基因克隆载体系统

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1、4 基因克隆的载体系统基因克隆的载体系统4.1 质粒（质粒（plasmid）载体）载体 大肠杆菌主要的天然质粒类型：大肠杆菌主要的天然质粒类型： F 质粒：致育因子或性因子 R 质粒：抗药性因子 Col 质粒：产生大肠杆菌素因子 基因工程中使用的质粒载体都是在天然质粒的基础上人工改造而成的。质粒载体是重组DNA研究中最常用的也是最重要的基因克隆载体。14.1.1 质粒的生物学特性质粒的生物学特性4.1.1.1 质粒质粒DNA及其构型及其构型 绝大多数质粒都是环状双链DNA分子质粒DNA的构型： SC 构型：由cccDNA呈现超螺旋而形成； OC 构型：开环DNA（ocDNA）的构型； L 构型

2、：双链断裂而形成的线性质粒 DNA分子。23（2）F质粒及起接合转移：详见遗传学相关内容质粒及起接合转移：详见遗传学相关内容4.1.1.2 质粒质粒DNA的转移的转移（1）质粒的类型）质粒的类型 接合型质粒：能够自主转移的质粒。接合型质粒：能够自主转移的质粒。 非接合型质粒：不能自主转移的质粒。非接合型质粒：不能自主转移的质粒。44.1.1.3 质粒质粒DNA的迁移作用的迁移作用 由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程ColE1质粒的迁移质粒的迁移：2个相关基因个相关基因：bom：ColE1 DNA 上的特异位点，是 Mob基因产物的作 用位点；mob：其产物是 ColE1 质粒特有

3、的弥散产物核 酸酶，作用于 bom位点。54.1.1.4 质粒质粒DNA的复制类型的复制类型 质粒拷贝数质粒拷贝数：（1）生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子的数目；（2）对应于每条细菌染色体平均具有的质粒DNA分子数目。严禁型质粒和松弛型质粒严禁型质粒和松弛型质粒 严禁型质粒：低拷贝数的质粒，每个寄主细胞仅含有 13拷贝； 松弛型质粒：高拷贝数的质粒：每个寄主细胞中可高 达1060份 质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型之间有一定的相关性：接合型质粒由于具有较高的分子量，一般属于严禁型的；而非接合型质粒往往具有较小的分子量，一般属于松弛型质粒。64.1.1.

4、5 质粒的不亲和性（不相容性）质粒的不亲和性（不相容性） 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主细胞内稳定地共存的现象。 彼此间不亲和的质粒属于同一个不亲和群；而彼此间能够共存的质粒属于不同的不亲和群。78质质粒粒不不亲亲和和现现象象的的图图解解94.1.2 质粒质粒DNA的分离和纯化的分离和纯化 为了在基因克隆中用作载体分子，要获得批量的纯化的质粒DNA分子。加入溶菌酶或SDS（十二烷基硫酸钠）来裂解大肠杆菌细胞，在从细菌细胞内分离得到质粒DNA，然后在进一步纯化质粒DNA，使其没有细菌染色体DNA片段、RNA、蛋白质等杂质的污染。4.1.2.1 碱变性法碱变性

5、法 原理：在pH12.012.5范围内，线性DNA分子会被变性，成为线性单链分子；而质粒cccDNA的互补的两条链仍会紧密地结合在一起。在酸中和时，质粒DNA分子的两条链的复性迅速而准确，而随机断裂的线性DNA分子复性不会那么快速而准确，它们聚集成网状结构，在下一步的离心分离时与变性的蛋白质与RNA一道沉淀下来，滞留在上清液中的质粒cccDNA用酒精或异丙醇等试剂沉淀收集。10简要操作过程（投影）简要操作过程（投影）4.1.2.2 微量碱变性法微量碱变性法 如果质粒DNA需求量不多的情况下（或高拷贝质粒）可采用此种方法。此方法具有快速简便、经济实惠等优点，还可以同时抽提几种质粒DNA。方法同大

6、量提取法相近。4.1.2.3 氯化铯（氯化铯（CsCl）密度剃度离心法）密度剃度离心法 如果实验需要高纯度、高质量的质粒DNA，可采用这种方法离心纯化质粒DNA 。由于在离心管中还要加入溴化乙锭溶液，所以也叫氯化铯-溴化乙锭密度剃度离心法。 在超速（或高速）离心状态下，氯化铯在离心管中形成密度剃度，而细菌裂解液或质粒溶液中的不同成分按其密度在氯化铯的不同密度层面分离存在，从而达到分离纯化的目的。11124.1.2.4 影响质粒影响质粒DNA产量的因素产量的因素（1）寄主菌株的遗传背景（2）质粒的拷贝数及分子大小（3）实验操作误差134.1.3 质粒载体的构建及类型质粒载体的构建及类型4.1.3

7、.1 天然质粒的局限性天然质粒的局限性 天然质粒在抗生素标记、限制性内切酶酶切位点、分子量、拷贝数等等很多方面不能满足基因克隆的要求，所以绝大部分质粒载体是在天然质粒的基础上根据基因工程的需要而改造而来的。4.1.3.2 质粒载体必备的条件质粒载体必备的条件 1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因（理想情况下2种抗性基因） 3、具有若干个限制酶单一识别位点 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数144.1.3.3 质粒载体的选择性标记质粒载体的选择性标记（1）负选择标记）负选择标记15（2）正选择体系）正选择体系 丧失四环素抗性标记的正选择体系丧失四环素抗性标记的正选择体系 具有四环素抗性标记的

