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1、流式细胞术的基本原理与流式细胞术的基本原理与应用简介应用简介余琪琪余琪琪12-09-2011流式细胞术流式细胞术n流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry）就是对处在快）就是对处在快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。的技术。Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid流式细胞仪工作原理示意图流式细胞仪可提
2、供的信息流式细胞仪可提供的信息n物理信息：通过散射光信号反映物理信息：通过散射光信号反映n荧光信息：通过荧光信号反映荧光信息：通过荧光信号反映散射光信号的产生散射光信号的产生n488nm激光产生散射光激光产生散射光SSCFSC前向角散射光信号（前向角散射光信号（FSC）侧向角散射光信号（侧向角散射光信号（SSC）利用散射光信号对混合细胞分群利用散射光信号对混合细胞分群n红细胞裂解的全血红细胞裂解的全血荧光信号的产生荧光信号的产生荧光信号的表示方法荧光信号的表示方法双参数点图双参数点图单参数直方图单参数直方图一个完整的流式实验流程一个完整的流式实验流程样品的准备荧光标记的选择对照设置仪器条件的确
3、定数据分析样品准备血液或骨髓标本体液、灌洗液、悬浮培养细胞贴壁细胞组织标本单细胞悬液，浓度单细胞悬液，浓度5 105 1 106/mL样本流速的选择n高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低.n低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。分析。 （注：根据制备样本浓度随时调整流速）（注：根据制备样本浓度随时调整流速）荧光标记抗体的选择尽量使用直标抗体多色标记时应该增加各种抗体的用量或适当延长反应时间根据流式细胞仪的类型及荧光素的光谱选择荧光抗体根据检测物（抗原）表
4、达量选择荧光染料使用双标以上抗体需要做荧光补偿流式细胞仪流式细胞仪n型号：型号：BD FACSCanto IIn光学信号的产生：光学信号的产生：n激光（激光（488nm，633nm）n光学信号的收集：光学信号的收集：n光学滤片光学滤片n光电倍增管（光电倍增管（PMT）：将光信号转换成电信号）：将光信号转换成电信号FACSCantoII的光学滤片的光学滤片长通滤片长通滤片（Longpass，LP）带通滤片带通滤片（Bandpass，BP）LP500500/50750-810nm650-670nmFACSCantoII信号检测组件信号检测组件常见荧光染料的发射波长常见荧光染料的发射波长荧光强度：荧
5、光强度：APCPEPE-Cy7FITCAPCPEPE-Cy7FITC每个通道只能选择一种荧光素每个通道只能选择一种荧光素各个通道之间的荧光素可以随意搭配各个通道之间的荧光素可以随意搭配搭配的荧光素之间的发射光谱重叠尽量小搭配的荧光素之间的发射光谱重叠尽量小对照设置对照设置n阴性对照阴性对照n阳性对照阳性对照n补偿对照补偿对照阴性对照空白对照：即不进行任何标记的细胞。主要用于确定待测标本的基础荧光域值 同型对照：即用同型抗体作平行实验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2。阳性对照阳性对照：阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞
6、（阳性细胞）进行平行实验。通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性补偿对照补偿对照:多色荧光分析，进行荧光补偿 将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，以测定荧光信号的重叠并做适当调整仪器条件的确定仪器条件的确定n电压电压n阈值阈值n荧光补偿（多色分析）荧光补偿（多色分析）电压PMT将光信号转换成电信号，调整将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，的电压，信号强度将随之改变。信号强度将随之改变。放大器两种放大方式：线性放大（lin）对数放大（log）光信号光电倍增管（PMT）放大器电信号线性放大（线性放大（linlin）按光强度的线性关系输出信号（FSC、
7、SSC、细胞周期检测等）对数放大（对数放大（loglog）按光强度的对数关系输出信号，用于大多数荧光染色实验阈值（阈值（threshholdthreshhold）屏蔽噪音信号和碎片信号荧光补偿荧光补偿采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差补偿公式补偿公式通常干扰光占该染料所发出荧光总量的通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%。RD1-X%FITC补偿模型补偿模型PE-X%FITC横平竖直补偿调整的实验过程补偿调整的实验过程样本准备：阴性样本，单阳性样本样本准备：阴性样本，单阳性样本调整：第一步：阴性样本调整所有调整：第一步：阴性样本调整所有
8、PMT 第二步：单阳性样本调整补偿第二步：单阳性样本调整补偿自动调补偿自动调补偿手动调补偿手动调补偿判断标准：横平竖直判断标准：横平竖直数据分析数据显示方式：单参数直方图 二维散点图 二维等高线图 假三维图 三维图 列表模式设门：在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析。单参数直方图单参数直方图 双参数点图双参数点图 二维等高图二维等高图Pseudo 3D Plot3D Plot 密度图密度图 假三维图假三维图 三维图三维图 设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数流式细胞术的应用细胞生理学研究（细胞相对大小和颗粒性、胞内pH值检测、Ca2+流动性检测、膜电势检测、细胞活性检测、细胞活力的检测）细胞膜表面标记胞内标记细胞周期分析凋亡分析CBA （Cytometric Bead Array）谢谢 谢！谢！
