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1、第六章第六章 蛋白质翻译后修饰的鉴定蛋白质翻译后修饰的鉴定1高等课件蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰n蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一完善，调节更为精细，作用更为专一nN-N-端端fMetfMet或或MetMet的切除的切除n二硫键的形成二硫键的形成n化学修饰化学修饰n剪切剪切2高等课件n泛素化对于细胞分化与凋亡、泛素化对于细胞分化与凋亡、DNADNA修复、免疫修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用应答和应激反应等生理过程起着重
2、要作用n磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程程n糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用用n脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用关键的作用n组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关3高等课件第一节第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定蛋白质翻译后修饰的鉴定一、生物体内的
3、蛋白质磷酸化修饰及其功能一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能n蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程从一个化合物转移到另一个化合物上的过程, ,是生是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位传递过程中占有极其重要的地位n蛋白质激酶催化的把蛋白质激酶催化的把ATPATP或或GTPGTP上上位的磷酸基转移位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程到底物蛋白质氨基酸残基上的过程4高等课件5高等课件n蛋白质磷酸化在蛋白质磷酸化在细胞信
4、号转导细胞信号转导中的作用中的作用 n在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点n胞内信使，胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）（二酰甘油）n蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶酶“活性活性”n对外界信号具有级联放大作用对外界信号具有级联放大作用 n蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应号的持续反应 6高等课件n磷酸化类型磷酸化类型n丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化n精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸精氨酸、
5、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸和谷氨酸的酰化和谷氨酸的酰化n丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化=1800：200：17高等课件n被磷酸化修饰的蛋白被磷酸化修饰的蛋白n改变所带的电荷改变所带的电荷n改变催化基团的性质改变催化基团的性质n改变蛋白质的构象改变蛋白质的构象n改变蛋白质的亚细胞分步改变蛋白质的亚细胞分步n蛋白质功能变化的多样性蛋白质功能变化的多样性8高等课件n蛋白质磷酸化研究有三个主要目的蛋白质磷酸化研究有三个主要目的n(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白质在体内的磷酸化氨基酸残基定位质在体内的
6、磷酸化氨基酸残基定位n(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶鉴定与磷酸化过程有关的激酶n(3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响9高等课件二、磷酸化蛋白质分析的概述二、磷酸化蛋白质分析的概述n磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术之一质组学研究的关键技术之一n细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化, ,即使蛋白质的即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平表达量处于相对较高的水平, ,该蛋白质的磷酸化部该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难分的分析也很困难, , 一般一个发生磷酸化
7、的蛋白质一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量的其磷酸化的部分仅占其总量的10%10% n磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中10高等课件二、磷酸化蛋白质分析的概述二、磷酸化蛋白质分析的概述体外体外 pmol体内体内 fmol32p蛋白标记蛋白标记32p细胞标记细胞标记蛋白质分离蛋白质分离蛋白酶切蛋白酶切蛋白酶切蛋白酶切2DPP作图作图2DPP作图作图LCESI-MS或或MALDI-MSLCESI-MSHPLCIMAC磷酸氨基酸磷酸氨基酸分析分析相关分析相关分析1
