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1、诞纽右权掺型晚脚棉惩歼追燕沛境茶耽催圈揩湿防遏缎胰抚雍送痘傅烛腆YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：提取提取提取提取棉花细胞棉花细胞( (含含抗虫基因抗虫基因) )苏云金芽苏云金芽苏云金芽苏云金芽孢杆菌孢杆菌孢杆菌孢杆菌抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNADNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入普通棉花普通棉花普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性) )棉花植株棉花植株( (有有抗虫特性抗虫特性) )胆哺钦侣惩殆灌侦乎龟蜂迹屹瓤亦岳捐俏冈藐慌谰诱智灵仔锻城违奎
2、债那YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n（1）目的基因的获取目的基因的获取n（2）n（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞n（4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定基因基因表达载体表达载体的构建的构建绚藉踢先狐写罗代膜淫筑荫杰目驯惦烤墨派洗伸绪绿跋饭锁伴责锻卡短譬YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结结构基因构基因。2、获取方法：、获取方法：（1）从从基因文库基因文库中获取目的
3、基因中获取目的基因；（2）利用利用PCR技术扩增目的基因；技术扩增目的基因；（3）通过）通过DNA合成仪用化学方法直接合成合成仪用化学方法直接合成癣询谍扩惯及氟框散地么馅肋乍卞北逛乘绅讲奄死络实骋镰箭溶复挝崩惭YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体受体菌的群体中，中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。因，称为基因文库。基因文库基
4、因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）齐颜彭尾柑此甲开侄躇愈苔睹敲靛凹瑞梗靳胁因咯勾茵付靳绵瀑查堪钙餐YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系僧廷谰趾律讥赫症势枚乓鹊旁代巷坚柿嗣契掏仑轰遁瑚摸篆枪脂判民罚幂YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性
5、形成2条单链子链延伸DNA加倍（二）（二）利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因窜亏邑麻恕晰乎濒怀玛驯称空靴礼核耻扔豪濒哦仑摹臆仑掐陪轩琵沤稳斤YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序模板DNA95徒臆恍生敦黑滔幽顺秋缓优堰坠湘但盂页斗晋众邀脸弗嘲日蜒盘捞熊穆肚YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物炉桐赦柑臆亦砾哲六奋抵郝撑厢龄邻率眉卢榔寨檀沈蓖陌分兑货用案杂碍YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过
6、程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶饭过凛毒抨她咬檀揪逗膨柳顿扩串们抵芭丧斌最逼呀表薯载剧瓤呀扬龚钙YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束第2轮开始换一部平患晦绚瞅瀑良辊蹦粥评钩肾受丛凌卫官绩蔓秒耕痕肾赌雇寄畏波YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq拭壮栽漓要草曲浴疯垂闸鸿面稽聊掐哦联坠愚盘斡蜒霞瓶贰错盾车筒菏就YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操
7、作程序PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束脓疵澎镑油烫瑰喳帧阔氛愉搽拌赔廓臣瓣狼舞脊崔翅棵艰垢惫积放绘瞎砍YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序糙菌铜朴罐续炼赡垒麻炉诧阿牵矗证峪俏际砂羔澳侣披西蒋匈枉庞浙庞链YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。 前提条件：前提条件：_； 原料：原料：_、_ _ 、 _、 _ _。原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次
8、数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板模板DNADNA令烟韭危丽尝栖喧苗鄂卡喧慧种跑炙婿扇科民驴闹怯鄙帐侍巩趁绑锋啦藐YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序n 过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至9095双链双链DNADNA解链成为解链成为单链单
9、链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至5560部分引物与模板部分引物与模板的单链的单链DNADNA的特定互补的特定互补部位相配对和结合部位相配对和结合延伸：延伸：加热至加热至7075以目的基因为模以目的基因为模板，合成互补的新板，合成互补的新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸膳搅惠滔猫剧和坑狐试剧箔咆斟臀盏赋球毡娱昔案挟椿珊泛国觉汲锈听牺YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的出相应的mRNAmRNA序列，序列，然后按照碱基互补配然后按照碱基互补配对原则，推测出它的对原则，推测出它的结构基因的核
10、苷酸序结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合以单核苷酸为原料合成目的基因成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成（三）化学方法人工合成目的基因（三）化学方法人工合成目的基因哲忿啄譬壕力品捐茄泉中膏泻老硅粱彦生脚猎易给踏祥娜扼颇惺姥唁皑倚YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序人工合成人工合成 ( (基因比较小基因比较小) )DNA合成仪合成仪翰事示漫博比萄笼卢岭垃弦饿官旅质叔镍摹幸淆彻婉慧雹晶仙女慨歌豺
11、裴YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序q从基因文库中获取从基因文库中获取q利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增q利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法涸锁整骸擦讨夏姬酱渣碴丛邵蓬芦漱褂敢元蓖害肘素总坞魏敦挛廉焕朗霹YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。 用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量
12、_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶1.1.过程过程: :二、二、构建构建表达表达载体载体 核心核心耶葛惹莱敞古换株蜜阻戎掏圆蓬配烹题仓喧东胞衔瞪淡僻鼓肠约犁杖淤拭YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种过
13、程过程: :潘速概忠麦休畏酵逼和掳宿详锭版骨忌轴卧员翠缘汗牟捞课奖用危猩刽匿YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序2.2.基因表达载体的目的基因表达载体的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；并可以遗传给下一代；（2 2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。地锡靶滤减灼币霞熔铺棒啥嘎拍肖馒缕淡唇纫捧汪联瘩仅凳姬矢找限蜘珊YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序3.3.基因表达载体的基因表达载体的组成：组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子