8、细胞对亲脂的螯合剂萎蔫酸极其敏感，因此能够在含有萎蔫酸的培养基中生长的只能是四环素敏感的细胞，而不是四环素抗性的转化子。 将外源DNA片段克隆到载体的四环素抗性基因（tetr）内某个限制位点上，使后者发生插入失活，并使用含萎蔫酸的培养基进行正选择。这样获得的抗药性群体全都可能含有插入的外源DNA片段。 环丝氨酸富集法环丝氨酸富集法 环丝氨酸是氨基酸类似物，如果在细胞生长分裂过程中参入到新合成的蛋白质多肽链，则会导致细胞的死亡。因此，在含有四环素的培养基中环丝氨酸只能杀死生长的Tetr细胞，而对于停止生长的Tets细胞则无致死效应。16环丝氨酸富集法环丝氨酸富集法 由tetr基因内带有插入序列的

9、重组质粒所转化的大肠杆菌细胞，在含有氨苄青霉素的培养基初步筛选以后，经过一次环丝氨酸处理，存活的细胞中Tets细胞所占比例得到明显的提高，再经若干次重复处理， Tets细胞的富集则可上升数倍。174.1.3.4 质粒载体的类型质粒载体的类型 高拷贝数的质粒载体 在没有蛋白质合成的条件下仍能复制，具有低分子量、高拷贝数的特点。在基因工程中用于分离大量的高纯度的克隆基因DNA片段。通常选用Col1、Pmb1或它们的派生质粒。 通常采用的方法是：在处于对数生长晚期的含有Col1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入氯霉素或壮观霉素等蛋白质合成抑制剂，此时细菌染色体DNA的复制被阻断，而质粒DNA的复制不受

10、什么影响，再继续培养1012h后，每个细胞内的质粒拷贝数则可扩增到10003000个之多，这样就可以用较少量的大肠杆菌培养物获得大量的质粒DNA。 低拷贝数的质粒载体 分子量相对高，拷贝数低。某些克隆的编码基因的产物过量而影响寄主细胞的正常代谢，在克隆这样的基因时需要用低拷贝数的质粒作为载体，使其表达水平置于严格控制之下。18 有些低拷贝数质粒可与高拷贝数质粒连接成双复制子质粒，从而提高其拷贝数。 失控的质粒载体 有些质粒载体具有温度敏感复制控制特点，在不同的温度条件下其拷贝数有显著的变化。即低拷贝数的质粒在某些温度下其复制失去了控制而表现高拷贝数质粒的特点，虽然这会导致细胞的生长受到抑制，但

11、此时质粒DNA的产量得到明显的提高。 插入失活的质粒载体 大部分情况下要克隆的外源DNA片段都没有选择性标记，此时用我们以前讲过的标记基因内有限制位点的质粒载体来克隆这些外源DNA片段，使质粒的某一选择性标记失活而选择带有外源DNA片段的转化子。 也可用对载体酶切末端进行修饰等方法达到同样的目的。19 正选择质粒载体 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件下进行选择，这样我们在转化之后直接就能选择出重组质粒。20举例：正选择质粒载体pKN80 Pkn80编码一种对Mu噬菌体非溶源性菌株具有致死效应的kil基因，在pKN80质粒的HpaI或HindIII位点插入外源DNA，便会使这种致死效

12、 应失活，产生出具 有Ampr表型的Mu 噬菌体非溶源性的 转化子菌株。这样， 我们就直接选择出 在HpaI或HindIII位 点插入外源DNA的 重组体质粒之转化 子。21典型的大肠杆菌表达载体 表达性的 质粒载体 将克隆外源真核基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下，这种特殊设计构建，能使克隆在其特定位点上的外源真核基因的编码序列在大肠杆菌细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的克隆载体称为表达载体表达载体。224.1.4 重要的大肠杆菌质重要的大肠杆菌质粒载体粒载体4.1.4.1 pSC101 pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体。 平均每个寄主细胞仅有12份拷贝，分子

13、量为9.09Kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。 该质粒具有EcoRI等7中限制性内切酶的单一切割位点，其中HindIII、BamHI和SalI等3个位点克隆外源DNA时，都会导致tetr基因的失活。23pSC101应应用实例用实例1：金黄色葡金黄色葡萄球菌的萄球菌的Ampr 基基因插入因插入pSC101 质粒质粒24pSC101应用实例应用实例2： 应用应用pSC101质粒作载体在大肠杆菌细胞中质粒作载体在大肠杆菌细胞中 克隆非洲爪蟾的克隆非洲爪蟾的rDNA基因片段基因片段254.1.4.2 pBR322 pBR322 质粒由3个不同来源的部分组成：第一部分来源于pSF2124质粒易

