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1、微生物实验室颜小平颜小平 自贡三院自贡三院1.生物安全防护实验室w在以微生物为实验（检测）对象的实验工作中，针对微生物危害程度建设的可以预防生物危害，保障工作人员自身和临近安全的实验室称为生物安全防护实验室。生物安全防护三原则w实验室生物安全防护的内容包括：安全设备、个体防护装置和措施（一级防护）实验室的特殊设计和建设要求（二级防护）严格的管理制度和标准化的操作程序和规程术语和定义术语和定义2.1 生物因子生物因子biological agents 一切微生物和生物活性物质一切微生物和生物活性物质2.2 病原体病原体pathogens 可使人、动物或植物致病的生物因子。可使人、动物或植物致病的
2、生物因子。2.3 危险废弃物危险废弃物hazardous waste 有有潜潜在在生生物物危危险险、可可燃燃、易易燃燃、腐腐蚀蚀、有有毒毒、放放射和起破坏作用的对人、环境有害的一切废弃物。射和起破坏作用的对人、环境有害的一切废弃物。2.4 危害危害risk 伤害发生的概率及其严重性的综合。伤害发生的概率及其严重性的综合。2.5 气溶胶气溶胶aerosols 悬悬浮浮于于气气体体介介质质中中的的粒粒径径一一般般为为0.001100的的固固态态或或液液态态微微小小粒粒子子形形成成的的相相对对稳稳定定的的分分散散体系。体系。2.6 生物安全生物安全 biosafety避避免免危危险险生生物物因因子子
3、造造成成实实验验室室人人员员暴暴露露、向向实实验验室室外外扩散并导致危害的综合措施。扩散并导致危害的综合措施。2.7 高效空气过滤器高效空气过滤器 high efficiency particulate air filter(HEPA)通通常常以以滤滤除除大大于于等等于于0.3微微粒粒为为目目的的，滤滤除除效效率率符符合相关要求的过滤器。合相关要求的过滤器。2.8安全罩安全罩 safety hood置置于于实实验验室室工工作作台台或或仪仪器器设设备备上上的的负负压压排排风风罩罩，以以减减少实验室工作者的暴露危险。少实验室工作者的暴露危险。2.9生物安全柜生物安全柜biological safe
4、ty cabinet(BSC)负负压压过过滤滤排排风风柜柜。防防止止操操作作者者和和环环境境暴暴露露于于实实验验过过程程中产生的生物气溶胶。中产生的生物气溶胶。2.10个人防护装备个人防护装备personal protective equipment(PPE)用用于于防防止止人人员员受受到到化化学学和和生生物物等等有有害害因因子子伤伤害害的的器器材材和用品。和用品。2.11 实验室分区实验室分区 laboratory area按按照照生生物物因因子子污污染染概概率率的的大大小小，实实验验室室可可进行合理的分区。进行合理的分区。2.12 缓冲间缓冲间 buffer room设设置置在在清清洁洁区
5、区、半半污污染染区区和和污污染染区区相相临临两两区区之之间间的的缓缓冲冲密密闭闭室室，具具有有通通风风系系统统，其其两两个个门门具具有有互互锁锁功功能能，且且不不能能同同时时处处于于开开启状态。启状态。2.13 气锁气锁air lock 气气压压可可调调节节的的气气密密室室，用用于于连连接接气气压压不不同同的的两两个个相相邻邻区区域域，其其两两个个门门具具有有互互锁锁功功能能，不不能能同同时时处处于于开开启启状状态态。在在实实验验室室中中用用作作特殊通道。特殊通道。危害程度分级危害程度分级根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级。级。 危害等级危
6、害等级（低个体危害，低群体危害）（低个体危害，低群体危害）不不会会导导致致健健康康工工作作者者和和动动物物致致病病的的细细菌菌、真真菌菌、病病毒毒和寄生虫等生物因子。和寄生虫等生物因子。 危害等级危害等级（中等个体危害，有限群体危害）（中等个体危害，有限群体危害）能能引引起起人人或或动动物物发发病病，但但一一般般情情况况下下对对健健康康工工作作者者、群群体体、家家畜畜或或环环境境不不会会引引起起严严重重危危害害的的病病原原体体。实实验验室室感感染染不不导导致致严严重重疾疾病病，具具备备有有效效治治疗疗和和预预防防措措施施，并且传播风险有限。并且传播风险有限。危害程度分级危害程度分级 危害等级危