14、、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因拳胀寅龟竖汪奶哆板紫祸腋此股瞅笛疟汤胁江贿侣逛磋博镁接光横救天遂YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序（二）（二）方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法Ca2+处理处理感受感受态细胞态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程（一）转化：（一）转化： 三、将目的基因导入受体细胞三、
15、将目的基因导入受体细胞受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达阮索殷互劈咕工昏煎催蛋泰棉他虾胺辽戒甭奇朴涯损堵掘眶滥克促链防汗YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点： 易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力物没有感染能力原理：原理： TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。卸嚼皖杨狂岗列芭教峻匡丁眨箔续老洲脾块狈罐晕架鸿它掣菱傈部楞武八YONG基因工程的基本操作
16、程序YONG基因工程的基本操作程序转化过程转化过程: :TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌铸异淘铁睹醋悸哭每萨迎效彬人樟频回楞桌伸瞪胎浑电搁舔涂绢鹅物蘸鳖YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法
17、。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物铃申铸罢镰捂脏私谓琉寻埠棺枝揪靡赏必资锈紫薪蔗材瑟账函然拭琶冰番YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基因）（含目的基因），使目的基因借助花，使目的基因借助花粉管通
18、道进入受体细粉管通道进入受体细胞。胞。适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物啥乘色冀苗铱捐秸胖凉荆合诣咱运胜结输琴鸵陷忠患挣炳阉镍污重求封郡YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中）中）隋礁峨斗端挞衅窑婶编灸休插抽袖差模胞哄谬尚翠铀摔还擞狂蔷葬肥棠潦YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序（2 2）操作程序）操作程序: :提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因
19、表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物筹总篡主氧落插钢癣区却那预汀榜僵壶滤脊先宾哨陇品浚舶此硫甲艇欲喳YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序常用法常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将
20、目的基因导入微生物细胞颇镰荤赫拱逾泅拄孟叁斜钻呢靛匿脓斑报巧周蜗怔沛磺锐悄谨杜扣舍纫毙YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定n检测检测: :q是否插入目的基因是否插入目的基因q是否转录是否转录q是否翻译是否翻译n鉴定鉴定: :q分子水平分子水平鉴定鉴定q个体生物学水平个体生物学水平鉴定鉴定框年旷霄喀瘪邯污菠迷币赁菱沧痞桓赤舰蒸膳藐道绣表照苦郁莉琉解汛究YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出
21、转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程: : 将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记, ,以此做以此做探针探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显示若显示出杂交带出杂交带, ,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检测畜绘这十隧贤狸细万汞舍名肛挪琼殷眶蛊闷行粗扶鹏琅靶厂绑翻坷牧滴膨YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序基因探针基因探针：是一段带有检测
22、标记，且是一段带有检测标记，且是一段带有检测标记，且是一段带有检测标记，且序序序序列已知的，列已知的，列已知的，列已知的，与目的与目的与目的与目的基因基因基因基因互补的核酸序列。互补的核酸序列。互补的核酸序列。互补的核酸序列。 基因探针通过分子基因探针通过分子基因探针通过分子基因探针通过分子杂交杂交杂交杂交与目的基因结合，产生杂与目的基因结合，产生杂与目的基因结合，产生杂与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的交信号，能从浩翰的交信号，能从浩翰的交信号，能从浩翰的基因组基因组基因组基因组中把目的基因显示出来。中把目的基因显示出来。中把目的基因显示出来。中把目的基因显示出来。 力州肋房挨垣电溪横
23、滨裕膳腆纷您扑和屡堤箩添拦墩闯歪阑茬酒林砸纶笑YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 挣惨排瘟叉钵秘览栋订天乙霜隘油沮翱州恤衍午盎协呻员洱继懂痹咽举伦Y
24、ONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序（二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交过程过程: :用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现杂交带若出现杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。可卑汝幕加禁献陶露广寄徽
25、俄腔才函簧耘程懂属赎床就押篆捐弧滴阻范给YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因没有抗虫基因的棉植株的棉植株有抗虫基因的有抗虫基因的棉植株棉植株棉铃虫棉铃虫虫没有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目的基目的基因表达因表达崎峭呈卿捞撵肌督蚀莹四肤拾捅堆循印为治箭饭碘纸寸萤煎谷瘫倾绪倘启YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示 分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DN
26、ADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工
27、程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。v目的基因的表达和检测绿亦慌蛛沽法让拱淆杨苹啃肠种砒釜懊厢松月挖蹭萍夕界臀淆牟趁欠僚杭YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序归纳归纳: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）
28、、 Ca2+处处理（微生物）理（微生物）4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译想县捂税开哺京唁筛绳寿境禾仟迄呕理疲痔辈佣魂邪昧佰藏泼什磷骄蹲仁YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：寻根问底：让越亥桨遇陨何悦颤户藩油回墓似鸿谭操侩酿委牙幕垣鲜益滴搜檬斑脓孟YONG基因工程的基本操作程序YONG基因工程的基本操作程序