8、1高等课件二、磷酸化蛋白质分析的概述二、磷酸化蛋白质分析的概述n双相磷酸多肽谱图双相磷酸多肽谱图 2D2DPPPPn多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一块板上进行薄层色谱块板上进行薄层色谱(TCL)(TCL)为第二相，分离得到的为第二相，分离得到的磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测n此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷酸化状态的重要信息酸化状态的重要信息 n(1)(1)磷酸化位点的最大数目磷酸化位点的最大数目n(2)(2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸放射自显影强
9、度提供了在所有磷酸化肽中磷酸化的相对化学计量化的相对化学计量n(3)(3)电泳和电泳和TCLTCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性的相对状态的相对状态12高等课件二、磷酸化蛋白质分析的概述二、磷酸化蛋白质分析的概述n磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式的质谱分析中信号受到抑制，在的质谱分析中信号受到抑制，在MALDIMALDI源的质源的质谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化肽段的信号强度要低很多肽段的信号强度要低很多n磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷磷酰键较肽键容易断
10、裂，使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白鉴定要困难的多酸化蛋白鉴定要困难的多13高等课件三、磷酸化蛋白质的检测三、磷酸化蛋白质的检测n3232P P放射性标记法放射性标记法n抗体免疫印迹检测法抗体免疫印迹检测法14高等课件1 1、3232P P放射性标记法放射性标记法n3232 P P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法方法n放射性放射性3232P P标记的标记的ATPATP处理细胞，使处理细胞，使3232P P掺入磷酸化掺入磷酸化蛋白质蛋白质n培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的细胞中磷酸盐的转运达到最高
11、峰，用不含磷酸盐的细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入3232P P标标记磷酸盐共培养，使细胞记磷酸盐共培养，使细胞ATPATP库与库与3232P P平衡，蛋白激平衡，蛋白激酶利用被放射标记的酶利用被放射标记的ATPATP使底物磷酸化使底物磷酸化15高等课件n局限性局限性n磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质n不能标记组织样本不能标记组织样本n放射性污染放射性污染16高等课件2 2、抗体免疫印迹检测法、抗体免疫印迹检测法n通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反通过抗磷酸氨基酸抗体
12、与磷酸化蛋白质的免疫印迹反应应(Western blotting)(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用来检出磷酸化蛋白质是较常用的方法的方法n在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化n已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体体, ,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小, ,抗原抗体结合位
13、点有抗原抗体结合位点有空间障碍空间障碍, ,所以抗体的结合力较差所以抗体的结合力较差n免疫印迹法与免疫沉淀相结合免疫印迹法与免疫沉淀相结合, ,可以在电泳之前先富集可以在电泳之前先富集目的蛋白质目的蛋白质, ,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋白质白质, ,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高, ,抗磷酸酪抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验17高等课件样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）制备型制备型2D2D胶电泳胶电泳分析型分析
14、型2D2D胶电泳胶电泳考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色转印到膜转印到膜找出相应的磷酸化蛋白质找出相应的磷酸化蛋白质磷酸氨基酸抗体免疫检测磷酸氨基酸抗体免疫检测得到磷酸化蛋白质得到磷酸化蛋白质染色染色得到全部蛋白质点得到全部蛋白质点磷酸化蛋白质鉴定磷酸化蛋白质鉴定图谱比较图谱比较18高等课件四、蛋白质磷酸化位点的分析四、蛋白质磷酸化位点的分析1 1、磷酸肽的分离和富集、磷酸肽的分离和富集n分离浓缩分析物，提高信噪比分离浓缩分析物，提高信噪比n如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组么每一个被分离的肽段相
15、应的活度计数就表明这一组分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量n放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化n肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测和分析低丰度磷酸肽和分析低丰度磷酸肽19高等课件1 1、磷酸肽的分离和富集、磷酸肽的分离和富集n方法方法n反相液相色谱（反相液相色谱（PR-HPLCPR-H
