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1、单克隆抗体的制备及应用西南大学2XXXXXXXXXXXXXXXXXX 目目 录1 1单克隆抗体的简介2 2单克隆抗体技术发展经历3 3单克隆抗体的制备4 4单克隆抗体的应用5 5展望单克隆抗体的克隆抗体的简介介1 第一部分4XXXXXXXXXXXXXXXXXX单克隆抗体的克隆抗体的简介介19751975年分子生物学家年分子生物学家G.J.F.G.J.F.克勒和克勒和C.C.米尔斯坦在自然杂交米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养技术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养和无限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细和无限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的
2、纯系小鼠脾细胞融合，形成胞融合，形成B B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成易于在体外无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体的特点。和分泌特异性抗体的特点。这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（ mAbs mAbs ），简称单抗。），简称单
3、抗。单克隆抗体技克隆抗体技术的的发展展经历2 第二部分6XXXXXXXXXXXXXXXXX鼠源性单克隆抗体嵌合性单克隆抗体人源化单克隆抗体全人源单克隆抗体鼠源性单克隆抗体是来源于鼠蛋白，因此对于人体而言是外来物从而易被抵抗。嵌合性单克隆抗体是指同时具有人和鼠的来源构成，通常是30%比70%。鼠源部分用来结合抗原，人源部分用来诱导产生疗效。人源化抗体就是指抗体的可变区部分或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。 。单克隆抗体技术发展经历单克隆抗体技术发展经历单克隆抗体的制克隆抗体的制备3
4、第三部分8XXXXXXXXXXXXXXXXXX单克隆抗的制克隆抗的制备动物免疫动物免疫11234细胞融合和选择性培养细胞融合和选择性培养杂交瘤细胞的筛选及克隆化杂交瘤细胞的筛选及克隆化大量制备及纯化大量制备及纯化9XXXXXXXXXXXXXXXXXX单克隆抗体制备的简易流程单克隆抗体制备的简易流程10XXXXXXXXXXXXXXXXXX动物免疫动物免疫抗原制备抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，的机会增加，同时可以减轻筛
5、选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和免疫抗原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只实验室的条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。抗原进行纯化。11XXXXXXXXXXXXXXXXXX免免疫疫动动物物的的选选择择：一一般般的的杂杂交交瘤瘤生生产产都都选选用用BALB/c小小鼠鼠或或LOU/c大大鼠鼠作作为为免免疫疫动动物物。但但是是，有有时时为
6、为了了特特殊殊目目的的而而需需进进行行种种间间杂杂交交，则则可可免免疫疫其其他他动动物物。就就小小鼠鼠而而言言，初初次次免免疫疫时时以以8-12周周龄龄为为宜宜，雌性鼠较便于操作。雌性鼠较便于操作。12XXXXXXXXXXXXXXXXXX免免疫疫程程序序的的确确定定：在在设设计计免免疫疫程程序序时时，应应考考虑虑到到抗抗原原的的性性质质和和纯纯度度、抗抗原原量量、免免疫疫途途径径、免免疫疫次次数数与与间间隔隔时时间间、佐佐剂剂的的应应用用及及动动物物对对该该抗抗原原的的应应答答能能力力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。13XXXXXXXXXXXXXXX
7、XXX目目前前常常用用的的免免疫疫程程序序14XXXXXXXXXXXXXXXXXX细胞融合和选择性培养细胞融合和选择性培养15XXXXXXXXXXXXXXXXXX融合过程中，常采用聚乙二醇（融合过程中，常采用聚乙二醇（PEGPEG）作为融合诱）作为融合诱导剂。导剂。PEGPEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜的水分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的水分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的极性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融的极性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融合合 。注意注意：PEG PEG 的分子量和浓度与融合效果相关，的
8、分子量和浓度与融合效果相关，PEG PEG 的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于3030时，融合时，融合率低。率低。16XXXXXXXXXXXXXXXXXX HAT选择性培养选择性培养1964年年Littlefield首先发明了首先发明了HAT (HHypoxanthine次黄次黄嘌呤，嘌呤，AAminopterin甲氨喋呤，甲氨喋呤，TThymidine 胸腺胸腺嘧啶核苷嘧啶核苷) 选择性培养。选择性培养。HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷选择性培养基是根
