《第八章酶的定向进化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第八章酶的定向进化（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第八章第八章 酶的定向进化酶的定向进化在实际生产中，天然酶通常不能满足实际需要，人们需对其进行改造或设计新的酶分子。酶分子的酶分子的合理设计合理设计( (rational rational design)design)酶分子的酶分子的定向进化定向进化(directed evolution)(directed evolution)合理设计-定点突变首先分析蛋白质的三维空间结构，搞清结构与功能的关系，然后采用定点突变技术改变蛋白质中的个别氨基酸残基，从而得到新的蛋白质，这种尝试称为理性化设计。目前已利用定点突变技术对天然酶蛋白的催化效率、抗氧化性、底物特异性、热稳定性及拓宽酶反应的底物范围、改进酶
2、的别构效应等进行了成功的改造。酶的合理设计酶的合理设计定点突变的缺点只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶功能的改造较有限。本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力了.定向进化酶的体外定向进化酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化
3、的基本先决条件。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。定向进化的原理定向进化的原理通过适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。酶的定向进化由三部分组成，即随机突变、构建突变体文库、和随机突变、构建突变体文库、和突变体文库的定向筛选。突变体文库的定向筛
4、选。定向进化定向进化定向进化定向进化= = = =随机突变随机突变随机突变随机突变+ + + +定向选择。定向选择。定向选择。定向选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。第一节 酶定向进化的特点适应面广目的性强效果显著第二节 酶基因随机突变的方法 一、易错PCR技术为代表的无性突变， 二、DNA重排（ DNA重组, DNA改组）技术为代表的有 性突变一、易错PCR技术为代表的无性突变无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶基因库以便筛选。主要的手段包括易错PCR、盒式诱
5、变、随机定位诱变等。易错PCR是在是在定向进化研究中最常用的一种基因突变方法，采用Taq酶进行PCR 扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高镁离子浓度，加入锰离子改变体系中四种dNTP的浓度等，使用低保真度的Taq酶，从而向目的基因中以一定的频率随机引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。其中通过改变Mn2+的浓度和PCR循环数可对突变频率进行调节。 在该方法中, 遗传变化只发生在单一分子内部, 所以属于无性进化。由于它较为费力、耗时, 一般多用于较小基因片段( 800bp) 的改造。易错PCR的关键点在于如何选合适的突变频率。一般有益突变的频率很低，绝大多数突变是有害的。突变频率
6、过高时几乎无法筛选到有益突变，但突变频率过低则野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想突变体。研究表明：目标基因内1kb碱基有2-5个碱基发生碱基替换，诱变结果是最理想的。连续易错PCR（Sequential error-prone PCR）策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。实例Komeda等用易错PCR方法提高了Ochrobactrum anthropi SV3（人苍白杆菌）的D-氨基酸酰胺酶的热稳定性和催化活性.得到的突变酶最适温度比天然酶高5 ，Vmax提高了3倍，而Km不变。 C