16、PLC）n免疫沉淀免疫沉淀n固相金属亲和色谱固相金属亲和色谱n金属氧化物金属氧化物/ /氢氧化物亲和色谱氢氧化物亲和色谱n离子交换和等电聚焦离子交换和等电聚焦20高等课件免疫沉淀免疫沉淀21高等课件原理原理n当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来被保留了下来n如果用蛋白质如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀X，那么与，那么与X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来也能沉淀下来免疫沉淀物免疫沉淀物22高等课件n固相金属亲和色谱固相金属亲和色谱nImmobil
17、ized metal affinity Immobilized metal affinity chromatography, chromatography, IMACIMACnIMACIMAC柱：金属离子、螯合剂、填料柱：金属离子、螯合剂、填料n原理原理：带正电的金属离子，如：带正电的金属离子，如FeFe3+3+、CaCa3+3+、CuCu2+2+可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而结合，这种结合能力受结合，这种结合能力受pHpH值、离子强度和溶液值、离子强度和溶液有机相的影响，在高有机相的影响，在高pHpH或磷酸盐存在的缓冲液或磷酸盐存在的缓冲液中
18、，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷酸肽被释放出来酸肽被释放出来23高等课件n局限性局限性n丢失低丰度、没有结合到丢失低丰度、没有结合到IMACIMAC柱上的磷酸化肽段柱上的磷酸化肽段n具有多磷酸化位点的肽由于较强的亲和力较难被具有多磷酸化位点的肽由于较强的亲和力较难被洗脱下来洗脱下来n酸性基团（天冬氨酸、谷氨酸）、电子供体（组酸性基团（天冬氨酸、谷氨酸）、电子供体（组氨酸）也会结合到柱上，造成非磷酸化肽的污染氨酸）也会结合到柱上，造成非磷酸化肽的污染n效果：效果：依赖于所选择的金属离子、填充柱的材料依赖于所选择的金属离子、填充柱的材料及洗脱程序及洗脱
19、程序24高等课件n金属氧化物金属氧化物/ /氢氧化物亲和色谱氢氧化物亲和色谱nMetal oxide/hydroxide affinity Metal oxide/hydroxide affinity chromatography, chromatography, MOACMOACnTiOTiO2 2、Al(OH)Al(OH)3 3、ZrOZrO2 2nTiOTiO2 2富集磷酸肽原理：富集磷酸肽原理： nTiOTiO2 2是一种两性物质，由于钛原子和氧原子的原子是一种两性物质，由于钛原子和氧原子的原子表面化合价不饱和，表面化合价不饱和，TiOTiO2 2在不同的在不同的pHpH值下可以表现值
20、下可以表现为路易斯酸或路易斯碱为路易斯酸或路易斯碱n在酸性溶液中，钛原子带正电表现为路易斯酸，在酸性溶液中，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合。磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐都可以与阴离子结合。磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐都与与TiOTiO2 2具有高度的亲和力，其中具有高度的亲和力，其中TiOTiO2 2与磷酸盐的结与磷酸盐的结合能力最高合能力最高n调节调节pHpH值后，值后，TiOTiO2 2可用于富集磷酸肽可用于富集磷酸肽25高等课件n离子交换和等电聚焦离子交换和等电聚焦n离子交换（离子交换（strong aion exchange,SAX/ strong aion exchange,SAX
21、/ strong caion exchange,SCX strong caion exchange,SCX ）: :离子强度离子强度不同进行分离不同进行分离nIEF:IEF:等电点不同进行分离等电点不同进行分离n主要用于复杂样本的预分离，降低样本复杂主要用于复杂样本的预分离，降低样本复杂程度程度n结合金属亲和等其他富集技术，可取得很好结合金属亲和等其他富集技术，可取得很好的效果的效果26高等课件2 2、磷酸肽的识别、磷酸肽的识别n质谱技术质谱技术n质谱技术结合磷酸酶水解质谱技术结合磷酸酶水解27高等课件nMALDI-TOF MS n可以通过肽指纹谱可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸鉴
22、定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点n原理：原理：n磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点化位点28高等课件原理原理n通过通过MALDI-TOF/TOFMALDI-TOF/TOF一级质谱可发现与肽段分子量理一级质谱可发现与肽段分子量理论值相差论值相差80Da80Da(HPO3=80Da)(HPO3=80Da)的质谱峰的质谱峰, ,该峰的二级质该峰的二级质谱图中如果母离子
23、与旁边的最高强度的质谱峰相差谱图中如果母离子与旁边的最高强度的质谱峰相差98Da(98Da(中性丢失中性丢失H H3 3POPO4 4=98Da),=98Da),则可确定该肽段为磷酸则可确定该肽段为磷酸化肽段化肽段, ,进一步通过二级或多级质谱的谱图确认具进一步通过二级或多级质谱的谱图确认具体的磷酸化位点体的磷酸化位点n利用利用消除反应消除反应使丝氨酸、苏氨酸磷酸化残基转使丝氨酸、苏氨酸磷酸化残基转化为氨乙基丙氨酸化为氨乙基丙氨酸, ,后者为赖氨酸的同形物后者为赖氨酸的同形物, ,此位点此位点可被胰蛋白酶和可被胰蛋白酶和Lys-CLys-C肽链内切酶等酶特异性识别、肽链内切酶等酶特异性识别、酶
24、切酶切, ,通过质谱即可很容易地判断磷酸化位点。通过质谱即可很容易地判断磷酸化位点。消除反应是从反应物的相邻碳原子上消除反应是从反应物的相邻碳原子上消除两个原子或基团，形成一个消除两个原子或基团，形成一个键的键的过程过程 1,2 消除反应（消除反应（-消除反应）消除反应）29高等课件PSD-MALDI-MS分析分析n源后衰变源后衰变n发生在源内离子化之后的分子裂解发生在源内离子化之后的分子裂解nMALDI-TOF-MS离子源内发生的离子在真离子源内发生的离子在真空空无电场飞行管无电场飞行管飞行过程中发生结构裂解，飞行过程中发生结构裂解，丢失一个中性分子后产生了碎片离子丢失一个中性分子后产生了碎
