，法，测定斑蝥素和总斑蝥素，法，测定斑蝥素和总斑蝥素，控制斑蝥饮片及药材的质量。控制斑蝥饮片及药材的质量。控制斑蝥饮片及药材的质量。控制斑蝥饮片及药材的质量。71结结结结 论论论论建立斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥饮片质量标建立斑蝥药材、生斑蝥及米炒斑蝥饮片质量标准草案，被准草案，被20102010版药典收载。版药典收载。采用原子吸收法首次研究斑蝥中存在的结合斑采用原子吸收法首次研究斑蝥中存在的结合斑蝥素，推测斑蝥体内蝥素，推测斑蝥体内结合斑蝥素可能以斑蝥酸结合斑蝥素可能以斑
83、蝥酸镁、斑蝥酸钾及少量斑蝥酸锌存在镁、斑蝥酸钾及少量斑蝥酸锌存在，但还待进，但还待进一步研究。一步研究。 首次建立碱制斑蝥中斑蝥酸钠提取方法及首次建立碱制斑蝥中斑蝥酸钠提取方法及HPLCHPLC法测定碱制斑蝥中斑蝥酸钠含量测定方法，稳法测定碱制斑蝥中斑蝥酸钠含量测定方法，稳定且重现性佳，可以较好的控制斑蝥碱制品的定且重现性佳，可以较好的控制斑蝥碱制品的质量。质量。 72湖南中医药大学：蒋孟良教授湖南中医药大学：蒋孟良教授陕西中医学院：李景丽、吴建华教授陕西中医学院：李景丽、吴建华教授天津中医药大学：窦志英教授天津中医药大学：窦志英教授江西中医学院：龚千峰教授江西中医学院：龚千峰教授成都中医药大学：胡昌江教授成都中医药大学：胡昌江教授感感谢谢提提供供样样品品支持支持