9、据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。酸生物合成途径设计的。细胞内细胞内DNADNA的生物合成途径的生物合成途径主要生物主要生物合成途径合成途径补救途径补救途径甲氨喋呤甲氨喋呤次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA叶酸拮抗物氨基蝶呤可阻断主要途径小鼠小鼠HGPRTHGPRT- -骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（Sp2/0Sp2/0）融合后的细胞在融合后的细胞在HATHAT选择培养基中结局选择培养基中结局Sp2/0+BSp2/0Sp2/0BBSp2/0B死亡死亡死亡死亡 存
10、活存活19XXXXXXXXXXXXXXXXXX杂交瘤细胞的筛选及克隆化杂交瘤细胞的筛选及克隆化20XXXXXXXXXXXXXXXXXX 克隆化克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。无关抗体分泌细胞分开。克隆化的克隆化的原则原则：尽早进行，反复：尽早进行，反复4-5次次克隆化方法：克隆化方法：有限稀释法有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆、软琼脂平板法、显微克隆法法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防
11、染色体丢失、变异及污染污染mm11443322424442333244444222443333333333有限稀释法有限稀释法22XXXXXXXXXXXXXXXXXX大量制备及纯化大量制备及纯化大量制备大量制备23XXXXXXXXXXXXXXXXXX纯化方法纯化方法1 1、盐析、盐析2 2、凝胶过滤、凝胶过滤3 3、离子交换层析、离子交换层析4 4、亲和层析法、亲和层析法24XXXXXXXXXXXXXXXXXX盐析盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水
12、化层，使蛋白质胶粒失水高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。发生凝聚而沉淀析出。 血清血清 50%饱和度硫酸胺饱和度硫酸胺 上清上清 （清蛋白）（清蛋白） 沉淀（球蛋白）沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺饱和度硫酸胺 上清上清 沉淀沉淀 拟球蛋白拟球蛋白 r球蛋白球蛋白25XXXXXXXXXXXXXXXXXX 凝胶过滤法凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入。胶粒内，留在胶粒
13、间隙的溶液中，随洗脱液最先流网孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。来。交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶( (SephadexSephadex）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶( (Sepharose)Sepharose)26XXXXXXXXXXXXXXXXXX离子交换层析法离子交换层析法DEAEDEAE纤维素纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴：结合溶液中带负电荷的蛋
14、白质，又称阴离子交换剂离子交换剂CMCM纤维素纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂子交换剂27XXXXXXXXXXXXXXXXXX将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。出纯化的抗体（或抗原）。A A蛋白蛋白- -Sepharose CL 4BSepharose CL 4B亲和层析法：亲和层析法：单克隆抗体的
15、克隆抗体的应用用4 第四部分29XXXXXXXXXXXXXXXXX作为生物治疗的导向武器作为生物治疗的导向武器作为免疫抑制剂作为免疫抑制剂作为研究工作中的探针作为研究工作中的探针增强抗原的免疫原性增强抗原的免疫原性检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂农兽药的快速检测农兽药的快速检测作为亲和层系的配体作为亲和层系的配体应用应用单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用30XXXXXXXXXXXXXXXXXX作为亲和层系的配体作为亲和层系的配体单单克克隆隆抗抗体体能能与与其其相相应应的的抗抗原原特特异异性性结结合合，因因而而能能能能够够从从复复杂杂系系统统中中识识别别出出单单个个成成分分。只只要要得得到到针针对
16、对某某一一成成分分的的单单克克隆隆抗抗体体，固固定定在在层层析析柱柱上上，通通过过亲亲和和层层析析，即即可可从从复复杂杂的的混混合合物物中中分离、纯化这一特定成分。分离、纯化这一特定成分。 优优点点：与与其其他他提提取取方方法法相相比比，具具有有简简便便、快快速速、经济、产品活性高等优点。经济、产品活性高等优点。31XXXXXXXXXXXXXXXXXX蛋白质提纯蛋白质提纯先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相 基质上，制成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单基质上，制成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单抗时，相应的蛋白质与单抗特异
