第二章基因工程及其在食品科学中的应用

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1、第二章第二章 基因工程及其在食品科学中的应用基因工程及其在食品科学中的应用uu基因工程基础基因工程基础基因工程基础基因工程基础uu基因工程研究方法基因工程研究方法基因工程研究方法基因工程研究方法uu基因工程在食品科学中的应用基因工程在食品科学中的应用基因工程在食品科学中的应用基因工程在食品科学中的应用第一节第一节 基因工程基础基因工程基础一、基因工程的定义、意义及研究内容一、基因工程的定义、意义及研究内容一、基因工程的定义、意义及研究内容一、基因工程的定义、意义及研究内容 （一）基因工程的定义（一）基因工程的定义（一）基因工程的定义（一）基因工程的定义 gene engineeringgene

2、 engineering genetic engineeringgenetic engineering recombinant DNA technique recombinant DNA technique Molecular cloningMolecular cloning（二）基因工程的意义（二）基因工程的意义（二）基因工程的意义（二）基因工程的意义 基因工程基因工程基因工程基因工程是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特点是可打破生物点是可打破生

3、物点是可打破生物点是可打破生物种属界限种属界限种属界限种属界限，进行生物种，进行生物种，进行生物种，进行生物种( (属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界) )内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。 遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症症、骨质疏松症症、骨质

4、疏松症症、骨质疏松症（三）基因工程的研究内容（三）基因工程的研究内容（三）基因工程的研究内容（三）基因工程的研究内容 制备目的基因制备目的基因构建重组构建重组DNA 获得转化体获得转化体 筛选出重组转化体阳性克隆筛选出重组转化体阳性克隆 筛目的基因在受体生物筛目的基因在受体生物细胞中高效表达隆细胞中高效表达隆 二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶 基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的关关关关键键键键技技技技术术术术之之之之一一一一就就就就是是是是先先先先将将将将目目目目的的的的基基基基因因因因DNADNA从从从从供供供供体体体体生生生生物物物物体

5、体体体中中中中分分分分离离离离出出出出来来来来，再再再再与与与与合合合合适适适适载载载载体体体体DNADNA连连连连接接接接重重重重组组组组等等等等，这这这这些些些些分分分分子子子子操操操操作作作作涉涉涉涉及多种不同的及多种不同的及多种不同的及多种不同的酶酶酶酶。主要包括：。主要包括：。主要包括：。主要包括： 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 DNADNA甲基化酶、甲基化酶、甲基化酶、甲基化酶、 DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNA的的的的RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 连接酶连接酶连接酶连接酶 激酶激酶激酶激酶 磷酸

6、酶磷酸酶磷酸酶磷酸酶 核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 （一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与DNADNA甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶1 1、定义、定义、定义、定义 restriction restriction endonucleaseendonuclease：指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶 DNA DNA methylasemethylase ：是指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 2 2、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类、限制

7、性酶（甲基化酶）的命名和分类、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类(1) (1) 限制酶限制酶限制酶限制酶( (甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶) )的命名的命名的命名的命名 其命名主要是参照其命名主要是参照HOSmith和和D. Nathans提出的待命名提出的待命名酶的供体微生物的属名酶的供体微生物的属名与与种名种名相结合的原则进行的，具体如下：相结合的原则进行的，具体如下： 以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式 如：如：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶用Eco表示；来源于流感嗜血菌(Haemophilus influenza

8、e)的用Hin表示 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母 如：如：来自Haemophilus parainfluenzae (副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示，而来自同一属的Haemophilus parahaemolyticus (副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。 当微生物具有当微生物具有特殊名称特殊名称时，则将代表该特殊名称的时，则将代表该特殊名称的符号符号置于上置于上述三字母符号之后述三字母符号之后 如：如：如：如：来自来自HaemophilusHaemophilus in