25、片离子n碎片离子具有与其前体离子相同的飞行速度，但碎片离子具有与其前体离子相同的飞行速度，但由于质量小，动能比前体离子小（亚稳离子）由于质量小，动能比前体离子小（亚稳离子）n消除反应丢失消除反应丢失HPO3或或H3PO4，产生数减少，产生数减少80Da或或98Da亚稳离子亚稳离子 30高等课件n图图 利用利用MALDI-TOF/TOF谱图鉴定磷酸化肽段谱图鉴定磷酸化肽段na: 酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星号标出号标出, 其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移80 Da (HPO3 = 80 Da); b:
26、 a中标记星号的质谱峰的二级质中标记星号的质谱峰的二级质谱分析。在图中可见比母离子小谱分析。在图中可见比母离子小98 Da (H3PO4 = 98 Da)的中性缺失峰的中性缺失峰31高等课件n串联质谱串联质谱(MS/MS) (MS/MS) n前体离子扫描前体离子扫描n通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在；磷酸化肽经酸肽的存在；磷酸化肽经CIDCID（碰撞诱导解（碰撞诱导解离）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些离）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的描时可
27、作为磷酸肽的“报告离子报告离子”32高等课件前体离子扫描前体离子扫描n在三级四级串联质谱采用在三级四级串联质谱采用n使各种质荷比的离子依次通过使各种质荷比的离子依次通过Q1Q1分析器，分析器，Q2Q2为碰撞诱导解离室，将为碰撞诱导解离室，将Q3Q3分析器的电压和频分析器的电压和频率设定为只能传输某一特定质荷比，即特定率设定为只能传输某一特定质荷比，即特定质荷比的子离子质荷比的子离子n直接检测在碰撞诱导解离过程中丢失的碎片直接检测在碰撞诱导解离过程中丢失的碎片离子离子33高等课件前体离子扫描前体离子扫描n分析磷酸肽分析磷酸肽n负离子模式负离子模式n设定设定Q3中仅能通过的子离子质荷比中仅能通过的
28、子离子质荷比m/z 79，即磷酸肽丢失的，即磷酸肽丢失的PO3-，这样得到的质谱图，这样得到的质谱图仅显示丢失仅显示丢失m/z 79的离子的谱峰的离子的谱峰 丢失磷酸根离子的磷酸肽谱峰丢失磷酸根离子的磷酸肽谱峰n多肽产生的各种碎片离子中，质量数在多肽产生的各种碎片离子中，质量数在79Da附近的几乎没有附近的几乎没有34高等课件中性丢失扫描中性丢失扫描n具有两级质量分析器和碰撞诱导解离室的串联质谱仪具有两级质量分析器和碰撞诱导解离室的串联质谱仪nQ1Q1和和Q2Q2同步扫描，但扫描范围不一样，保持一个特定同步扫描，但扫描范围不一样，保持一个特定的电压差值，这个电压差所代表的质荷比的电压差值，这个
29、电压差所代表的质荷比m/zm/z值代表一值代表一个中性分子的质量个中性分子的质量n将将Q1Q1输送来的离子碰撞诱导裂解，再将碎片离子送入输送来的离子碰撞诱导裂解，再将碎片离子送入Q3Q3n只有在只有在Q2Q2中诱导裂解后能丢失这一特定中性分子的离中诱导裂解后能丢失这一特定中性分子的离子才会被子才会被Q3Q3传输到检测器传输到检测器35高等课件中性丢失扫描中性丢失扫描n分析磷酸肽分析磷酸肽n从带一个正电荷的从带一个正电荷的M+HM+H+ +肽混合物中寻找丢失中性肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则的磷酸肽，则Q1Q1和和Q3Q3的扫描电压差的扫描电压差所代表的质荷比应为所
30、代表的质荷比应为m/z 98m/z 98n从带两个正电荷的从带两个正电荷的M+2HM+2H2+2+肽混合物中寻找丢失中肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则的磷酸肽，则Q1Q1和和Q3Q3的扫描电压的扫描电压差所代表的质荷比应为差所代表的质荷比应为m/z 49m/z 49n只能分析磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸只能分析磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸36高等课件3 3、磷酸化氨基酸位点的确定、磷酸化氨基酸位点的确定n用于确定磷酸化肽中磷酸化位点的质谱方法基用于确定磷酸化肽中磷酸化位点的质谱方法基于两种不同原理于两种不同原理n第一种方法取决于磷酸酯键的化学稳定性第一种方法取决于磷酸
31、酯键的化学稳定性n如在如在ESIESI质谱仪的碰撞室或离子源中，或在质谱仪的碰撞室或离子源中，或在MALDIMALDIMSMS的源后裂解（的源后裂解（PSDPSD）过程中磷酸化肽）过程中磷酸化肽可通过磷酸酯键断裂产生的碎片离子鉴定可通过磷酸酯键断裂产生的碎片离子鉴定37高等课件n第二种方法基于肽段增加的磷酸酯基团的质量第二种方法基于肽段增加的磷酸酯基团的质量数数n如果蛋白是已知的，可通过质量数来确定肽段如果蛋白是已知的，可通过质量数来确定肽段n在某些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨在某些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则很容易找到磷酸化位点，酸或酪氨酸残基，则很容易找到磷酸
32、化位点，但在大多数情况下肽段含有许多个丝氨酸、苏但在大多数情况下肽段含有许多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则确定磷酸化位点发生困氨酸或酪氨酸残基，则确定磷酸化位点发生困难难38高等课件五、蛋白质磷酸化的定量分析五、蛋白质磷酸化的定量分析n定量：磷酸化蛋白与其对应的非磷酸化蛋白质的定量：磷酸化蛋白与其对应的非磷酸化蛋白质的比例比例n研究的蛋白样本酶切后等分成两部分研究的蛋白样本酶切后等分成两部分, , 一部分直一部分直接用接用CHCH3 3OHOH甲酯化甲酯化, , 另一部分经过磷酸酯酶处理后另一部分经过磷酸酯酶处理后用用CDCD3 3OHOH甲酯化甲酯化, , 随后将两者混合进行串联质谱研随后