14、位与Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分来源于CoLEI的派生质粒pMB1的DNA复制起点。26pBR322 质粒的优点：质粒的优点： 分子量较小：4363bp，易于自身DNA的纯化，可克隆达6kb的外源DNA。 具有两种抗生素抗性基因（ampr和tetr）可供作转化子的选择性标记， 具有多达24种限制性内切酶的单一切割位点，其中， BamHI等9种限制性内切酶的切割位点在位于tetr基因的内部或启动子区域，另外在ampr基因内部还有PstI等3个限制性内切酶的切割位点，这些位点上克隆外源DNA时都会导致抗性基因的插入失活

15、，从而为转化子的选择提供了很大的方便。27 pBR322 质粒载体质粒载体tetr基因的插入失活基因的插入失活284.1.4.3 pUC 质粒载体质粒载体 pUC质粒载体是在pBR322的基础上，使用多克隆位点（MCS）技术，组入了一个在其5-端带有一段MCS位点的lacZ基因，从而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 pUC质粒载体的结构：有以下4个组成部分 来自pBR322的复制起点； 无限制位点的氨苄青霉素抗性基因（ ampr）； 大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码 -肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因； 位于lacZ基因中的靠近5-端的一段MCS位点

16、（并不 破坏lacZ基因的功能）2930 pUC18 及及 pUC19 质粒载体的多克隆位点（质粒载体的多克隆位点（MCS）31pUC 质粒载体的优点质粒载体的优点 分子量小拷贝数高，分子量只有2.7kb左右，而拷贝数未经 氯霉素扩增即可高达500700个/细胞； 适用于组织化学方法检测重组体。由于有lacZ基因，所编码的-肽链可参与互补，因而可用X-gal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。 具有多克隆位点MCS区段，而且与M13mp8噬菌体的MCS 相同。因此在MCS上克隆的外源DNA片段可以方便地转移 到M13mp8载体上进行测序。同时，由于有不同限制位点， 还可以把具有

17、不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到 pUC质粒载体上。324.1.4.4 其它重要质粒载体其它重要质粒载体（1）丧失迁移功能的质粒载体）丧失迁移功能的质粒载体pBR327 pBR327是从pBR322改建而来，比pBR322缺失了一条1.09kb的DNA片段，导致在复制和结合能力方面发生了改变，但氨苄青霉素抗性和四环素抗性的基因保持完整。pBR327有如下2个 主要特点： 拥有较高的拷贝数， 平均每个大肠杆菌 寄主细胞可达30 45份； 由于失去了bom位点， 不能提高结合而转移， 具有更高的安全系数。33（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体）能在体外转录克隆基因的质粒载体pGEM-3Z

18、pGEM-3Z由pUC系列质粒载体派生而来，是与pUC系列十分类似的小分子质粒载体。有一个氨苄青霉素抗性基因和一个 lacZ基因，后面插入了一段含有EcoRI等13个限制性内切酶识别位点的多克隆位点（MCS）。 pGEM-3Z与pUC系列质粒载体的主要区别在于它具有2个来自噬菌体的启动子T7启动子和SP6启动子，分别位于MCS位点两侧，取向相反。它们为T7或SP6的RNA聚合酶提供了特意性的识别位点。 pGEM-3Z和 pGEM-3Z的差别在于T7启动子和SP6启动子的位置互换，取向相反。 这样的载体还有pSP64和Psp65质粒载体，也是由pUC系列质粒载体派生而来。这些载体都可以在体外转录

19、体系中进行转录和翻译克隆的外源基因。34pGEM-3Z pGEM-3Z 质粒载体及质粒载体及 其克隆位点其克隆位点 序列图序列图35pSP64和Psp65质粒载体：含有噬菌体SP6的启动子，两者之间的差别在于MCS位点取向彼此相反36（3）穿梭质粒载体）穿梭质粒载体 所谓的穿梭质粒载体是指一类人工构建的，具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 以大肠杆菌细胞为寄主进行基因操作具有技术成熟、方便实用等很多优点，而在其它的原核生物或真核生物细胞中进行直接的基因操作总是有很多麻烦的问题有待解决。所以，构建能够穿梭于大肠杆菌与其它生物细胞之间的载体就能解决这些难

20、题了。 常见的穿梭质粒载体有大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体等，应用这样的载体，可以很方便地在大肠杆菌细胞中进行重组DNA操作和增殖，然后在返回到枯草芽孢杆菌或酿酒酵母中进行研究。 现在也有大肠杆菌和动物细胞之间的穿梭质粒载体，如利用大肠杆菌和牛乳头瘤病毒构建的pBPV-BV1。成功克隆到人-干扰素基因，并在多种动物细胞中得到表达。37举例说明举例说明大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酿酒 酵母穿梭质粒载体酵母穿梭质粒载体含有两种分别来自大肠杆菌 和酿酒酵母的复制起点和选 择标记，另有一个多克隆位 点。 （a）转化Amps大肠杆菌细胞； （b）转化LEU酿酒酵母细胞； （