7、hen 等 采用易错PCR 对枯草杆菌蛋白酶进行了体外进化研究。经筛选得到的突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF) 中酶活力是野生型的256 倍。将PC3 再进行两个循环的定向进化, 得到的突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍。二、DNA改组技术在酶分子无性进化策略中，一个具有正向突变的基因在下一轮易错PCR过程中继续引入的突变是随机的，而这些后引入的突变仍然是正向突变的概率是很小的。因此人们开发出DNA改组等基因重组策略将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起形成新的突变基因库。DNA改组改组(DNA shuffling)DNA改组改组又称为有性PCR (Sexual PCR) ,
8、又称有性PCR(sexual PCR) 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。基本操作过程如下: 靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至获得全长基因; 再加入基因的两端引物进行常规PCR , 最终获得发生改组的基因库(图1) 。该技术不仅可加速积累有益突变, 而且可实现目的蛋白多种特性的共进化, 所以无论在理论
9、上, 还是在实际应用中, 均优于连续易错PCR。DNADNA改组改组原理原理实例-内酰胺酶是一种水解头孢类抗生素的微生物酶, Stemmer等运用DNA shuffling技术对-内酰胺酶进行改造，每次循环后从中筛选出数百个酶活力提高的突变体DNA序列用于下次循环。经过3次循环获得一个赋予宿主细胞对头孢菌素抗性提高16000倍的突变体。Williams 等人利用DNA重排改造1，6-二磷酸己酮糖醛缩酶。得到的醛缩酶以非天然的1，6-二磷酸果糖为底物时，kcat/ Km值提高80 倍，立体定向性提高了100倍。 特点可体外实现同源序列间的改组，创造亲本基因群中突变尽可能组合在一起的机会，加速累积
10、有益突变最终获得较理想的性状改良的突变体交错延伸技术交错延伸技术（Staggered extension process，StEP）是在PCR反应中，将含不同点突变的模板混合，在热循环中将常规的退火和延伸合并为一步，大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，在每一循环中，不断延长的片段根据序列的互补性与不同模板退火，并进一步延伸，反复重复直到全长序列形成，结果会产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。交错延伸技术省去了用DNA酶I切割成片段的步骤从而简化了DNA改组的程序，缩短了反应时间，简化了改组技术，操作更为简单。体外随机重组 随机引物体外重组法是以单链DNA为模板，用一套随机序
11、列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，然后进行类似于DNA shuffling的的PCR反应中，这些DNA短片段互为引物在DNA聚合酶作用下，经反复的热循环可重新组装成全长的基因，克隆到表达载体上，获得多样性文库。 体外随机引发重组原理 DNA家族改组DNA家族改组（DNA family shuffling） 以来自不同种属的同源基因作为重排对象，用DNase I切割为随机片段，得到的片段经过不加引物的多次PCR 循环, 使DNA序列发生重排而引起基因突变的技术。DNA家族改组技术打破不同种、属间的遗传界限，利用同源
12、基因之间的同源序列进行DNA改组，由于一个天然酶的基因都经过了千百万年的进化，并且基因之间存在比较显著的差异，所以获得的突变重组库既体现了基因的多样性，又最大限度的排除了那些不需要的突变，大大加快进化进程。 DNA家族改组与DNA改组：DNA家族改组从基因家族的不同同源基因出发进行DNA重新排布，而DNA改组从同一亲本产生的两个以上正向突变体基因出发进行DNA重新排布。Crameri等尝试将来自不同菌属、同样编码头孢菌素C酶的4个具有58 % -82 %同源度的基因进行改组试验，并与单个基因改组的实验结果进行对比。结果发现，单个基因改组获得的克隆对头孢菌素C的抗性只提高了8倍，而家族基因改组能