9、fluenzaeinfluenzae的的RdRd株的用株的用HindHind表示；来自表示；来自HaemophilusHaemophilus influenzaeinfluenzae的的RfRf型的用型的用HinfHinf表示。表示。 当不止当不止一种限制酶一种限制酶( (甲基化酶甲基化酶) )分离纯化自分离纯化自同一微生物株系同一微生物株系时，时，则依其被分离的先后顺序则依其被分离的先后顺序以罗马数字以罗马数字( (大写大写) )置于上述命名符号置于上述命名符号之后之后 如：如：如：如：来自来自HaemophilusHaemophilus aegytiusaegytius的三种酶分别用的三种

10、酶分别用HaeHae I I、HaeHae 和和HaeHae表示；来自表示；来自HaemophilusHaemophilus influenzaeinfluenzae的的RdRd株的三种酶分别用株的三种酶分别用Hind IHind I、HindHind和和HindHind表示。表示。 为了区别起见，在上述命名名称之前为了区别起见，在上述命名名称之前加加R R表示表示限制酶类限制酶类限制酶类限制酶类；在；在上述命名名称之前加上述命名名称之前加MM表示表示甲甲基化酶类基化酶类基化酶类基化酶类 如：如：如：如：来自来自HaemophilusHaemophilus influenzaeinfluenz

11、ae的的RdRd株的第三种限制性内切核株的第三种限制性内切核酸酶为酸酶为R. HindR. Hind，其相应的，其相应的DNADNA甲基化酶则为甲基化酶则为M. HindM. Hind。大鼠生长激素基因大鼠生长激素基因转入小鼠转入小鼠(2) 限制酶的分类限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型: I型型: 三种三种不同亚基组成；辅助因子为不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及及S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是切割作用是随机的随机的 型型: 两个两个相同亚基组成；辅助因子仅为相同亚基组成；辅助因子

12、仅为Mg2+；其识别位点常具；其识别位点常具旋转旋转 对称性对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近附近；且切割作；且切割作 用用特异性强特异性强 型型: 两种两种不同亚基组成；辅助因子为不同亚基组成；辅助因子为ATP和和Mg2+，也受，也受S-腺苷甲硫腺苷甲硫 氨酸激活氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3端端 2426bp处处 PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5 限制性内切酶的旋转对称性限制性内切酶的旋转对称性 需

13、要指出的是需要指出的是，I型和型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有相同的识别序列。 (3)型限制性内切核酸酶的基本特性型限制性内切核酸酶的基本特性 识别序列与切割位点识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链的双链DNA特定序特定序列，该识别序列列，该识别序列(识别位点识别位点)常呈常呈旋转对称性旋转对称性 切割方式切割方式 平齐末端平齐末端 、5磷酸端磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端个核

14、苷酸突出单链黏性末端 、3-羟基端羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端个核苷酸突出单链黏性末端 5 33 5 5 33 55突出突出3突出突出 平端平端5 33 5型限制性内切核酸酶切割方式型限制性内切核酸酶切割方式 同裂酶与同尾酶同裂酶与同尾酶isoschizomer ：在型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者 如：如：Hpa和Msp I两者的识别序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者为同裂酶 isocaudamer ：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者 如：如：BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I、Sau3A I及Xho切割DNA后都形

15、成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶 需要指出的是需要指出的是，由同尾酶同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。 限制性片段长度与切割频率限制性片段长度与切割频率限制性片段长度与切割频率限制性片段长度与切割频率 经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段称为称为限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段(restriction fragment)(restriction fragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不一 假设在某DNA分子中，A或T出现的频率为X，G或C出现的频率为Y，那

16、么某限制酶在该DNA分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率) F可用下式表示： F=XnYm 式中：n该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目；m该限制酶识别序列中双链G=C碱基对的数目 如果构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该DNA分子上的理论切割位点数目(N)为： N=BF 假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)4，即1256，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。 同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)6，即1