21、c）质粒在两种细胞之间穿梭； （d）涂布在含氨苄青霉素的平 板上选择Ampr大肠杆菌转 化子； （e）涂布在无亮氨酸的平板上 选择leu酿酒酵母转化子。384.2 噬菌体载体和柯斯载体噬菌体载体和柯斯载体4.2.1 噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌噬菌体，它与大肠杆菌一样，是同现代分子生物学及分子遗传学的创立和发展过程密切相关的。 噬菌体的分子量为31106dal，基因组DNA分子的长度为48.502kb，已经定位的 噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与噬菌体生命周期的活动称之为 噬菌体的必要基因；另一部分基因可以被外源基因或DNA取代而并不影响噬菌体

22、的生命功能称之为非必要基因；在 噬菌体线性双链DNA分子的末端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补 的5单链突出序列称之为粘性末端。感染大肠杆菌后， 噬菌体会迅速以粘性末端之间的互补作用而形成双链环状DNA分子，这个由粘性末端结合形成的双链区称为cos位点。3940414.2.1.1 噬菌体载体的噬菌体载体的 构建及其主要类型构建及其主要类型（1）构建）构建 噬菌体载体噬菌体载体 的基本原理的基本原理 由于野生型 噬菌 体DNA序列中常用的限 制性内切酶位点过多， 所以，首先消去多余的 限制位点和切除非必要 区段。 噬菌体噬菌体DNA限限 制位点示意图制位点示意图42（2） 噬菌体载体的

23、主要类型噬菌体载体的主要类型A 插入型载体插入型载体 具有外源DNA插入克隆位点，并有插入失活效应，克隆的DNA片段长度在10kb以内，广泛应用与cDNA或小片段DNA的克隆。根据其插入失活效应的特异性，可分为以下两种亚型：免疫功能失活的插入型载体免疫功能失活的插入型载体：这类载体的免疫区内带有一两种限制性内切酶单切位点，当外源DNA片段插入后其免疫性遭受破坏，不能进入溶源周期而形成清晰的噬菌斑；而没有外源DNA插入的亲本噬菌体会形成浑浊的噬菌斑，为分离重组体分子提供了方便。-半乳糖苷酶失活的插入型载体半乳糖苷酶失活的插入型载体：许多 噬菌体载体基因组中含有一段大肠杆菌的lac5区段，其中有l

24、acZ基因，插入位点在lac5区段内，当外源DNA片段插入后，其-半乳糖苷酶基因失活。用这种载体感染大肠杆菌lac指示菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，就会形成只能形成白色菌落。而由未插入外源DNA片段的载体感染大肠杆菌lac指示菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，就会形成蓝色菌落。4344B 替换型载体替换型载体 这种载体的中央部分有一个可以被外源DNA片段所取代的DNA片段，可取代部分两侧的多克隆位点是反向重复序列。当外源DNA片段插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。替换型载体可承受15kb外源DNA片段的有

25、效克隆能力。45（3）Charen噬菌体载体噬菌体载体 Charen噬菌体（charen bacteriophage）载体是 噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。许多Charen噬菌体载体都带有 -半乳糖苷酶基因以及它的操纵区和启动子的lac5取代片段，从而在感染大肠杆菌lac指示菌后产生不同颜色的菌落而识别重组体或非重组体。 Charen噬菌体载体中既有插入型载体，也有替换型载体。 Charen噬菌体载体克隆外源DNA片段的一般程序 首先，分离线性载体DNA，限制酶切消化，分离片段取两臂；其次，将分离得到的两条载体臂段与经相同限制酶消化的外源DNA片段混合，加入连接酶连接；第三，将连

26、接物与包装蛋白混合温育，使之包装成具有感染能力的噬菌体颗粒；最后把包装产物涂布在敏感细菌平面上进行组织化学检测。46474849504.2.1.2 重组体重组体DNA分子的体外包装分子的体外包装（1） 重组体重组体DNA分子的转染作用分子的转染作用 转染（转染（transfection）:由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程。 在用 噬菌体载体进行转染时，由于转染效率低下。重组体分子转染效率只要103104（每微克DNA转染产生的噬菌斑数目），不能满足基因转移的要求，所以一般采用体外包装的方法加以解决。（2） DNA的体外包装的体外包装 所谓 DNA的体外包装，就是指在体外试管中完成发生与寄

27、主细胞内的包装过程。5152（3） 噬菌体噬菌体DNA的包装限制的包装限制 噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的：上限不得超过正常野生型 DNA总量的5%；而低限有不得少于野生型 DNA总量的75% 。也就是说， 噬菌体头部外壳蛋白的包装范围控制在野生型 DNA长度的75%105%之间。 噬菌体DNA长度为48.502kb，其中，编码必要基因的区段占28kb，如果说包装上限为51kb， 那么， 噬菌体载体克隆外源DNA片段的理论极限值是23kb 。而在实际应用中，克隆的有效长度只有15kb 。534.2.1.3 重组体的选择方法重组体的选择方法（1） cI 基因功能选择法基因功能选

28、择法 cI 基因失活会寄主细胞无法溶源化，形成清亮型噬菌斑。而非重组体分子具有溶源化效应，形成浑浊的菌落。（2）lacZ基因功能选择法基因功能选择法 以前讲过的组织化学检测法。（3）sPi选择法选择法 噬菌体的red和gam基因的编码产物抑制噬菌体在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中正常生长，而这2个基因的突变型或缺失体噬菌体可在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中正常生长544.2.2 柯斯质粒载体柯斯质粒载体4.2.2.1 柯斯质粒载体的构建柯斯质粒载体的构建 柯斯质粒载体，cosmid（cos site-carrying plasmid）的原意是带有粘性末端（cos）的质粒，是人工构建的含有