13、使菌株对头孢菌素C的抗性提高270 - 540倍，比使用单个基因改组的方法提高约34-68倍， 第三节 酶突变基因的定向选择定向选择的过程：突变基因基因载体突变基因文库筛选目的基因基因重组一、突变基因文库的构建 将各种不同的突变基因与载体重组，转入适当的细胞或包装成噬菌体的过程。1、构建文库的质量要求文库的包容性文库的完整性2、文库的构建过程主要包括：载体选择、基因重组、形成基因文库。2.1载体选择常用载体为质粒载体、噬菌体载体、噬菌体载体、粘粒载体、噬菌粒载粘粒载体、噬菌粒载体等。体等。质粒载体 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能分子，
14、能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。传给子代细胞。 质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状，如质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状，如质粒携带的氨苄青霉素抗性基因使宿主细胞对氨苄青霉素产生质粒携带的氨苄青霉素抗性基因使宿主细胞对氨苄青霉素产生抗性，从而轻易地筛选出成功转化了质粒的细菌。抗性，从而轻易地筛选出成功转化了质粒的细菌。 载体质粒上往往还引入了载体质粒上往往还引入了“多克隆位点（多克隆位点（multiple cloning sites）”，即一段人工合成的即一段人工合成的DNA
15、序列，上面含有密集的多种序列，上面含有密集的多种限制性酶切位点，以供插入外源基因片段。限制性酶切位点，以供插入外源基因片段。 另外，较好的载体往往还引入多种用途的辅助序列，如供蓝另外，较好的载体往往还引入多种用途的辅助序列，如供蓝白斑筛选的白斑筛选的 LacZ 基因。基因。 pBR322 质粒图谱氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素抗四环素抗性基因性基因多克隆位点多克隆位点pUCpUC 质质粒图谱粒图谱突变型突变型lac- E.coli表达表达-半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的 片段。片段。多克隆位点多克隆位点编码编码-半乳半乳糖苷酶的糖苷酶的片段片段噬菌体载体噬菌体载体 是一种细菌病毒，可作为
16、克隆载体。其优点是是一种细菌病毒，可作为克隆载体。其优点是可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。 目前使用的噬菌体载体主要有目前使用的噬菌体载体主要有噬菌体衍生物载噬菌体衍生物载体、单链体、单链M13噬菌体载体等。除噬菌体载体等。除M13噬菌体载体外，噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源较大的外源DNA片段（如片段（如20kb以上）。以上）。噬 菌 体头部尾部尾丝噬菌体感染细菌示意图M M1313噬菌体噬菌体 目目前前常常用用的的单单链链载载体体是是经经改改建建的的M13m
17、P系系列列。其其中中引引入入了了lacZ基基因因一一部部分分和和多多克克隆隆位位点点，因因此此也也可可用用蓝蓝白白斑斑筛筛选选重重组组DNA。M13噬噬菌菌体体基基因因组组是是单单链链环环状状DNA，当当它它侵侵犯犯宿宿主主菌菌后后，在在细细菌菌胞胞内内酶酶的的作作用用下下，单单链链DNA转转变变成成复复制制型型双双链链DNA，可提取出来做基因重组。可提取出来做基因重组。双双链链DNA在在大大肠肠杆杆菌菌中中复复制制100-200拷拷贝贝后后，M13的的合合成成转转变变成成不不对对称称地地合合成成双双链链中中的的一一条条，产产生生大大量量单单链链DNA，并并包包装装成成成成熟熟的的噬噬菌菌体体
18、颗颗粒粒，透透出出菌菌壁壁，释释放放到到培培养养基基中中。因因此此可以从大肠杆菌培养基中分离单链可以从大肠杆菌培养基中分离单链DNA。n M M1313噬噬菌菌体体的的最最大大特特点点就就是是能能产产生生单单链链DNADNA，这是独一无二的。这是独一无二的。n 因因此此从从培培养养基基上上收收获获到到的的含含目目的的基基因因的的M M1313单单链链DNADNA可可直直接接作作为为模模板板进进行行双双脱脱氧氧链链终终止止法法测测序和寡核苷酸定点突变。序和寡核苷酸定点突变。粘粒载体（粘粒载体（cosmid vector，柯斯质粒载体），柯斯质粒载体） 粘粒载体由质粒DNA和噬菌体DNA两部分组成