17、4096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。 需要指出的是：需要指出的是：实际情况与理论不相符 (4) 影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略 底物底物DNA制备物的纯度制备物的纯度：蛋白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。 底物底物DNA的甲基化程度：的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。 底物底物DNA的结构构型：的结构构型：环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量

18、为线性DNA的1020倍。 酶反应缓冲液的组成：酶反应缓冲液的组成： 酶反应的最适温度：酶反应的最适温度： 为了提高限制酶对底物为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反应效率，一般低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法采用如下方法：a 增加限制酶的用量(平均每g底物DNA可用10IU甚至更多些)；b 延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全；c 扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用；d 在反应液中加入适量亚精胺(一般应用浓度为12.5mmolL)，以利限制酶对基因组DNA的酶解作用。(5) 限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点限制性内切核酸酶酶解反应的操作步

19、骤及注意要点 (二二) DNA聚合酶聚合酶 最常用的依赖于最常用的依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶有有大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I(全全酶酶)、大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段(Klenow片段片段)、T4噬菌体编码噬菌体编码的的DNA聚合酶聚合酶、耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶(TaqDNA聚合酶聚合酶)等等 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，即聚合酶，即逆转录酶逆转录酶，优先以，优先以RNA为模板为模板，也可以也可以DNA为模板，因此该聚合酶能以为模板，因此该聚合酶能以RNA为模板催化合成双链为模板催化合成双链DNA 1 1、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆

20、菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I( I(全酶全酶全酶全酶) ) 来源：来源：来源：来源：大肠杆菌；大肠杆菌； 分子量：分子量：分子量：分子量：10910109103 3的多肽链的多肽链 （1 1）作用）作用）作用）作用 具有具有53DNA53DNA聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基的自由羟基的DNADNA片段为引物；片段为引物； 5353外切核酸酶活性，从外切核酸酶活性，从55端既降解双链端既降解双链DNADNA，也降解，也降解RNA-DNARNA-DNA杂交体中的杂交体中的RNARNA链链(RNA(RNA酶酶H H活性活性) )； 3

21、535外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带33自由羟基的双链自由羟基的双链DNADNA或单链或单链DNADNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 以切刻平移法以切刻平移法(nick translation)(nick translation)标记标记DNADNA。在所有聚合酶中，只有该。在所有聚合酶中，只有该酶能用于此反应，因为只有其具有酶能用于此反应，因为只有其具有5353外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。 对对DNADNA分子的分子的33突出尾进行末端标记。突出尾进行末端标记。DNA 聚合酶聚合酶2 2、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合

22、酶聚合酶聚合酶I I大片段大片段大片段大片段( (KlenowKlenow片段片段片段片段) ) 来源：来源：来源：来源：由大肠杆菌由大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可通过克隆技术获得。通过克隆技术获得。 分子量：分子量：分子量：分子量：7610376103的多肽链的多肽链（1 1）作用）作用）作用）作用 53DNA53DNA聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基的自由羟基的DNADNA片段为引物；片段为引物； 3535外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带33自由羟

23、基的双链自由羟基的双链DNADNA或单链或单链DNADNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 补平限制酶切割双链补平限制酶切割双链DNADNA所产生的所产生的33凹端；凹端； 如果以标记的如果以标记的dNTPdNTP补平双链补平双链DNADNA的的33凹端，那么可对凹端，那么可对DNADNA分子进行末分子进行末端标记；端标记； 对对DNADNA分子的分子的33突出尾进行末端标记；突出尾进行末端标记； 在在cDNAcDNA克隆中，合成克隆中，合成cDNAcDNA第二链；第二链； 应用应用SangerSanger双脱氧链末端终止法进行双脱氧链末端终止法进行DNADNA测序。测序。

24、Klenow 酶的作用方式酶的作用方式 3 3、T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：T4T4噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：分子量：分子量：分子量：11410114103 3（1 1）作用）作用）作用）作用 53DNA53DNA聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基的自由羟基的DNADNA片段为引物；片段为引物； 3535外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带33自由羟基的双链自由羟基的双链DNADNA或单链或单链DNADNA；（2 2）主要用途）主要用途）主要用