33、将两者混合进行串联质谱研究究, , 即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信息息n该技术设计巧妙该技术设计巧妙, , 但甲酯化的效率可能会影响定但甲酯化的效率可能会影响定量结果量结果39高等课件n一种基于稳定同位素标记的分析技术一种基于稳定同位素标记的分析技术SILAC(stable isotope labeling with amino SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)acids in cell culture)n采用含有轻同位素型和重同位素型氨基酸的培养采用含有
34、轻同位素型和重同位素型氨基酸的培养液对不同细胞分别进行培养液对不同细胞分别进行培养, , 使细胞内的蛋白被使细胞内的蛋白被同位素稳定标记同位素稳定标记, , 提取细胞蛋白并将其等量混合提取细胞蛋白并将其等量混合, , 酶切后进行质谱鉴定酶切后进行质谱鉴定, , 通过分析不同标记型肽段通过分析不同标记型肽段的相对量而确定蛋白的相对量的相对量而确定蛋白的相对量n1515N N稳定同位素标记法、磷酸肽同位素亲和标记法稳定同位素标记法、磷酸肽同位素亲和标记法n既可以研究全蛋白质组的变化既可以研究全蛋白质组的变化, , 也可以结合磷酸也可以结合磷酸化肽段的富集技术和串联质谱技术对磷酸化肽段化肽段的富集技
35、术和串联质谱技术对磷酸化肽段进行定量研究进行定量研究40高等课件1515N N稳定同位素标记法稳定同位素标记法n一种正常培养基，一种由一种正常培养基，一种由1515N N提供提供N N源源n质谱图中，每一个水解肽段表现为一对峰质谱图中，每一个水解肽段表现为一对峰n1515N/ N/ 1414N N的同位素丰度比可以体现出两种细胞来的同位素丰度比可以体现出两种细胞来源蛋白质表达量的相对水平源蛋白质表达量的相对水平n两种细胞表达完全一致，所有两种细胞表达完全一致，所有1515N/ N/ 1414N N丰度比将在一丰度比将在一个平均值范围内个平均值范围内n两种来源的蛋白质的磷酸化程度不同，其含磷肽段
36、两种来源的蛋白质的磷酸化程度不同，其含磷肽段与相应未磷酸化肽段的与相应未磷酸化肽段的1515N/ N/ 1414N N的丰度比就与平均值的丰度比就与平均值不同，根据其比值来进行磷酸化程度的相对定量不同，根据其比值来进行磷酸化程度的相对定量41高等课件1515N N稳定同位素标记法稳定同位素标记法42高等课件磷酸肽同位素亲和标记法磷酸肽同位素亲和标记法n使磷酸肽或磷酸化蛋白在碱性环境下发生使磷酸肽或磷酸化蛋白在碱性环境下发生消除，同消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应n对不同来源的磷酸肽或磷酸化蛋白使用不同的亲核试对不同来源的磷酸肽或磷酸化蛋白
37、使用不同的亲核试剂剂n其中一种试剂上的氢由氘代替其中一种试剂上的氢由氘代替n再通过化学反应在加成的亲核试剂上连接一个亲和标再通过化学反应在加成的亲核试剂上连接一个亲和标签（生物素）签（生物素）43高等课件磷酸肽同位素亲和标记法磷酸肽同位素亲和标记法44高等课件磷酸肽同位素亲和标记法磷酸肽同位素亲和标记法45高等课件磷酸肽同位素亲和标记法磷酸肽同位素亲和标记法46高等课件磷酸肽同位素亲和标记法磷酸肽同位素亲和标记法47高等课件第二节第二节 糖基化蛋白质的鉴定糖基化蛋白质的鉴定n糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子的分子 n糖蛋白包括酶、激素、载体
38、、凝集素、抗体等糖蛋白包括酶、激素、载体、凝集素、抗体等 n糖蛋白携带某些蛋白质代谢去向的信息糖蛋白携带某些蛋白质代谢去向的信息 n寡糖链在细胞识别、信号传递中起关键作用寡糖链在细胞识别、信号传递中起关键作用 48高等课件一、糖蛋白的结构特征一、糖蛋白的结构特征n糖链与蛋白的连接方式糖链与蛋白的连接方式 N-N-糖苷键型糖苷键型：寡糖链（：寡糖链（N-N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖GlcNACGlcNAC的的-羟基）与羟基）与AsnAsn的酰胺基、的酰胺基、N-N-未端的未端的- -氨基、氨基、LysLys或或ArgArg的的- -氨基相连氨基相连 O-O-糖苷键型糖苷键型：寡糖链（：寡糖链
39、（GalNACGalNAC的的-羟基）与羟基）与SerSer、ThrThr和羟基赖氨酸、羟脯氨酸的羟基相连和羟基赖氨酸、羟脯氨酸的羟基相连 S-S-糖苷键型糖苷键型：以半胱氨酸为连接点的糖肽键：以半胱氨酸为连接点的糖肽键 酯糖苷键型酯糖苷键型：以天冬氨酸、谷氨酸的游离羧基为连接：以天冬氨酸、谷氨酸的游离羧基为连接点点49高等课件n糖蛋白中糖链的结构糖蛋白中糖链的结构糖蛋白中的糖链变化较大，含有丰富的结构信糖蛋白中的糖链变化较大，含有丰富的结构信息，寡糖链往往是受体、酶类的识别位点息，寡糖链往往是受体、酶类的识别位点nN-N-糖苷键型（糖苷键型（N-N-连接）连接） 高甘露糖型：由高甘露糖型：由
40、GlcNAcGlcNAc和甘露糖组成和甘露糖组成 复合型：除了复合型：除了GlcNAcGlcNAc和甘露糖外、还有果和甘露糖外、还有果糖、半乳糖、唾液酸；糖、半乳糖、唾液酸； 杂合型：包含杂合型：包含和和的特征，五糖核心的特征，五糖核心nO-O-糖苷键型（糖苷键型（O-O-连接）连接）n没有五糖核心没有五糖核心50高等课件分类分类n可溶性糖蛋白可溶性糖蛋白n存在于细胞内液、各种体液及腔道腺体分泌存在于细胞内液、各种体液及腔道腺体分泌的粘液中的粘液中n血浆蛋白除白蛋白外皆为糖蛋白。血浆蛋白除白蛋白外皆为糖蛋白。n包括酶（如核酸酶类、蛋白酶类、糖苷酶类）包括酶（如核酸酶类、蛋白酶类、糖苷酶类）、肽