19、。 粘粒具有质粒的特性，在宿主细胞中能自主复制，有克隆位点，也有抗药性基因。 同时粘粒又具有噬菌体的特性。在DNA中主要是DNA的粘性末端COS位点及其与包装有关的短片段。能按噬菌体DNA分子的同样方式环化起来，克隆外源DNA后，经体外包装能高效进入大肠杆菌细胞。 粘粒的一大特点是能容纳长达3545kb的大片段外源DNA，因此常用作大片段外源DNA的克隆。2.2、基因重组-DNA分子的体外连接 通过不同途径获取含目的基因的外源DNA，选择或改建适当的克隆载体后，下一步工作是如何将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的体外重组。 这种人工DNA重组是靠DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻
20、的5 端磷酸与3 端羟基之间形成磷酸二酯键。通常所用的连接酶是T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 质粒载体质粒载体 外源外源DNA 抗生素抗生素抗性基因抗性基因EcoR I 含含重重组组质质粒的克隆粒的克隆转转化化进进抗抗生生素素敏敏感感的受体细胞的受体细胞涂涂布布含含抗抗生生素素的的琼脂平板琼脂平板连接连接 EcoR I 外源外源DNA 含含抗抗生生素素的的琼琼脂平板脂平板粘性末端连接碱性磷酸酶处理载碱性磷酸酶处理载体分子后连接体分子后连接 平端连接平端连接 因载体分子和目的因载体分子和目的DNA分子之间并不一定都产生互分子之间并不一定都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切
21、成平端。有时所补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切成平端。有时所需用的两种限制性内切酶切割后形成非互补的粘性末端，需用的两种限制性内切酶切割后形成非互补的粘性末端，此时需设法使之变成平端，如用此时需设法使之变成平端，如用S1核酸酶消化或用核酸酶消化或用Klenow片段和片段和dNTP补平补平3 端，成为平末端。端，成为平末端。 平末端仍用平末端仍用T4DNA连接酶连接，只是效率低，需要的连接酶连接，只是效率低，需要的DNA浓度更高。浓度更高。 修饰末端连接修饰末端连接 连连接接子子（linkerlinker）是是指指人人工工合合成成的的一一段段双双链链寡寡核核苷苷酸酸，其其中中包包含含一一个个
22、（或或两两个个）酶酶切切位位点点。首首先先将将接接头头与与目目的的DNADNA片片段段进进行行平平末末端端连连接接，继继而而用用适适当当的的内内切切酶酶将将接接头头部部位位切切出出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。 插插头头（adaptor，又又叫叫适适配配子子）与与接接头头的的区区别别在在于于其其一一侧侧末末端端是是一一个个粘粘性性末末端端（内内含含限限制制性性内内切切酶酶位位点点），而而另另一一侧侧为为平平末末端端，也也可可以以是是粘粘末末端端。将将其其与与目目的的DNA片片段段进进行行平平端端或或粘粘端端连连接接后后，即即可可直直接接与与载载体体
23、连连接。接。2.3、组装突变基因文库-重组DNA导入受体细胞 目目的的基基因因与与载载体体在在体体外外重重组组后后应应导导入入受受体体细细胞胞中中才才能能扩扩增增并并进一步筛选。进一步筛选。转转化化（transformationtransformation）将将质质粒粒或或以以它它为为载载体体构构建建的的重重组组分分子子导入受体细胞的过程。导入受体细胞的过程。感感染染（infectioninfection）以以噬噬菌菌体体粘粘性性质质粒粒和和真真核核病病毒毒作作载载体体构构建建的的重重组组分分子子，在在体体外外经经过过包包装装成成具具有有感感染染能能力力的的病病毒毒或或嗜嗜菌菌体体颗颗粒粒，感
24、染适当细胞并在细胞内扩增的过程。感染适当细胞并在细胞内扩增的过程。 基基因因工工程程中中的的受受体体细细胞胞又又叫叫宿宿主主细细胞胞，分分为为两两类类：原原核核细细胞胞（如如大大肠肠杆杆菌菌、枯枯草草杆杆菌菌等等）和和真真核核细细胞胞（如如酵酵母母细细胞胞、哺哺乳动物细胞及昆虫细胞等）。乳动物细胞及昆虫细胞等）。 1 1、容易接纳重组分子。、容易接纳重组分子。 2 2、对载体的复制扩增无严格限制。、对载体的复制扩增无严格限制。 3 3、不存在特异的内切酶降解外源、不存在特异的内切酶降解外源DNADNA。 4 4、不对外源不对外源DNADNA进行修饰。进行修饰。 5 5、还需、还需根据选用的载体