25、途）主要用途 补平限制酶切割双链补平限制酶切割双链DNADNA产生的产生的33凹端；凹端； 如果以标记的如果以标记的dNTPdNTP补平双链补平双链DNADNA的的33凹端，那么可对凹端，那么可对DNADNA分子进行末分子进行末端标记；端标记； 对对DNADNA分子的分子的33突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶；末端标记的首选酶； 将双链将双链DNADNA的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链DNADNA时，经常利用这一特性。时，经常利用这一特性。4 4、TaqD

26、NATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：水生栖热菌水生栖热菌( (ThermusThermus aquaticusaquaticus) )，现可由基因工程途径来生产，现可由基因工程途径来生产 分子量：分子量：分子量：分子量：6510365103，是一种非常耐热的依赖于，是一种非常耐热的依赖于DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。（1 1）作用）作用）作用）作用 具有具有53DNA53DNA聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链DNADNA为模板，以带为模板，以带33自由羟基自由羟基的的DNADNA片段为引物。片段为引物。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要

27、用途 对对DNADNA进行测序；进行测序； 通过聚合酶链式反应通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction(polymerase chain reaction，PCR)PCR)对对DNADNA分子的分子的特定序列进行体外扩增。特定序列进行体外扩增。5 5、逆转录酶、逆转录酶、逆转录酶、逆转录酶( (依赖于依赖于依赖于依赖于RNARNA的的的的DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶) ) 来源：来源：来源：来源：一种来自一种来自禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒(AMV)(AMV)，分子量为，分子量为17010170103 3； 一种来自能一

28、种来自能表达克隆化的表达克隆化的表达克隆化的表达克隆化的MoloneyMoloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒(Mo-MLV)(Mo-MLV)逆逆逆逆 转录酶基因的大肠杆菌转录酶基因的大肠杆菌转录酶基因的大肠杆菌转录酶基因的大肠杆菌，分子量为，分子量为8410384103。（1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途6 6、末端脱氧核苷酸转移酶、末端脱氧核苷酸转移酶、末端脱氧核苷酸转移酶、末端脱氧核苷酸转移酶( (末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶) ) 来源：来源：来源：来源：小牛胸腺小牛胸腺小牛胸腺小牛胸腺 分子量：分子量：分

29、子量：分子量：6010360103 （1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途( (三三三三) ) 依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNA的的的的RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶1 1、SP6SP6噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：SP6SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2LT2株。株。（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即53 RNA53 RNA聚合酶活性聚合酶活性，识别双，识别双链链DNADNA模板上相应的噬菌体特异性启动子，并

30、且以此双链模板上相应的噬菌体特异性启动子，并且以此双链DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 合成单链合成单链RNARNA，制备杂交探针；，制备杂交探针； 合成单链合成单链RNARNA作为体外翻译系统中的功能性作为体外翻译系统中的功能性mRNAmRNA或体外剪接或体外剪接反应的底物。反应的底物。2 2、T7T7或或或或T3T3噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 来源：来源：来源：来源：T7T7或或T3T3噬菌体感染的大肠杆菌。噬菌体感染的大肠杆菌。（1 1）作用）作用）作用）作用该类酶主要具有一种活性，即该类酶主

31、要具有一种活性，即53 RNA53 RNA聚合酶活性，识别双链聚合酶活性，识别双链DNADNA模板模板上相应的噬菌体特异性的启动子，并以此双链上相应的噬菌体特异性的启动子，并以此双链DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 合成单链合成单链RNARNA，制备杂交探针；，制备杂交探针； 合成单链合成单链RNARNA作为体外翻译系统中的功能性作为体外翻译系统中的功能性mRNAmRNA或体外剪接反应的或体外剪接反应的底物；底物； 利用带有利用带有T7T7噬菌体启动子的载体在大肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。噬菌体启动子的载体在大肠杆菌和酵母中表达克