41、类激素（如绒毛膜促性腺激素、促黄体、肽类激素（如绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促甲状腺素、促红细胞生成素）、抗激素、促甲状腺素、促红细胞生成素）、抗体、补体、以及某些生长因子、干扰素、抑体、补体、以及某些生长因子、干扰素、抑素、凝集素及毒素等素、凝集素及毒素等 51高等课件n膜结合糖蛋白膜结合糖蛋白n肽链由疏水肽段及亲水肽段组成，疏水肽段肽链由疏水肽段及亲水肽段组成，疏水肽段可为一至数个，并通过疏水相互作用嵌入膜可为一至数个，并通过疏水相互作用嵌入膜脂双层中；亲水肽段暴露于膜外脂双层中；亲水肽段暴露于膜外n糖链连接在亲水肽段并有糖链连接在亲水肽段并有严格的方向性严格的方向性：在：在质膜表面糖链
42、一律朝外，在细胞内膜一般朝质膜表面糖链一律朝外，在细胞内膜一般朝腔面腔面n包括酶、受体、凝集素及运载蛋白等，常参包括酶、受体、凝集素及运载蛋白等，常参与细胞识别，并可作为特定细胞或细胞在特与细胞识别，并可作为特定细胞或细胞在特定阶段的表面标志或表面抗原定阶段的表面标志或表面抗原52高等课件n凝集素凝集素n糖结合蛋白，能专一识别某一特定的单糖或糖结合蛋白，能专一识别某一特定的单糖或寡糖中特定的糖基序列而与之结合寡糖中特定的糖基序列而与之结合n富集、浓缩、分离、糖链的结构分析富集、浓缩、分离、糖链的结构分析53高等课件n结构糖蛋白结构糖蛋白n为细胞外基质中的不溶性大分子糖蛋白为细胞外基质中的不溶性
43、大分子糖蛋白n胶原及各种非胶原糖蛋白胶原及各种非胶原糖蛋白( (纤粘连蛋白、层纤粘连蛋白、层粘连蛋白等粘连蛋白等) ) n作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓冲作用，参与细胞的识别、粘着及迁移，缓冲作用，参与细胞的识别、粘着及迁移，并调控细胞的增殖及分化并调控细胞的增殖及分化 54高等课件二、生物质谱技术鉴定糖蛋白二、生物质谱技术鉴定糖蛋白糖蛋白糖蛋白糖苷内切酶糖苷内切酶还原、烷基化、蛋白酶解还原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TO-MS糖含量糖含量相对分子量相对分子量MALDI-TO-MSESI串联质谱串联质谱凝集素提取凝集素提取氨基酸序列氨基酸序列糖
44、基化位点糖基化位点糖肽片段糖肽片段55高等课件n糖含量、糖苷键类型、糖基化位点是糖蛋白一糖含量、糖苷键类型、糖基化位点是糖蛋白一级结构的重要指标级结构的重要指标n糖蛋白的平均分子量及糖含量的测定糖蛋白的平均分子量及糖含量的测定n糖苷内切酶将糖链切掉，将反应前后的质谱糖苷内切酶将糖链切掉，将反应前后的质谱图比较，就能直接表述糖链的平均质量，而图比较，就能直接表述糖链的平均质量，而糖蛋白的平均糖含量可由糖链的平均质量占糖蛋白的平均糖含量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示56高等课件n糖基化类型及糖基化位点的确定糖基化类型及糖基化位点的确定n
45、蛋白酶酶切和糖苷内切酶相结合蛋白酶酶切和糖苷内切酶相结合n先用蛋白酶将糖蛋白酶切成含有或不含有糖先用蛋白酶将糖蛋白酶切成含有或不含有糖链的肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，链的肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将糖链切除，其肽质量指纹再用糖苷内切酶将糖链切除，其肽质量指纹谱将发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖谱将发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图发生位移，通过网上数据链的丢失在质谱图发生位移，通过网上数据库检索可以得到位移肽段的氨基酸序列，从库检索可以得到位移肽段的氨基酸序列，从而确定糖基化位点而确定糖基化位点57高等课件58高等课件1、MALDI-TOF-MS的
46、应用的应用n基质的选择基质的选择n- -腈基腈基4 4羟基肉桂酸羟基肉桂酸59高等课件1、MALDI-TOF-MS的应用的应用n糖蛋白的平均分子质量及糖含量的测定糖蛋白的平均分子质量及糖含量的测定n糖蛋白分子结构具有不均一性糖蛋白分子结构具有不均一性n糖链的微不均一性糖链的微不均一性n糖基化位点的不均一性糖基化位点的不均一性n多羟基结构的糖链使其质子化能力低多羟基结构的糖链使其质子化能力低n糖链末端唾液酸的干扰糖链末端唾液酸的干扰60高等课件1、MALDI-TOF-MS的应用的应用n糖蛋白的平均分子质量及糖含量的测定糖蛋白的平均分子质量及糖含量的测定n糖链的微不均一性糖链的微不均一性n质谱图上
47、表现一簇峰质谱图上表现一簇峰Gn各峰之间约相差一个糖基各峰之间约相差一个糖基n有时还出现双电荷峰有时还出现双电荷峰G2n分子离子峰变宽，糖链分子质量越大，峰越宽，分子离子峰变宽，糖链分子质量越大，峰越宽，灵敏度越差灵敏度越差61高等课件1、MALDI-TOF-MS的应用的应用典型的糖蛋白典型的糖蛋白的出峰模式，的出峰模式，不均一性造成不均一性造成多种糖形存在多种糖形存在为为51000的双电荷的双电荷峰峰杂杂质质N-糖基化质谱分析图糖基化质谱分析图62高等课件1、MALDI-TOF-MS的应用的应用去糖基化处理的质谱分析图去糖基化处理的质谱分析图去糖基化的单电荷去糖基化的单电荷峰，图谱变得简单峰
48、，图谱变得简单且峰形尖锐且峰形尖锐去糖基化的去糖基化的双电荷峰双电荷峰完整的未发生完整的未发生去糖基化的单去糖基化的单电荷峰电荷峰63高等课件1、MALDI-TOF-MS的应用的应用经唾液酸酶去唾液酸化处理的质谱分析经唾液酸酶去唾液酸化处理的质谱分析去唾液酸化的去唾液酸化的单电荷峰单电荷峰去唾液酸化的去唾液酸化的双电荷峰双电荷峰非特异非特异性降解性降解产物产物64高等课件65高等课件1、MALDI-TOF-MS的应用的应用n糖基化类型及糖基化位点的确定糖基化类型及糖基化位点的确定n寻找质谱图上峰的位移寻找质谱图上峰的位移n从位移峰的肽段序列中，寻找出可能连接糖链的氨从位移峰的肽段序列中，寻找出
49、可能连接糖链的氨基酸基酸66高等课件2、LC-ESI-Q-TOF-MSn糖链结构的分析糖链结构的分析n串联质谱的母离子扫描技术串联质谱的母离子扫描技术n选择特定的糖链离子，经碰撞活化使用惰性气选择特定的糖链离子，经碰撞活化使用惰性气体将其打碎，从而推断糖链结构体将其打碎，从而推断糖链结构n如人血清转铁蛋白的糖链结构分析如人血清转铁蛋白的糖链结构分析n选择以选择以HPLC分离的一个糖链，其分子离分离的一个糖链，其分子离子双电荷子双电荷M+2HM+2H2 2在电喷雾串联质谱中为在电喷雾串联质谱中为823.8823.8，将其设为母离子，以惰性气体与，将其设为母离子，以惰性气体与其碰撞产生碎片其碰撞产