7、害等级（高个体危害，低群体危害）（高个体危害，低群体危害） 能能引引起起人人类类或或动动物物严严重重的的疾疾病病，或或造造成成严严重重经经济济损损失失，但但通通常常不不能能因因偶偶然然接接触触而而在在个个体体间间传传播播，或或能能使使用抗生互不、抗寄生虫药治疗的病原体。用抗生互不、抗寄生虫药治疗的病原体。 危害等级危害等级（高个体危害，高群体危害）（高个体危害，高群体危害）能能引引起起人人类类或或动动物物非非常常严严重重的的疾疾病病，一一般般不不能能治治愈愈，容容易易直直接接、间间接接或或因因偶偶然然接接触触在在人人与与人人，或或动动物物与与人人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。或人与
8、动物，或动物与动物间传播的病原体。生物危害评估生物危害评估 当当实实验验室室活活动动涉涉及及传传染染或或潜潜在在传传染染性性生生物物因因子子时时，应应进进行行危危害害程程度度评评估估。危危害害程程度度评评估估应应至至少少包包括括下下列列内内容容：生生物物因因子子的的种种类类（已已知知的的、未未知知的的、基基因因修修饰饰的的或或未未知知传传染染性性的的生生物物材材料料）、来来源源、传传染染性性、致致病病性性、传传播播途途径径、在在环环境境中中的的稳稳定定性性、感感染染剂剂量量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。浓度、动物实验数据、预防和治疗。 危危害害程程度度评评估估应应由由适适当当的的有有经经验
9、验的的专专业业人员进行。人员进行。 防护屏障和生物安全水平分级防护屏障和生物安全水平分级5.1 防护屏障防护屏障5.1.1 一级防护屏障一级防护屏障实验室的生物安全柜和个人防护装备等构成的防护屏障。实验室的生物安全柜和个人防护装备等构成的防护屏障。5.1.2 二级防护屏障二级防护屏障实验室的设施结构和通风系统等构成的防护屏障。实验室的设施结构和通风系统等构成的防护屏障。5.2 生物安全水平分级生物安全水平分级 根根据据所所操操作作的的生生物物因因子子的的危危害害程程度度和和采采取取的的防防护护措措施施，将将生生物物安安全全防防护护水水平平（biosafety level, BSL）分分为为4级
10、级，I级级防防护护水水平平最最低低，级级防防护护水水平平最最高高。以以BSL1、BSL2、BSL3、BSL4表表示示实实验验室室的的相相应应生生物物安安全全防防护护水水平平；以以ABSL1、ABSL2、ABSL3、ABSL4表表示示动动物物实实验验室室的的相相应生物安全防护水平。应生物安全防护水平。生物安全柜的分级 I 级生物安全柜 class I biosafety cabinet 至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作时柜正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察,下部为操作窗口.外部空气由操作窗口吸进,而不可能由操作窗口逸出.工作状态时保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。 级
11、生物安全柜 至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气.工作时正面玻璃推拉窗打开一半，上部为观察窗，下部为操作窗口.外部空气由操作窗口吸进,而不可能由操作窗口逸出。工作状态下遵守操作规程时既保证工作人员不受侵害，也保证实验对象不受污染。 级生物安全柜 至少装置一个高效空气过滤器对排气进行净化，工作空间为经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气。正面上部为观察窗，下部为手套箱式操作口。箱内对外界保持负压.可确保人体与柜内物品完全隔绝。生物安全实验室分级生物安全实验室分级1 没有特殊要求没有特殊要求, 不需要特殊培训。进行一级生物安全实验。不需要特殊培训。
