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1、第九章第九章 吸光光度法吸光光度法1本章作业（教材）本章作业（教材）P240：例题：例题2本章内容提要：本章内容提要： 一、基本原理一、基本原理 二、光度计二、光度计 三、显色反应及显色条件三、显色反应及显色条件 四、吸光度测量条件的选择四、吸光度测量条件的选择 五、应用五、应用吸光光度法吸光光度法3吸吸光光（或或分分光光）光光度度法法：基基于于溶溶液液中中物物质质对对光光的选择性吸收而建立起来的分析方法。的选择性吸收而建立起来的分析方法。uu比色法：比色法：比色法：比色法：比较溶液颜色的深浅来确定物质含量。比较溶液颜色的深浅来确定物质含量。uu可见分光光度法：可见分光光度法：可见分光光度法：
2、可见分光光度法：基于物质对可见光的吸收基于物质对可见光的吸收uu紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：（紫外光）（紫外光）uu紫外紫外紫外紫外- - - -可见分光光度法：可见分光光度法：可见分光光度法：可见分光光度法：（紫外光、可见光）（紫外光、可见光）uu红外分光光度法：红外分光光度法：红外分光光度法：红外分光光度法：（红外光）（红外光）4 重铬酸钾法测定铁矿石中铁含量重铬酸钾法测定铁矿石中铁含量 铁矿石中铁含量：铁矿石中铁含量： 70%； 1 g 200 mL，溶液中铁含量：溶液中铁含量：3.5 mg/mL 邻菲罗啉分光光度法测定微量铁邻菲罗啉分光光度法测定微量
3、铁 标准曲线上查出：标准曲线上查出： 未知液浓度：未知液浓度：0.001 mg/mL 原液浓度：原液浓度：0.05 mg/mL5吸光光度法的特点：吸光光度法的特点：灵敏度较高，检测下限达灵敏度较高，检测下限达10 5 10 6 mol/L，适用于微量组分的测定。适用于微量组分的测定。测定的相对误差约为测定的相对误差约为2% 5%。测定迅速，仪器操作简单，价格较便宜。测定迅速，仪器操作简单，价格较便宜。应用广泛，几乎所有的无机物质和许多有机应用广泛，几乎所有的无机物质和许多有机物质都能用此法进行测定。物质都能用此法进行测定。69.1 9.1 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理1.光的基本性质光
4、的基本性质2.紫外紫外-可见吸收光谱的产生可见吸收光谱的产生3.物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收4.光吸收的基本定律光吸收的基本定律 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光可可见见光光（visible light）：400800 nm，人人眼眼能能感感觉觉到到的光；在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色的光；在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色。紫外光（紫外光（ultraviolet light）：）：200 400 nm9.1.1 光
5、的电磁波性质光的电磁波性质78单色光：单色光：单一波长单一波长复合光：复合光：由不同波长的光组合而成由不同波长的光组合而成光的互补：光的互补：两种单色光以适当的比例混合得到白光；两种单色光以适当的比例混合得到白光； 称这两种单色光为称这两种单色光为互补色光互补色光。物物质质对对光光的的选选择择性性吸吸收收：白白光光通通过过有有色色溶溶液液时时，该该溶溶液液会会选选择择性性地地吸吸收收某某些些波波长长的的光光，呈呈现现透透射射光光的的颜颜色；吸收光和透射光互为补色。色；吸收光和透射光互为补色。光的互补光的互补：蓝：蓝 黄黄9600650780光的互补关系光的互补关系KMnO4溶液：紫红色，吸收溶
6、液：紫红色，吸收500-560 nm的绿光的绿光109.1.2 紫外紫外-可见吸收光谱的产生可见吸收光谱的产生分子内部三种分子内部三种运动形式运动形式分子具有三种分子具有三种不同能级不同能级分子内能分子内能电子相对于原子核的电子相对于原子核的运动运动电子能级电子能级电子能量电子能量Ee原子核在其平衡位置原子核在其平衡位置附近的相对振动附近的相对振动振动能级振动能级振动能量振动能量Ev分子本身绕其重心的分子本身绕其重心的转动转动转动能级转动能级转动能量转动能量Er能级是量子化的，且各自具有确定能量值能级是量子化的，且各自具有确定能量值11uu转转转转动动动动能能能能级级级级能能能能量量量量差差差