29、噬菌体的cos序列和质粒复制子的特殊质粒载体。 构建这种载体的主要目的是提高质粒载体的克隆大片段外源DNA的容量，使其更适合应用于真核基因的克隆。柯斯质粒载体的构建以柯斯质粒载体的构建以pHC79为例为例： 用 噬菌体基因组的cro-rII的Bgl II限制片段取代pBR322质粒DNA的位于14591666bp之间的Sau3A片断，产生出具有Bgl II单切位点的重组体分子。 通过产生的Bgl II单切位点将带有cos序列，长度为1.78kb的 DNA之Bgl II片段插入进去，得到了柯斯质粒pHC79。55 pHC79的cos位点两侧还具有与 噬菌体包装有关的DNA短序列，而质粒DNA部分

30、则是一个完整的复制子，编码着一个复制起点和两个抗菌素抗性基因ampr和tetr。 pHC79兼备了噬菌体载体和pBR322质粒载体两方面的优点，其克隆能力为3145kb。564.2.2.2 柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点（1）具有）具有 噬菌体的特性噬菌体的特性：柯斯质粒载体克隆了合适长度的外源DNA片段，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以高效率地转导对 噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进入寄主细胞后便通过cos序列环化起来。但由于缺失了 噬菌体部分必要基因，因此并不能通过溶菌周期形成子代噬菌体颗粒。（2）具有质粒载体的特性）具有质粒载体的特性：由于有了质粒复制子，柯斯质粒载体能够在寄主细胞内

31、像质粒一样进行复制，而且还可以通过氯霉素来扩增。柯斯质粒载体还可以通过抗菌素抗性及其插入失活特点来进行重组体的选择。（3）具有高容量的克隆能力）具有高容量的克隆能力：柯斯质粒载体只有复制子、选择标记和cos序列等必要序列，其本身的分子量较小，长度一般只有57kb，克隆容量可达45kb左右。由于存在包装限制，柯斯质粒载体适合克隆大片段DNA的克隆。57（4）具有与同源序列的质粒进行重组整合的能力）具有与同源序列的质粒进行重组整合的能力：在与具有同源序列的质粒载体共存与同一个寄主细胞时，可通过同源部分形成共和体分子。584.2.2.3 柯斯克隆柯斯克隆 柯斯克隆（柯斯克隆（cosmid cloni

32、ngcosmid cloning）: :应用柯斯质粒载体，在大肠杆应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNADNA技术。技术。 先用限制性内切酶局部消化真核生物的先用限制性内切酶局部消化真核生物的DNADNA，产生出来大，产生出来大分子量外源分子量外源DNADNA片段，与经同样的限制酶酶切的柯斯质粒线性片段，与经同样的限制酶酶切的柯斯质粒线性DNADNA分分子进行体外连接反应。这样产生的连接物群体中，有一定比例的分子进行体外连接反应。这样产生的连接物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个取向一样的子是两端各有一个取向一样的coscos位点的长度

33、约为位点的长度约为40kb40kb的外源的外源DNADNA片片段段。 然后加入然后加入 噬菌体包装连接物，其中的一种噬菌体包装连接物，其中的一种coscos位点特位点特异的切割体系异的切割体系末端酶（末端酶（terminaseterminase，TerTer），识别两个相距适宜），识别两个相距适宜的的coscos位点，将多连体分子切割成位点，将多连体分子切割成 单位长度的片段，将其包装到单位长度的片段，将其包装到 噬菌体头部。噬菌体头部。 这样产生的这样产生的“ “ 噬菌体噬菌体”可以感染大肠杆菌，包装在可以感染大肠杆菌，包装在头部内的真核头部内的真核DNA-cosDNA-cos杂种分子便通过

34、杂种分子便通过coscos位点环化起来。并按着质位点环化起来。并按着质粒分子的方式在大肠杆菌细胞内进行复制和表达其抗药性标记。粒分子的方式在大肠杆菌细胞内进行复制和表达其抗药性标记。59柯斯克隆示意图604.2.3 单链噬菌体载体单链噬菌体载体 M13、f1 和 fd 等是一类亲缘关系密切的丝状大肠杆菌噬菌体，都含有长度为6.4kb、彼此具有高度同源性的单链环状DNA分子。 单链单链DNA噬菌体载体有别于其它载体的的优越性是：噬菌体载体有别于其它载体的的优越性是： 复制以双链环状复制以双链环状DNA（replication form DNA，RF DNA， 复制性复制性DNA）为中间媒介，可以