12、进行一级生物安全实验。2 工作人员需要经过培训，配备生物安全柜（工作人员需要经过培训，配备生物安全柜（1级或级或2级），有可能级），有可能发生气溶胶或溢出的实验要求在安全柜内进行。进行二级生物安发生气溶胶或溢出的实验要求在安全柜内进行。进行二级生物安全实验。全实验。3 工工作作人人员员必必须须经经过过特特殊殊培培训训, 配配备备生生物物安安全全柜柜（1级级或或2级级）, 有有感感染染性性材材 料料的的实实验验, 有有可可能能发发生生气气溶溶胶胶或或溢溢出出的的实实验验要要求求在在安安全全柜柜内内 进进 行行 ， 实实 验验 室室 内内 为为 负负 压压, 进进 行行 三三 级级 生生 物物 安
13、安 全全 的的 实实 验验 。4 除除BSL-3的条件外的条件外, 必须是独立的建筑物，生物安全柜为必须是独立的建筑物，生物安全柜为2或或3级，级，进行四级生物安全的实验。进行四级生物安全的实验。实验室标记举例实验室标记举例三级生物安全实验室三级生物安全实验室BSL-3病原体名称病原体名称实验室负责人实验室负责人生物危害标记生物危害标记实验室和微生物的分级w一级生物安全防护实验室一级生物安全防护实验室w 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。包含微生物举例： 大肠杆菌、格鲁伯耐格里原虫、感染性犬肝炎病毒、枯草杆菌等。实
14、验室和微生物的分级w二级生物安全防护实验室二级生物安全防护实验室w 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。包含微生物举例：麻疹病毒、 沙门氏菌 、弓形体、乙型肝炎病毒、衣原体、志贺氏菌。w 三级生物安全防护实验室三级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗和相应的治疗方法。实验室和微生物的分级 艾滋病病毒的研究（血清学实验除外）应在三级生物安全防护实验室中进行。包含微生物举例：结核分枝杆菌 、牛分枝杆菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、热病原体、H
15、IV (血清学检测除外)、澳大利亚立克次氏体、加拿大立克次氏体 。实验室和微生物的分级w四级生物安全防护实验室四级生物安全防护实验室w实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人体具有高度危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。与上述情况类似的不明微生物，也必须在四级生物安全防护实验室中进行。待有充分数据后再决定此种微生物或毒素应在四级还是在较低级别进行。实验室和微生物的分级w实验脊椎动物生物安全防护实验室，其适用微生物范围与同级的一般生物安全防护实验室相同。以ABSL-1、 ABSL-2、 ABSL-3、ABSL-4表示动物实验室的相
16、应生物安全防护水平。生物安全防护实验室基本要求（设施和设备） 一级生物安全防护实验室一级生物安全防护实验室 BSL-1w6.1w1）无需特殊选址，普通建筑物即可，但应有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计。w2）每个实验室应设洗手池，宜设置在靠近出口处。w3）在实验室门口处应设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置。w4）实验室围护结构内表面应易于清洁。地面应防滑、无缝隙，不得铺设地毯。w5）实验台表面应不透水，耐腐蚀、耐热。w6）实验室中的家具应牢固。为易于清洁，各种家具和设备之间应保持一定间隙。应有专门放置生物废弃物容器的台（架）。w7）实验室如有可开启的窗户，应设置纱窗。w8）实验室内应保