25、及其所具备的筛选标记。根据选用的载体及其所具备的筛选标记。 如如质质粒粒pBR322pBR322用用氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因（AmpAmpr r）和和四四环环素素抗抗性性基基因因（TetTetr r）作作筛筛选选标标记记，受受体体细细胞胞则则用用对对AmpAmp和和TetTet敏敏感感的的大肠杆菌大肠杆菌HB101HB101细胞。细胞。 将将外外源源DNADNA导导入入靶靶细细胞胞的的方方法法很很多多，应应根根据据实实验验目目的的、受受体体细胞种类、外源基因大小等不同来选择。细胞种类、外源基因大小等不同来选择。导入方法大致分为三类导入方法大致分为三类化学方法：如化学方法：如CaCl
26、CaCl2 2转化法、磷酸钙共沉淀法。转化法、磷酸钙共沉淀法。物物理理方方法法：如如电电脉脉冲冲介介导导法法、显显微微注注射射法法、基基因因发发射射枪枪一一类类的颗粒轰击技术等。的颗粒轰击技术等。生生物物方方法法：包包括括原原生生质质融融合合法法、脂脂质质体体介介导导法法，以以及及噬噬菌菌体的体外包装感染法和逆转录病毒和体的体外包装感染法和逆转录病毒和DNADNA病毒介导的转染法。病毒介导的转染法。 基基因因片片段段（特特别别是是纯纯化化的的DNADNA）很很难难直直接接导导入入受受体体细细胞胞，通通常常将将受受体体细细胞胞预预先先加加以以处处理理，使使其其提提高高基基因因导导入入细细胞胞的的
27、效效率率。例例如如用用低低温温CaClCaCl2 2（冰冰浴浴）处处理理大大肠肠杆杆菌菌，可可以以大大大大提提高高质质粒粒的的转转化化效效率率。这这种种经经过过预预处处理理的的、容容易易导导入入外外源源核核酸酸分分子子的的受受体体细细胞胞被被称称作作“感感受受态态细细胞胞”（competent competent cellcell）。）。感受态细胞感受态细胞CaCa2+2+诱导的完整细胞的转化（大肠杆菌，革兰氏阳性）诱导的完整细胞的转化（大肠杆菌，革兰氏阳性）19701970年建立了此技术，其原理是与细菌外膜磷脂在低温年建立了此技术，其原理是与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩作用，
28、使细胞出现空隙，下形成液晶结构，并发生收缩作用，使细胞出现空隙，细菌这时的状态就是感受态。细菌这时的状态就是感受态。二、突变基因的筛选二、突变基因的筛选1、定向选择环境条件的设定 定向进化中，突变具有随机性，通过选择特定方向的选择特定方向的选择特定方向的选择特定方向的突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势，定向选择的环境条件的设定是依据定向进化的目标而设定。2、高通量筛选技术 随着分子生物学技术的发展，定向进化中突变基因文库构建技术日益成熟，然而多样性文库构建好后，酶的有利突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中，高通量、高灵敏度的筛选方法则成为决定定向进
29、化实验成败与否的关键。根据原理不同，目前常用的高通量筛选方法可归为3种：平板筛选法；荧光筛选法；噬菌体表面展示法、酵母细胞表面展示法等。 平板筛选法平板筛选法是最为简便的高通量筛选方法，它是将含有突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，然后针对重组菌的表型不同筛选出有利的突变体。平板筛选法直接将突变基因与宿主菌的表型联系起来。具有简单、快速、直观等特点。依据重组细胞的表型不同可分为以下几种：依据细胞生长情况筛选突变基因 依据颜色变化筛选突变基因 依据透明圈大小筛选突变基因依据细胞生长情况筛选突变基因以提高热稳定性为目标： 将接种有重组细胞的平板放置于较高温度培养。以提高对抗生
30、素耐受性为目标 将重组细胞接种于含较高抗生素浓度的平板进行培养。以提高酶的pH耐受性为目标 将重组细胞接种于极端pH的平板培养基进行培养。以提高酶对极端环境的耐受性为目标 将将重组细胞接种于平板上在极端条件下进行培养。 依据颜色变化筛选突变基因 依据透明圈大小筛选突变基因在平板中加入目的酶的作用底物，接种于含突变基因的重组细胞，依据产生的透明圈的大小选取活性较高的突变体。荧光筛选法通过荧光产生与否及荧光的强弱筛选突变基因的方法。通常是将具有荧光激发特性的物质的编码基因做为报告基因与突变基因一起克隆入宿主中。常见的报告基因为绿色荧光蛋白。噬菌体表面展示法利用噬菌体的外膜结构蛋白与一些特定的外源蛋
