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1、核磁共振波谱分析核磁共振波谱分析-在蛋白质领域在蛋白质领域中的应用中的应用LOGOLOGOLOGOLOGOLOGOContents核磁共振的基本原理核磁共振的基本原理核磁共振的基本原理核磁共振的基本原理1核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪2NMR在蛋白质领域中的应用在蛋白质领域中的应用3核磁共振的优势核磁共振的优势核磁共振的优势核磁共振的优势LOGO核磁共振的基本原理 核磁共振（简称核磁共振（简称NMR ）是基于原子核磁）是基于原子核磁性性的一种的一种波谱技术，是一种鉴定有机化合物结构和研究化学动波谱技术，是一种鉴定有机化合物结构和研究化学动力学等的现代仪器分析方法。它的最基本原理是，原力学等的现代
2、仪器分析方法。它的最基本原理是，原子核在磁场中受到磁化子核在磁场中受到磁化，自旋角动量发生进动自旋角动量发生进动，当外当外加能量（射频场）与原子核震动频率相加能量（射频场）与原子核震动频率相同同时原子核吸时原子核吸收能量发生能级跃迁，产生共振吸收信号收能量发生能级跃迁，产生共振吸收信号 。LOGO核磁共振现象的发现 Felix Bloch Edward Mills Purcell Bloch 等于等于 1946 年年 发现：特定结构中的发现：特定结构中的磁核会吸收一定波长磁核会吸收一定波长或频率的电磁波而实或频率的电磁波而实现能级跃迁，开辟了现能级跃迁，开辟了核磁共振分析的历史，核磁共振分析的
3、历史，因而获因而获1952年诺贝尔年诺贝尔物理学奖。物理学奖。 一些原子核（如一些原子核（如1H, 13C, 19F等）在强磁场中会等）在强磁场中会产生能量分裂，形成能级。当用一定频率的电磁产生能量分裂，形成能级。当用一定频率的电磁波对样品进行辐照时，特定结构环境中的原子核波对样品进行辐照时，特定结构环境中的原子核会吸收相应频率的电磁波而实现共振跃迁。会吸收相应频率的电磁波而实现共振跃迁。频率频率频率频率LOGO核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪1永久磁铁：提供外磁场，永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。扫场线圈
4、。2 射频振荡器：线圈垂直射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。的电磁辐射信号。60MHz或或100MHz。LOGO3 射频信号接受器（检测射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。线圈中产生毫伏级信号。4样品管：外径样品管：外径5mm的玻的玻璃管璃管,测量过程中旋转测量过程中旋转, 磁场磁场作用均匀作用均匀LOGO核磁共振波谱仪 核磁分析的一般步骤核磁分析的一般步骤 1. 1. 核磁管的准备核磁管的准备 选择
5、合适规格的核磁管，确保清洗干净、烘干。选择合适规格的核磁管，确保清洗干净、烘干。选择合适规格的核磁管，确保清洗干净、烘干。选择合适规格的核磁管，确保清洗干净、烘干。 2. 2. 样品溶液的配制样品溶液的配制 选择合适的溶剂，控制好样品溶液浓度。选择合适的溶剂，控制好样品溶液浓度。选择合适的溶剂，控制好样品溶液浓度。选择合适的溶剂，控制好样品溶液浓度。 3. 3. 测试前匀场处理测试前匀场处理 将核磁管装入仪器，使之旋转，进行匀场。将核磁管装入仪器，使之旋转，进行匀场。将核磁管装入仪器，使之旋转，进行匀场。将核磁管装入仪器，使之旋转，进行匀场。 4. 4. 样品扫描样品扫描样品扫描样品扫描 按样
6、品分子量大小，选择合适的扫描次数。按样品分子量大小，选择合适的扫描次数。按样品分子量大小，选择合适的扫描次数。按样品分子量大小，选择合适的扫描次数。 5. 5.结果分析结果分析 保存数据，采用专用软件进行图谱分析。保存数据，采用专用软件进行图谱分析。保存数据，采用专用软件进行图谱分析。保存数据，采用专用软件进行图谱分析。 52 样品管样品管 图图图图16 16 核磁样品管及清洗器核磁样品管及清洗器核磁样品管及清洗器核磁样品管及清洗器 根据样品及仪器实际情况，可根据样品及仪器实际情况，可选择不同规格的样品管。测试选择不同规格的样品管。测试前应确保样品洗涤干净，同时前应确保样品洗涤干净，同时避免烘