17、性结合，杂质则随洗脱剂抗时，相应的蛋白质与单抗特异性结合，杂质则随洗脱剂流走。再用特殊的洗脱剂将蛋白质洗脱下来，则可将蛋白流走。再用特殊的洗脱剂将蛋白质洗脱下来，则可将蛋白质提纯质提纯。在亲和层析中单克隆抗在亲和层析中单克隆抗体是主要的配体体是主要的配体32XXXXXXXXXXXXXXXXX作为生物治疗的导向武器作为生物治疗的导向武器以抗肿瘤为例：将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗以抗肿瘤为例：将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤物或放疗物质携
18、带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。常见抗肿瘤细胞毒剂常见抗肿瘤细胞毒剂：化疗药物、细菌毒素、：化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。植物毒素或放射性同位素等。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。剂对正常细胞的毒性反应。33XXXXXXXXXXXXXXXXX作为免疫抑制剂作为免疫抑制剂抗人抗人T T淋巴细胞单抗（淋巴细胞单抗（McAb
19、McAb）作为一种新型免疫抑制剂，）作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应，其作用机理有赖于反应，其作用机理有赖于McAbMcAb的种类及其免疫学特性。的种类及其免疫学特性。例子例子：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T T细胞细胞单抗加补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。单抗加补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。34XXXXXXXXXXXXXXXXX作为研究工作中的探针作为研究工作中的探针利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此利用单克隆抗体
20、的特性可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能关系，进而可以从理论上阐明其机理。质的结构与功能关系，进而可以从理论上阐明其机理。例子例子：用荧光物质标记单抗作为探针，能快速地确定与其：用荧光物质标记单抗作为探针，能快速地确定与其结合的相应生物大分子在细胞中的位置和分布结合的相应生物大分子在细胞中的位置和分布。35XXXXXXXXXXXXXXXXX3佐剂能刺激佐剂能刺激吞噬细胞对吞噬细胞对抗原的处理抗原的处理5可可刺刺激激致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞的的分分裂裂和和浆浆细细胞胞产生抗体产生抗体2增
21、增加加抗抗原原的的表表面面积积，使使抗抗原原易易于于被被巨巨噬噬细胞吞噬细胞吞噬7改改变变抗抗体体的的产产生生类类型型以以及及产产生生迟迟发发型型变变态态反反应应，并使其增强并使其增强4可可促促进进淋淋巴巴细细胞胞之之间间的的接接触触，增增强强辅辅助助T T细胞的作用细胞的作用6可可提提高高机机体体初初次次和和再再次次免疫应答免疫应答增强抗原的免疫原性增强抗原的免疫原性1改变抗原的物理性状，可改变抗原的物理性状，可使使抗抗原原物物质质缓缓慢慢地地释释放放，延长了抗原的作用时间延长了抗原的作用时间将单抗制成佐剂加在疫苗里，则可减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并将单抗制成佐剂加在疫苗里，则可
22、减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并不能引起机体更好地产生免疫应答，从而减少疫苗接种的风险不能引起机体更好地产生免疫应答，从而减少疫苗接种的风险。佐剂的佐剂的作用机理作用机理：36XXXXXXXXXXXXXXXXX细胞因子的测定激素测定肿瘤抗原的检测免疫细胞及其亚群的的检测病原微生物抗原、抗体的检测作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂37XXXXXXXXXXXXXXXXX农兽药快速检测农兽药
23、快速检测农兽药属于小分子物质，半抗原，无免疫原性，不农兽药属于小分子物质，半抗原，无免疫原性，不 能刺激动物产生抗体，必须先将其制备成人工抗原，能刺激动物产生抗体，必须先将其制备成人工抗原， 以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反 应，从而制备出对该农药具特异性的多或单克隆抗体应，从而制备出对该农药具特异性的多或单克隆抗体 国外已制备多种农兽药单克隆抗体并应用于农药和兽国外已制备多种农兽药单克隆抗体并应用于农药和兽 药残留的免疫分析。药残留的免疫分析。展望展望5 第五部分39XXXXXXXXXXXXXXXXXX展望展望单克隆抗体的这些特性使单克隆抗体的这些特性使得它成为治疗学上的热点得它成为治疗学上的热点最最突突出出的的问问题题是是如如何何降降低低单单抗抗的的免免疫疫原原性性，单单抗抗的的异异源源性性所所引引起起的的抗抗体体反反应应，不不但但降降低低了了单单抗抗的的效效价价，而而且且会会给给患患者者带带来来严严重重的的后果。后果。对对异异源源性性单单抗抗进进行行改改造造及及人人源源性性单单抗抗的的研研制制成成为为单单抗抗的的重要研究方向重要研究方向感谢大家请对不足之处提宝贵意见！