31、白或者多肽富集在噬菌体表面的一种技术。原理：将目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。噬菌体表面展示法的特点：通过可以从突变基因文库中将与外膜蛋白融合表达的外源基因蛋白进行富集，通过筛选获得有效基因，将无效基因去除。酵母细胞表面展示法酵母表面展示技术是利用可以锚定在酵母表面的特定蛋白（凝集素蛋白）与外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使目标外源蛋白或多肽富集于酵母表面
32、的一种技术。酵母细胞表面展示系统的分类：目的蛋白-凝集素表面展示系统 目的蛋白作为N端与凝集素蛋白的C端部分融合，形成的融合蛋白通过凝集素蛋白共价连接到细胞壁的葡聚糖上进而展示到酵母表面。a凝集素-目的蛋白表面展示系统 目的蛋白作为C端与a凝集素蛋白的N端部分融合，形成的融合蛋白再通过a凝集素蛋白共价连接到细胞壁的葡聚糖上进而展示到酵母表面。酵母细胞表面展示法的特点：能够展示需糖基化作用、二硫键异构化等翻译后修饰才具功能活性的复杂真核蛋白。酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCR-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/
33、有机相活性易错PCR/DNA改组 胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组定向进化在酶改造中的应用定向进化在酶改造中的应用提高酶的催化效率提高酶的催化效率 大多数情况下，天然酶的活性太低以至于不能适用于工业和治疗用途。通过定向进化加强酶的催化效率对提高工业生产效率和降低生产成本是必须的。nCastle通过11轮DNA重组对草甘膦N-乙酰转移酶（GAT）进行定向进化，得到比亲本酶催化效率提高10000倍的突变体且突变酶的半衰期比亲本
34、酶延长5倍。nBatt S B通过三轮易错PCR和DNA重组对具有应用于生产玉米添加剂和生物乙醇潜力的淀粉水解酶进行定向进化，得到比天然酶催化效率提了1000倍的突变体提高酶稳定性提高酶稳定性 许多工业应用要求酶在较高温度或非自然环境下仍能保持其稳定性，而酶的稳定性受多种因素如氨基酸序列、三维结构以及辅助因子等的影响。通过定向进化来提高酶的热稳定性是该领域研究的比较多的一个方向，Acharya等使用两轮易错PCR的方法使Bacillus subtilis脂肪酶的半衰期提高了300倍，研究发现该酶热稳定性的提高是由3个氨基酸的突变引起的。Johannes T W等 对用于NAD（P）H再生的亚磷
35、酸盐脱氢酶进行定向进化，获得了在45 的半衰期增加7000倍的突变酶。 改变酶的底物特异性改变酶的底物特异性底物特异性是酶催化作用的最重要特性，通过酶定向进化可以改变酶催化作用的底物特异性。是酶对某种底物的特异性升高或降低。甚至出现出另一种酶的催化活性。1.野生型的大肠杆菌氨基酸转移酶几乎不能用于-型底物，而经过4轮DNA重组将天门冬氨酸转移酶对缬氨酸和2-双加氧缬氨酸底物的活力提高了大约5倍，而对天然底物门冬氨酸的活力却下降了大约30倍。对人碳酸酐酶II通过三轮突变、选择和重组，对酯类底物2-萘基醋酸盐的活性增加了40倍。总结与展望酶定向进化技术可以使酶在自然界需几百万年才能完成的进化过程缩短到几年甚至几月，而且它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，它不仅能使酶进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单一优良特性的酶，还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加，产生具有多项优化功能的酶，这大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是它能够解决理性设计所不能解决的问题，从而使我们能较快多地了解酶蛋白结构与功能之间的关系。