50、生碎片67高等课件2、LC-ESI-Q-TOF-MSn糖链结构的分析糖链结构的分析68高等课件2、LC-ESI-Q-TOF-MSn糖链结构的分析糖链结构的分析n中性丢失中性丢失69高等课件3、凝集素在糖蛋白分析中的应用、凝集素在糖蛋白分析中的应用n伴刀豆蛋白（伴刀豆蛋白（ConA）对高甘露糖型）对高甘露糖型N-糖链有糖链有专一性专一性n麦胚凝集素（麦胚凝集素（WGA）对杂合型）对杂合型N-糖链有专一糖链有专一性性n兵豆凝集素对亲和核心岩藻糖类糖链有专一性兵豆凝集素对亲和核心岩藻糖类糖链有专一性70高等课件糖蛋白结构质谱解析糖蛋白结构质谱解析母母离离子子71高等课件糖蛋白结构质谱解析糖蛋白结构质
51、谱解析由于由于N-糖蛋白壳二糖核心中与天冬酰胺连接的糖蛋白壳二糖核心中与天冬酰胺连接的乙酰葡萄糖胺残基会在碰撞过程中发生跨环断乙酰葡萄糖胺残基会在碰撞过程中发生跨环断裂，先后产生质荷比裂，先后产生质荷比相差相差120，80的中性碎片的中性碎片丢失，这两个碎片是发现糖基化位点及糖肽氨丢失，这两个碎片是发现糖基化位点及糖肽氨基酸序列的标志基酸序列的标志72高等课件糖蛋白结构质谱解析糖蛋白结构质谱解析73高等课件3、凝集素在糖蛋白分析中的应用、凝集素在糖蛋白分析中的应用74高等课件第三节第三节 蛋白质相互作用的鉴定蛋白质相互作用的鉴定n免疫沉淀免疫沉淀n酵母双杂交系统酵母双杂交系统n噬菌体展示技术噬
52、菌体展示技术n串联亲和纯化串联亲和纯化(tandem affinity purification(tandem affinity purification，TAP) TAP) n蛋白质片段互补分析（蛋白质片段互补分析（protein fragment protein fragment complementation analysis,PCAcomplementation analysis,PCA）n蛋白质芯片蛋白质芯片75高等课件n酵母双杂交（酵母双杂交（two hybrid systemtwo hybrid system）n研究真核基因转录调控时建立研究真核基因转录调控时建立n利用真核生长转
53、录因子的两个不同的结构域：利用真核生长转录因子的两个不同的结构域：DNADNA结结合结构域合结构域(DNAbinding domain)(DNAbinding domain)和转录激活结构域和转录激活结构域(transcription-activating domain)(transcription-activating domain)，分别与目标，分别与目标蛋白蛋白X X 及可能与目标蛋白相互作用的蛋白及可能与目标蛋白相互作用的蛋白Y Y 相连，相连，并共同转入酵母细胞并共同转入酵母细胞; ;n如果蛋白如果蛋白X X与与Y Y能够发生相互作用就能使转录因子原能够发生相互作用就能使转录因子原来
54、分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因活下游报告基因; ;n通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用否发生相互作用76高等课件77高等课件n酵母激活因子酵母激活因子 GAL4：N端：端：147个氨基酸组成的个氨基酸组成的DNA结结合域合域(DNA binding domain,BD)， C端：端：113个氨基酸个氨基酸组成的转录激活域组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)nGAL4分子的分子的DNA结合域可以和上游激活序列
55、结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能结合，而转录激活域则能激活激活UAS下游的基因进行转录下游的基因进行转录n组成部分：（组成部分：（1）与）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（白称诱饵蛋白（bait）（）（2）与）与AD融合的蛋白表达载体，融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）（）（3）带由一个或多个）带由一个或多个报告基因的宿主菌株报告基因的宿主菌株酵母双杂交系统酵母双杂交系统78高等课件Yeast Two Hybrid原理BDX
56、COOHAD cDNANH2 COOH共转化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNA libraryNH2Gal4Gal479高等课件80高等课件优点优点n作用信号是在融合基因表达后，作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的在细胞内重建转录因子的作用而给出的，作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤省去了纯化蛋白质的繁琐步骤n检测在活细胞内进行，检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真可以在一定程度上代表细胞内的真实情况实情况n 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检因而
57、可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用n可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白不同亚细胞部位及功能的蛋白 n以用作大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物以用作大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确方向方向81高等课件局限性局限性n(1)(1)不能研究具有自