35、象质粒）为中间媒介，可以象质粒DNA一样在体外进一样在体外进 行纯化和操作。行纯化和操作。 无论是无论是RF DNA还是还是ssDNA，都能感染感受态的大肠杆菌寄，都能感染感受态的大肠杆菌寄 主，而且根据实验方法的不同，可形成噬菌斑或菌落。主，而且根据实验方法的不同，可形成噬菌斑或菌落。 单链单链DNA噬菌体颗粒的大小取决于噬菌体颗粒的大小取决于DNA的多寡，并不存在包装的多寡，并不存在包装 限制。有成功包装总长度为限制。有成功包装总长度为M13 6倍的倍的DNA分子的报道。分子的报道。 应用单链应用单链DNA噬菌体，很容易地测定出外源噬菌体，很容易地测定出外源DNA片段的插入向。片段的插入向

36、。 可产生大量纯化的含外源可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链片段插入的单链DNA分子。可进分子。可进 行双脱氧测序，也可用于标记探针，还可用于寡核苷酸定点突变。行双脱氧测序，也可用于标记探针，还可用于寡核苷酸定点突变。614.2.3.1 M13 噬菌体及噬菌体及M13克隆体系克隆体系（1）M13 噬菌体概述噬菌体概述 M13 噬菌体颗粒的噬菌体颗粒的 外形呈丝状外形呈丝状,大小范围为大小范围为 900nm9nm，颗粒中，颗粒中 包装的只是（包装的只是（+）链的）链的 DNA，也称为感染性的，也称为感染性的 单链。单链。62 M13 是雄性大肠杆菌特有的噬菌体，只能感染带有F性须的大肠杆

37、菌菌株。不过M13 噬菌体DNA亦可以通过转染作用导入雌性大肠杆菌细胞。M13 噬菌体首先吸附在F性须的末端；在基因III编码的向导蛋白作用下，其ssDNA基因组通过F性须进入大肠杆菌细胞内；M13的ssDNA便在基因II编码的蛋白质的作用下，形成RF DNA；此种DNA指导合成子代M13 单链基因组；这些单链的M13 DNA随之被包装成噬菌体颗粒，并挤压出寄主细胞。M13 单链单链DNA噬菌体的生命周期噬菌体的生命周期63 M13 噬菌体在感染的大肠杆菌噬菌体在感染的大肠杆菌 细胞中的复制细胞中的复制（a）感染性的单链环状（+）DNA在寄主 酶的作用下转变成双链的RF DNA；（b）RF D

38、NA按 形式进行若干复制循环；（c）RF DNA的负链转录成M13的mRNA；（d）M13基因II编码的蛋白质在RF DNA 正链的特定位点切割形成切口； M13基因组的扩增正式开始（e）利用大肠杆菌DNA聚合酶I，复制叉 沿负链移动，不断合成正链；（f）M13基因II编码的蛋白质切下完整的 子代正链，并进行环化；（g）继续合成子代正链。M13噬噬菌菌体体颗颗粒粒在在感感染染的的大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞中中的的复复制制过过程程64 M13 噬菌体的复制过程中，RF DNA快速增殖到每个细胞含量达200个拷贝时，由于细胞内累计了足够数量的由噬菌体基因V编码的单链特异的DNA结合蛋白质，RF DN

39、A的复制就变成了不对称的形式。这是因为这种蛋白质与正链DNA结合，阻断了其互补链负链的合成，继续进行的只是正链的不断合成。 合成出来的正链与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主的细胞膜，同时基因V蛋白质脱落，正链DNA从寄主细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白质包裹成噬菌体颗粒的。正因为这样，M13 噬菌体不存在严格的包装限制问题，M13 噬菌体载体也就有了较大的克隆能力。 M13 噬菌体虽然不会导致寄主细胞发生溶菌效应，但被感染的寄主细胞的生长和分裂会受到影响，其速度仅为正常细胞的1/23/4。每个寄主细胞每个时代可释放出1000个左右的子代噬菌体颗粒。 由于RF DNA

40、在寄主细胞中以高拷贝数的形式存在，所以很容易纯化出来供作基因克隆载体使用。同时，由于培养物中存在大量的噬菌体，也很容易分离到M13 噬菌体颗粒，有利于制备大量的单链模板DNA。65（2）M13克隆体系克隆体系 -半乳糖苷酶显色反应原理半乳糖苷酶显色反应原理 用于基因克隆的M13载体或大肠杆菌寄主，都不能单独产生-半乳糖苷酶，只有将两者结合在一起时才能形成有功能的-半乳糖苷酶。而且这种酶的活性还可以用Xgel（X-gel）显色反应测定出来，是一种组织化学测试技术： - -半乳糖苷酶可以将无色的化合物半乳糖苷酶可以将无色的化合物XgelXgel（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚- -D

41、-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和兰色的底物半乳糖苷）切割成半乳糖和兰色的底物5-5-溴溴-4-4-氯氯- -靛靛蓝。蓝。 顺反子内互补作用顺反子内互补作用：编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生一种有功能的蛋白质多肽的生化过程。需要说明的是，这种互补作用并不是普遍存在的。 通过DNA重组技术，构建了只含有-半乳糖苷酶基因一小部分序列的M13派生载体。这段序列只编码-半乳糖苷酶的氨基末端，即-肽链，可通过顺反子内互补作用检测其活性。66举例：举例： lac缺失突变lacZ（M15），简称M15基因，合成的是一种缺失了1141氨基酸的缺陷性-半乳糖苷酶，失去了四聚化作用的功能，又