32、隆化基因。( (四四四四) ) 连接酶、激酶及磷酸酶连接酶、激酶及磷酸酶连接酶、激酶及磷酸酶连接酶、激酶及磷酸酶 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶(DNA (DNA ligaseligase) )：是指将两段：是指将两段DNADNA拼接起来的酶类。在拼接起来的酶类。在基因工程中，最常见的基因工程中，最常见的DNADNA连接酶为连接酶为T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶。连接酶。 RNARNA连接酶连接酶连接酶连接酶( (RNAligaseRNAligase) )：能使含：能使含55磷酸基端及磷酸基端及33羟基端的单链羟基端的单链RNA(RNA(或或DNA)DNA)共价连接起来。该酶主要

33、用于对共价连接起来。该酶主要用于对RNARNA进行进行3 3 末端末端标记，即将标记，即将3232P P标记的标记的33，55二磷酸单核苷二磷酸单核苷( (pNppNp) )加到加到RNARNA的的33羟基端。羟基端。1 1、T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 来源：来源：来源：来源：T4T4噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：分子量：分子量：分子量：681068103 3（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即催化该酶主要具有一种活性，即催化DNADNA的的55磷酸基与磷酸基与33羟基羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏

34、性末端之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端DNADNA、平齐、平齐末端末端DNADNA、带切刻的、带切刻的DNADNA等。等。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 连接带匹配黏性末端的连接带匹配黏性末端的DNADNA分子。分子。 使平齐末端的双链使平齐末端的双链DNADNA分子互相连接或与合成接头相连接。这分子互相连接或与合成接头相连接。这类反应要比黏性末端连接慢得多。类反应要比黏性末端连接慢得多。 2 2、T4T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶 来源：来源：来源：来源：T4T4噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌（1 1）作用

35、）作用）作用）作用 具有激酶磷酸化活性，催化具有激酶磷酸化活性，催化ATPATP的广磷酸基转移至的广磷酸基转移至DNADNA或或RNARNA的的55末末端；端； 具有具有33磷酸酶活性，该酶的核酸底物为双链磷酸酶活性，该酶的核酸底物为双链DNADNA、单链、单链RNARNA或或DNADNA、DNADNA切刻或缺口、寡核苷酸等。切刻或缺口、寡核苷酸等。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 标记标记DNADNA的的55端，以供端，以供MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert法测序、法测序、S1S1核酸酶分析以及其核酸酶分析以及其他必须使用末端标记他必须使用末端标记DNADN

36、A操作之需；操作之需； 对准备用于连接但缺乏对准备用于连接但缺乏55磷酸的磷酸的DNADNA或合成接头进行磷酸化。或合成接头进行磷酸化。 3 3、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶 来源：来源：来源：来源：大肠杆菌及牛小肠大肠杆菌及牛小肠（1 1）作用）作用）作用）作用 这两种来源的碱性磷酸酶，即这两种来源的碱性磷酸酶，即细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶( (bacteribacteri alalkalinealalkaline phosphatasephosphatase，BAP)BAP)和和牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶(calf (calf inte

37、stinal alkaline intestinal alkaline phosphatasephosphatase，CIP)CIP)均具磷酸酶活性，催化去除均具磷酸酶活性，催化去除55磷酸的反应。该酶的底物为单链或双链磷酸的反应。该酶的底物为单链或双链DNADNA及及RNARNA、rNTPrNTP和和dNTPdNTP。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 在用在用32P 32P 标记标记55末端前，去除末端前，去除DNADNA或或RNARNA分子的分子的55磷酸；磷酸； 去除去除DNADNA片段片段55磷酸，以防自身环化。磷酸，以防自身环化。（五）核酸酶（五）核酸酶（五）核酸酶（