17、证工作照明，避免不必要的反光和强光。w9）应有适当的消毒设备。二级生物安全防护实验室二级生物安全防护实验室BSL-2BSL-2w6.2w1）满足6.1的要求w2）实验室门宜带锁、可自动关闭。实验室的门应有可视窗。w3）应有足够的储存空间摆放物品以便使用。在实验室工作区域外还应当有供长期使用的储存空间。w4）在实验室内应使用专门的工作服；戴乳胶手套。w5）在实验室的工作区域外应有存放个人衣物的条件。w6）在实验室所在的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。w7）应在实验室内配备生物安全柜。w8）应设置洗眼装置。必要时应有应急喷淋装置。w9）应通风，如使用窗户自然通风，应有
18、防虫纱窗。w10）有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应设备用电源。w11）实验室出口应有在黑暗中可辨认的标识。总结w生物安全防护实验室：用于检测具有生物危害的标本和材料，通过合理实验室建筑结构和布局，使用一定的防护设备。主要保障工作人员自身不受侵害和周围环境的安全，同时也保证受检标本原有性状。如何建立一个微生物实验室呢如何建立一个微生物实验室呢？ w电热恒温培养箱电热恒温培养箱w 电热鼓风干燥箱电热鼓风干燥箱w 高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅w 电冰箱电冰箱 电子天平电子天平w 生物显微镜生物显微镜 w净化工作台或生物安全柜净化工作台或生物安全柜w 纯水蒸馏
19、水器纯水蒸馏水器w 电热恒温水箱电热恒温水箱w 红外接种环灭菌器红外接种环灭菌器w 离心机离心机w 细菌鉴定分析系统细菌鉴定分析系统 微生物实验室设备配置表微生物实验室设备配置表 w普通光学显微镜w暗视野显微镜w荧光显微镜w倒置显微镜w电子显微镜显微镜显微镜w一一.形态学检查形态学检查w1.不染色标本的检查：标本中的有形成分观察、细菌动力观察（湿片法、悬滴法、毛细管法）临床细菌检验技术与方法临床细菌检验技术与方法w革兰染色（自动染色机）w抗酸染色： 萋-尼染色法（加热） 金永染色法（不需加热） 改良金永染色（1%硫酸脱色3分钟）墨汁荚膜染色法：新型隐球菌瑞氏染色：细菌染成蓝色乳酚棉兰染色2.染
20、色标本的检查染色标本的检查w无菌操作技术 基本要求与无菌技术临床细菌分离培养临床细菌分离培养w接种环及接种针w设施和设备：为达到无菌技术要求而建立的细菌接种场所。w接种和分离方法： 平板划线分离法： 连续划线分离法（含菌量少的标本） 分区划线分离法（含菌量多的标本） 棋盘划线分离法（含菌量多的如：大便标本）接种基本条件接种基本条件w斜面接种法w穿刺接种法w液体接种法w倾注平板法w涂布法w自动接种法接种分离方法接种分离方法w血平板w巧克力平板w麦康凯或中国蓝平板w沙保弱琼脂平板或真菌显色平板wSS平板培养基的选择培养基的选择标本本类型型接种平板接种平板痰液痰液BAP、CAH、SDA脑脊液脊液BA
21、P、CA、SDA、肉、肉汤胸胸腹腹水水（其其它它无无菌菌穿穿刺刺液液）、引流液、引流液BAP、SDA、肉、肉汤尿液尿液BAP（10ul半定量接种）半定量接种）粪便便SS、MAC、BAP目前流行目前流行XLD+EMB分泌物（分泌物（脓液）液）BAP、SDA咽拭子咽拭子BAP宫颈分泌物（阴道分泌物）分泌物（阴道分泌物）BAP、SDAw需氧培养法：又称普通培养法w二氧化碳培养法（肺链、脑膜炎奈瑟、嗜血杆菌属等）（肺链、脑膜炎奈瑟、嗜血杆菌属等）w微需氧培养法（5%氧气、氧气、10%二氧化碳、二氧化碳、85%氮气的气体环境）氮气的气体环境）w厌氧培养法培养的方法和条件培养的方法和条件通过分纯获得待鉴定
22、细菌的纯培养物形态与染色：革兰染色分为四类根据染色性和菌体形态选择鉴定系统；手工法或商品化鉴定系统等细菌鉴定细菌鉴定w国外：手工鉴定系统API、Micro-ID、BD等w国内：珠海DL等商品手工鉴定系统商品手工鉴定系统w双相血培养瓶商品化人工血培养系统商品化人工血培养系统自动化血培养系统自动化血培养系统全自动微生物鉴定和药敏分析系统全自动微生物鉴定和药敏分析系统结核分枝杆菌快速检测系统结核分枝杆菌快速检测系统w教科书w其它工具书推荐的书籍推荐的书籍w要想当一名合格的临床微生物学人 坚实的基础 执着的精神 耐的了寂寞 把每一个细菌都当成是恋人，了解它到细微处！“与临床密切沟通联系，因为我们共同面对的是另一类地球生物-微生物”个人感想：个人感想：Thanks！