7、干过程导致其变形。避免烘干过程导致其变形。 45 测试溶剂测试溶剂 氘代试剂氘代试剂1 1H H 化学位移（化学位移（ppmppm） 1313C C 化学位移（化学位移（ppmppm）氘代氯仿7.2777氘代二氯甲烷 5.33 53.6 六氘代丙酮2.05206.0、29.8重水4.7-八氘代二噁烷 3.5567.4六氘代二甲基亚砜 2.539.5五氘代吡啶 6.98、7.35、8.50149.9、135.5、123.5 1 1H H谱的理想溶剂是四氯化碳或二硫化碳。此外，常用的其他谱的理想溶剂是四氯化碳或二硫化碳。此外，常用的其他溶剂有氯仿、丙酮、二甲基亚砜、苯以及氘代试剂等。溶剂有氯仿、丙
8、酮、二甲基亚砜、苯以及氘代试剂等。 46 测试溶剂测试溶剂 1 1H H谱的理想溶剂是四氯化碳或二硫化碳。此外，常用的其他谱的理想溶剂是四氯化碳或二硫化碳。此外，常用的其他溶剂有氯仿、丙酮、二甲基亚砜、苯以及氘代试剂等。溶剂有氯仿、丙酮、二甲基亚砜、苯以及氘代试剂等。 常用试剂常用试剂1 1H H 化学位移（化学位移（ppmppm） 1313C C 化学位移（化学位移（ppmppm）四氯化碳 -96.0二硫化碳 - 192.3 四氢呋喃 1.9、3.8 25.8、67.9 二氧六环 3.7 67.4 环己烷 1.43 27.5 DMF 2.9、3.0、8.9 31、36、162.4 氘代丙酮
9、2.17 29.2、204.1 47 样品溶液的配置样品溶液的配置 样品溶液配制过程应考虑以下四方面：样品溶液配制过程应考虑以下四方面： 溶解性 所选溶剂应确所选溶剂应确保能均匀溶解保能均匀溶解测试样品。测试样品。 溶剂峰位置 应避免溶剂峰应避免溶剂峰位置与样品峰位置与样品峰重叠出现。重叠出现。 溶液浓度 浓度一般为浓度一般为 5-10 % ，需纯样，需纯样品品15-30 mg。 测试温度 结合测试温度结合测试温度需要选择合适需要选择合适沸点或凝固点沸点或凝固点的溶剂。的溶剂。 51 NMR在蛋白质领域中的应用在蛋白质领域中的应用NMR法通过测定蛋白质稀溶液状态下反映法通过测定蛋白质稀溶液状态
10、下反映位点的特定参数来计算蛋白质的三级结构，位点的特定参数来计算蛋白质的三级结构，并可深入了解一定时间范围内化学反应和并可深入了解一定时间范围内化学反应和蛋白质构想转变的动力学过程。通过蛋白质构想转变的动力学过程。通过NMR对抗原决定簇和抗体对抗原决定簇和抗体CDR作用，可以分析作用，可以分析一级结构和三维构想；对抗原抗体动力学一级结构和三维构想；对抗原抗体动力学的分析，对于设计基因疫苗，检测细胞表的分析，对于设计基因疫苗，检测细胞表面抗原提呈以及分析抗原复合物的构想变面抗原提呈以及分析抗原复合物的构想变化有着重要意义。化有着重要意义。 这些参数有：弛豫时间，化学位移，自旋这些参数有：弛豫时间
11、，化学位移，自旋耦合，耦合，NOE效应，磁化量转移，自旋标记效应，磁化量转移，自旋标记等。等。NMR法通过测定大分子的弛豫时间，即纵法通过测定大分子的弛豫时间，即纵向时间向时间T1，横向时间，横向时间T2和异核的和异核的NOE效应，效应，研究一定时间范围内的化学反应和构想转研究一定时间范围内的化学反应和构想转变的动力学过程，变的动力学过程，NMR谱峰的宽度或裂分谱峰的宽度或裂分程度反映自旋核的快交换和慢交换过程。程度反映自旋核的快交换和慢交换过程。磁化量转移对于蛋白质折叠和构象变化有磁化量转移对于蛋白质折叠和构象变化有较大帮助，同时可以对化学位移交换反应较大帮助，同时可以对化学位移交换反应动力学和肽链二级结构进行研究。动力学和肽链二级结构进行研究。LOGO核磁共振的优势核磁共振的优势1核磁共振法能够保持样品的完整性，是一种核磁共振法能够保持样品的完整性，是一种非破坏性的检测手段；非破坏性的检测手段；2操作方法简单快速，测量精确，重复性高操作方法简单快速，测量精确，重复性高；3样品无需添加溶剂，定量测定无需标样；测样品无需添加溶剂，定量测定无需标样；测量结果受材料样本大小与外观色泽的影响量结果受材料样本大小与外观色泽的影响较小，且不受操作员的技术和判断所影响较小，且不受操作员的技术和判断所影响。LOGO