42、称M15多肽。它的功能可以由体外加入的-半乳糖苷酶的溴化氰片段（292氨基酸）来恢复。这里，溴化氰片段是-给体，M15多肽是-受体，这种功能补偿现象叫做-互补作用互补作用。 用一种特定的-半乳糖苷酶基因的HindII片段编码的多肽替代溴化氰片段同样能发生-互补作用。在M13克隆体系中，lacHindII片段位于M13 噬菌体载体分子上，而大肠杆菌寄主细胞的F质粒则带有M15突变。 M13 载体所携带的lacHindII片段上具有lac操纵子的操纵区和启动子，所以被感染的细胞中， -半乳糖苷酶的合成将是组成型的。因为200个左右的RF DNA的存在使普通lac+的阻遏状态（每个细胞只要10个左右

43、的阻遏物分子）被消除。67 为了克服这种组成性，可以将lac阻遏基因的Iq突变引入寄主细胞，产生出十余倍超量的阻遏物分子，去补偿大量的M13 RF DNA分子。在lac Iq 突变基因的寄主细胞中，给lac操纵子加入诱导物IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）就可以激活lacHindII片段的转录表达。 IPTG是一种乳糖类似物，在不存在底物乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成-半乳糖苷酶。所以我们称其为-半乳糖苷酶的安慰诱导物。在细菌固体培养基平板上加入IPTG即可起到诱导作用。 通常在M13克隆体系中使用的大肠杆菌菌株是JM101，其lacZ基因被缺失掉了，但在其F质粒上有一个M15基因和lac

44、 Iq 突变基因，可以产生超量的lac阻遏物，这就使lac操纵子的表达置于从培养基中渗入的IPTG的调节控制之下。IPTG分子结构式68 M13 载体系列的发展载体系列的发展 与噬菌体不同的是，M13 噬菌体并不存在明显的非必要区段，但在其基因II和IV之间有一个长度为507个核苷酸的唯一基因间区段（第5498至6005核苷酸），该序列上存在着M13 DNA的复制起点，就噬菌体的发育功能而言，并不需要该区段的完整性，可以在此插入外源DNA。由此发展出了M13克隆载体系列。 M13 载体系列命名为mpn， 其中n代表整数，如M13mp8、 M13mp9等。M13 载体系列载体系列的系谱图的系谱图

45、NMU：亚硝基-N-甲基尿烷lacHindII片段片段=lacZOPI：包括：包括lacI、lac启动子（启动子（P）和）和lac操纵子（操纵子（O）以及）以及lacZ.lacZ :头145个氨基酸密码子69lac HindII片段的克隆步骤：片段的克隆步骤： 首先用限制酶BsuI局部消化M13 RF DNA（共有10个识别位点），并通过凝胶电泳分离出全长的单体分子，然后再同大肠杆菌的lac HindII片段作平末端连接。由此产生的重组DNA分子中， 只有lac HindII片段插入到基因间非必要区段（此区段有一个BsuI识别位点）内的才有存活的能力。同时，也可以通过插入失活lac HindI

46、I片段等方法对外源DNA片段的克隆进行选择。 在lac HindII片段上，只有AvaII、Bgl II、PvuI三种限制酶单一识别位点，还有PvuII限制酶三个识别位点，而基因克隆中常用EcoRI、HindIII等一些酶都不存在相应的识别位点。为了弥补这个不足，1978年，B.Gronenborn和J.Messing将一个EcoRI限制位点导入M13mp1载体的lac HindII片段上，得到了M13mp2载体70通过对通过对M13mp1载载体的甲基化而获得体的甲基化而获得M13mp2载体过程：载体过程：M13mp1载体的第5个氨基酸密码子附近的序列为GGATTC，对其第2个核苷酸G进行甲基

47、化就成为限制酶EcoRI的限制位点。71 从从M13mp2载体到载体到M13mp7载体的过程载体的过程 原则：将必要区段内相应的限制酶识别位点消除，在非必要原则：将必要区段内相应的限制酶识别位点消除，在非必要 区段内增加常用限制酶识别位点。区段内增加常用限制酶识别位点。72 若干种若干种M13 噬菌体载体的多克隆位点噬菌体载体的多克隆位点7374 M13 载体系列的优点载体系列的优点 第一、这类载体的基因组中有lac操纵子的-半乳糖苷酶基因片段（HindII片段）其中插入了一段密集的多克隆位点的序列。 第二、由于M13载体是应用基因工程技术成对构建的，可以有效地克隆外源双链DNA分子中的每一条

48、链。其中，可根据外源DNA的插入取向或双酶切定向插入的方法克隆并分析每一条DNA链。75 外源外源DNADNA片段在片段在 M13 M13噬菌体载体噬菌体载体 上的定向克隆上的定向克隆76 一对一对M13 噬菌体载体噬菌体载体（M13mp10/M13mp11） 分子结构图分子结构图 都带有一段限制位点都带有一段限制位点 相同而取向相反的多相同而取向相反的多 克隆位点序列克隆位点序列77（3）噬菌体展示载体（）噬菌体展示载体（phage display vectors） 象M13这样的单链DNA噬菌体颗粒的表面存在着35个拷贝的基因III编码的蛋白质。这类蛋白质对于噬菌体颗粒的正确组装以及对大肠