38、五）核酸酶 1 1、BAL31BAL31核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 来源：来源：来源：来源：埃氏交替单胞菌埃氏交替单胞菌( (AlteromonasAlteromonas espejiana espejiana)BAL31)BAL31。（1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 2 2、S1S1核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 来源：来源：来源：来源：米曲霉米曲霉( (AspergillusAspergillus oryzaeoryzae) ) （1 1）作用）作用）作用）作用（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途3 3、核糖核酸酶、核糖核酸酶、核糖核酸酶

39、、核糖核酸酶A(RNAA(RNA酶酶酶酶A)A) 来源：来源：来源：来源：牛胰脏牛胰脏（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸酶活性，特异地作用于，特异地作用于RNARNA分子上嘧啶残基分子上嘧啶残基(C(C和和U)U)的的33端，切割其与相邻核苷酸形成的磷酸二端，切割其与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。在低盐浓度下，其可切割单链、双链酯键。在低盐浓度下，其可切割单链、双链RNARNA及及DNA-RNADNA-RNA杂交体中杂交体中的的RNARNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 从从DNA-RNADNA-R

40、NA杂交体和杂交体和RNA-RNARNA-RNA杂交体中去除未杂交的杂交体中去除未杂交的RNARNA区。区。 确定确定DNADNA或或RNARNA中单碱基突变的位置。中单碱基突变的位置。RNA-DNARNA-DNA杂交体或杂交体或RNA-RNA-RNARNA杂交体中的单碱基错配可被该酶识别并切割杂交体中的单碱基错配可被该酶识别并切割 4 4、核糖核酸酶、核糖核酸酶、核糖核酸酶、核糖核酸酶H(RNAH(RNA酶酶酶酶H) H) 来源：来源：来源：来源：大肠杆菌大肠杆菌（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸

41、酶活性内切核糖核酸酶活性，特异地水解，特异地水解DNA-DNA-RNARNA杂交体中杂交体中RNARNA的磷酸二酯键，但不降解单链或双链的的磷酸二酯键，但不降解单链或双链的DNADNA或或RNARNA。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 特异地降解特异地降解cDNAcDNA第一链合成时产生的第一链合成时产生的RNA-DNARNA-DNA双链中的双链中的mRNAmRNA分分子，以利双链子，以利双链cDNAcDNA的合成；的合成； 通过合成通过合成DNADNA及与及与RNARNA形成局部的形成局部的RNA-DNARNA-DNA杂交体，诱发该酶催化杂交体，诱发该酶催化特异性的特异性的R

42、NARNA降解。降解。5 5、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶I(DNAI(DNA酶酶酶酶1) 1) 来源：来源：来源：来源：牛胰脏牛胰脏（1 1）作用）作用）作用）作用 该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即内切核酸酶活性内切核酸酶活性内切核酸酶活性内切核酸酶活性，优先从嘧啶核苷酸处，优先从嘧啶核苷酸处水解双链水解双链DNADNA或单链或单链DNADNA。在。在Mg2+Mg2+存在下，该酶可独立作用于双链存在下，该酶可独立作用于双链DNADNA的每一条链，且切割位点呈随机分布；在的每一条链，且切割位点呈随机分布；在Mn2+Mn2+存在下，该酶可在双存在下，该酶可在双链链DNADNA两条链的大致相同位置切割，产生平齐末端两条链的大致相同位置切割，产生平齐末端DNADNA片段或只带片段或只带1 12 2个核苷酸单链突出的个核苷酸单链突出的DNADNA片段。片段。（2 2）主要用途）主要用途）主要用途）主要用途 在以切刻平移法进行在以切刻平移法进行DNADNA标记时，可用该酶在双链标记时，可用该酶在双链DNADNA上产生随机上产生随机切刻；切刻； 建立随机克隆，以便利用建立随机克隆，以便利用M13M13噬菌体载体进行测序；噬菌体载体进行测序； 分析蛋白质分析蛋白质-DNA-DNA复合物复合物(DNA(DNA酶足迹法酶足迹法) )。