58、激活特性的蛋白质；不能研究具有自激活特性的蛋白质；n(2)(2)只能检测两个蛋白间的相互作用；只能检测两个蛋白间的相互作用；n(3)(3)检测的相互作用需发生在细胞核内，对于检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；n(4)(4)大部分实验中有将近大部分实验中有将近50%50%的假阳性率，且推的假阳性率，且推测的相互作用仅有测的相互作用仅有3% 3% 在两种以上的实验中得在两种以上的实验中得到验证到验证 82高等课件噬菌体展示技术噬菌体展示技术n噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效
59、的筛选技术，即将外源蛋白分子或多肽的基因克的筛选技术，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面合表达，展示在噬菌体颗粒的表面n由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因它的编码基因83高等课件84高等课件85高等课件LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型基因型表达型表达型86高等课件87高等课件外源基因融合于噬菌体不同区外源基因融合于噬菌
60、体不同区段外壳蛋白基因的表达模式段外壳蛋白基因的表达模式88高等课件SolidphaseselectionwithimmunotubesImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBBBBBBBvv89高等课件biotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigen90高等课件BindtoStreptavidincoatedmicrotitrewells91高等课件去除未结合的噬菌体病毒粒子去除未结合的噬菌体病毒粒子92高等课件洗脱结合的噬
61、菌体洗脱结合的噬菌体93高等课件AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyzea)ELISAb)Specificityc)Sequencingd)Affinitye)ActivityE.coli感染和扩增94高等课件34轮筛选将噬菌体文库铺在固定的诱饵上洗脱未结合的噬菌体加入宿主菌，扩增和富集洗脱的噬菌体铺富集文库铺盘分离单个克隆验证结合实验3-4轮经典噬菌体展示技术筛选流程图95高等课件96高等课件串联亲和纯化串联亲和纯化(tandem affinity purification(tandem affinity purification，TAP) TAP)
62、n融合标签方法：两个连续的标签融合标签方法：两个连续的标签n标签共分三部分：标签共分三部分：n蛋白蛋白A A nC B P (calmodulin binding peptideC B P (calmodulin binding peptide，钙，钙调素结合多肽调素结合多肽) )n中间连接的中间连接的TEV TEV 酶识别的酶切位点酶识别的酶切位点97高等课件n带有带有TAP TAP 标签的融合蛋白在细胞中表达与内源标签的融合蛋白在细胞中表达与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经IgG IgG 偶联的层析柱纯化，蛋白偶联的层析柱纯化，蛋白A A 与与I
63、gG IgG 特异结合，特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化；从而使含有标签的复合物得到第一次纯化；n为了除去与柱填料非特异结合的蛋白，用为了除去与柱填料非特异结合的蛋白，用TEV TEV 酶切割分离蛋白酶切割分离蛋白A A 标签，使含有靶蛋白的复合标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层析物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化，靶蛋白上的柱进行第二次纯化，靶蛋白上的CBPCBP标签可与标签可与钙调素结合；钙调素结合；n在加入过量螯合剂在加入过量螯合剂EGTAEGTA后后CBP CBP 与亲和层析柱分与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离
64、纯化，离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化， 经经SDS-PAGESDS-PAGE，复合物中的各个蛋白被分开，切胶、，复合物中的各个蛋白被分开，切胶、胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个蛋白的氨基酸序列蛋白的氨基酸序列98高等课件99高等课件优点优点n(1)(1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体；靶蛋白的复合体；n(2)(2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；n(3)TAP (3)TAP
65、 采用两步亲和纯化，提高了纯化产物采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性：一般在的特异性：一般在2L 2L 的酵母培养基中的酵母培养基中( (细胞湿细胞湿重约重约10g)10g)可以分离纯化得到足够一维电泳及质可以分离纯化得到足够一维电泳及质谱分析的蛋白复合物谱分析的蛋白复合物 100高等课件n已成功用于膜蛋白相互作用的系统化研究已成功用于膜蛋白相互作用的系统化研究n将荧光蛋白等报告蛋白作为蛋白互补片段与将荧光蛋白等报告蛋白作为蛋白互补片段与“诱诱饵饵”蛋白和蛋白和“猎物猎物”蛋白融合表达，可直接监测蛋白融合表达，可直接监测荧光蛋白特性的改变鉴定蛋白质的相互作用荧光蛋白特性的改变鉴定蛋白质的相互作用n更为直接，减少假阳性反应（环境因素、激素介更为直接，减少假阳性反应（环境因素、激素介导的蛋白质相互作用），能检测任何细胞类型的导的蛋白质相互作用），能检测任何细胞类型的体内和体外的蛋白质相互作用体内和体外的蛋白质相互作用n融合蛋白的设计和表达要求较高融合蛋白的设计和表达要求较高101高等课件