49、杆菌性须的吸附过程起到重要的作用。 基于这种事实，G.P.Smith于1985年建立了一种专门在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的所谓噬菌体展示技术噬菌体展示技术（phage display）。后又构建了一类特殊用途的噬菌体展示载体。 当外源DNA片段被插入在噬菌体展示载体的基因III编码序列中，在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生出由克隆基因与基因III联合编码的融合蛋白质。78应应用用噬噬菌菌体体展展示示随随机机多多肽肽基基本本原原理理79 应用噬菌体展示载体应用噬菌体展示载体 分离分离hGH变体的示意图变体的示意图（a a）随机突变的）随机突变的hGH cDNAhGH cDNA文库与噬

50、文库与噬 菌体展示载体作体外连接；菌体展示载体作体外连接；（b b）转化大肠杆菌细胞；）转化大肠杆菌细胞；（c c）制备的噬菌体过）制备的噬菌体过hGHhGH受体层析柱；受体层析柱；（d d）洗脱结合的）洗脱结合的hGH-hGH-噬菌体；噬菌体；（e e）克隆个别的噬菌体；）克隆个别的噬菌体；（f f）分离噬菌体；）分离噬菌体；804.2.4 噬菌粒载体噬菌粒载体4.2.4.1 噬菌粒载体的概念噬菌粒载体的概念 虽然M13噬菌体载体可方便地用来制备克隆基因的单链DNA，但也有以下方面的缺点和不足： （1）插入外源DNA片段以后，其遗传稳定性会显著地下降； （2）外源DNA片段总是按一种主要的取

51、向插入； （3）克隆外源DNA的实际能力一般情况下最大仅为1.5kb。 为了解决这个问题，科学工作者已经发展出了一类由质 粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为 噬菌粒载体（噬菌粒载体（phagemid 或或 phasmid）。）。814.2.4.2 噬菌粒载体一般特性噬菌粒载体一般特性 （1）分子量比M13载体小，约为3kb，易于体外操作，可得到长达 10kb的外源DNA的单链序列； （2）具有质粒和噬菌体双复制起点，在大肠杆菌细胞内按正常的双 链质粒DNA分子形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产； 而同时存在辅助噬菌体的情况时，在噬菌体基因II蛋白质的影 响下，又可如同M1

52、3载体一样按滚环模型复制产生单链DNA， 并在包装成噬菌体颗粒之后被挤压出寄主细胞。 （3）可直接进行克隆DNA片段的序列测定。824.2.4.3 pUC118和和pUC119 噬菌粒载体噬菌粒载体 pUC118和pUC119是一对由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成的噬菌粒载体。 IG的长度为476bp，含有M13 噬菌体的复制起点，是插入到pUC18和pUC19质粒的NdeI位点上。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反以外，两者的分子结构完全相同。83 pUC118和和pUC119的多克隆位点的多克隆位点pUC118多克隆位点多克隆位点pUC119多克

53、隆位点多克隆位点84pUC118和和pUC119噬噬菌菌粒粒载载体体的的两两种种复复制制模模型型85辅助噬菌体辅助噬菌体 辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低的突变体，但它们可以为寄主细胞中的相关载体的复制与包装提供所需的蛋白酶和外壳蛋白质。 最常见的辅助噬菌体是M13的一种派生噬菌体，叫做M13K07。它是通过在野生型M13的基因间隔区（IG）的唯一识别位点AvaI上插入了一个已经发生了突变的来自M13mpI的噬菌体复制起点、一个来自p15A的质粒复制起点和一个来自Tn903的卡那霉素抗性基因等三个组分发展而成的。M13K07 （8.7kb） 当寄主细胞内不存在pUC118 和 pUC11

54、9时，低效率复制产生出足够数量的M13K07噬菌体保证自身的遗传稳定性 86pUC118pUC118或或pUC119pUC119噬菌粒载体的优点：噬菌粒载体的优点：（1）具有小分子量的cccDNA，可克隆长达10kb的外源DNA片段， 并易于进行体外分离和操作；（2）具有ampr基因作为选择标记，便于选择转化子；（3）高拷贝，每个寄主细胞可多达500个，便于制备大量的载 体DNA；（4）存在多克隆位点，便于直接克隆不同类型的外源DNA片段， 同时，多克隆位点在lacZ基因的5-编码区，故可按照 Xgal-IPTG组织化学显色反应实验来筛选重组体分子；（5）具有质粒和噬菌体双复制起点，可根据需要来选择其复制 方式；（6）pUC118或pUC119的MCS序列取向相反，所以其中一个可用 来转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录负链DNA。（7）可以直接进行克隆DNA片段的序列测定。87pUC118/pUC119pUC118/pUC119噬菌粒噬菌粒 载体的克隆程序载体的克隆程序（1）对外源DNA片段和 载体分子进行限制 酶酶切消化，并进 行体外连接；（2）转化具有lacZ15 的大肠杆菌Amps表 型菌株；（3）涂布在含有Xgal- IPTG和氨苄青霉素 的培养基表面，选 择兰色菌落。88