7、差：0.005 0.05 eV，跃跃迁迁产产生生的的吸吸收收光光谱谱位位于于远远红红外外区区（远远红红外外光光谱谱或或分分子子转转动动光光谱）。谱）。uu振振振振动动动动能能能能级级级级能能能能量量量量差差差差：0.05 1 eV，跃跃迁迁产产生生的的吸吸收收光谱位于红外区（红外光谱或分子振动光谱）。光谱位于红外区（红外光谱或分子振动光谱）。uu电电电电子子子子能能能能级级级级能能能能量量量量差差差差：1 20 eV。电电子子跃跃迁迁产产生生的的吸吸收收光光谱谱在在紫紫外外-可可见见光光区区（紫紫外外-可可见见光光谱谱或或分分子子的电子光谱）。的电子光谱）。12能级跃迁能级跃迁能级跃迁能级跃迁
8、电电子子能能级级间间跃跃迁迁的的同同时时，总总伴伴随随有有振振动动和和转动能级间的跃迁。转动能级间的跃迁。电电子子光光谱谱中中总总包包含含有有振振动动/ /转转动动能能级级间间跃跃迁迁产产生生的的若若干干谱谱线线，呈呈现现宽谱带（带状光谱）。宽谱带（带状光谱）。139.1.3 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收当一束光照射到物质上时，光与物质发生相互作当一束光照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是产生用，于是产生反射、散射、透射、吸收反射、散射、透射、吸收。14光的吸收光的吸收（absorption）：当当一一束束光光照照射射到到某某物物质质或或其其溶溶液液时时，分分子子、离离子子与
9、与光光子子发发生生“碰碰撞撞”，吸吸收收光光子子能能量量，由由基基态态跃跃迁到激发态。迁到激发态。15光的选择性吸收：光的选择性吸收：u分子、原子或离子具有不连续的量子化能级。分子、原子或离子具有不连续的量子化能级。u仅当光子能量与被照物质基态和激发态能量之仅当光子能量与被照物质基态和激发态能量之差相等时才能发生吸收。差相等时才能发生吸收。 E = E2 E1 = h u不同的物质由于其结构不同而具有不同的量子不同的物质由于其结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同，化能级，其能量差也不相同，物质对光的吸收物质对光的吸收具有选择性具有选择性。16吸收曲线（吸收光谱）：吸收曲线（吸收光谱
10、）：u测量溶液对不同波长光的吸收，以波长为横坐测量溶液对不同波长光的吸收，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到标，吸光度为纵坐标作图，得到吸收曲线吸收曲线吸收曲线吸收曲线。u描述了物质对不同波长光的吸收能力。描述了物质对不同波长光的吸收能力。吸收曲线吸收曲线A (nm)最大吸收波长：最大吸收波长： max17吸收曲线的讨论：吸收曲线的讨论：（1 1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。（2 2）吸吸收收曲曲线线可可以以提提供供物物质质的的结结构构信信息息，并并作作为为物物质质定定性性分分析析的的依依据据之之一一。也也是是定定量量分分析析中中选选择择入入
11、射射光波长的重要依据。光波长的重要依据。（3 3）不不同同浓浓度度的的同同一一种种物物质质，其其吸吸收收曲曲线线形形状状相相似似。在在某某一一定定波波长长下下吸吸光光度度有有差差异异，在在max处处吸吸光光度度的的差差异最大，测定最灵敏，可用于物质异最大，测定最灵敏，可用于物质定量分析定量分析。18不同浓度，同一物质不同浓度，同一物质同一浓度，不同物质同一浓度，不同物质199.1.4 光吸收的基本定律光吸收的基本定律朗伯朗伯- -比尔定律：比尔定律：布布格格（Bouguer）和和朗朗伯伯（Lambert）先先后后于于1729年年和和1760年年阐明明了了光光的的吸吸收收程程度度和和吸吸收收层厚
12、度厚度的关系：的关系：A b1852年年比比尔尔（Beer）又又提提出出了了光光的的吸吸收收程程度度和和吸吸光物光物质浓度度之之间也具有也具有类似的关系：似的关系：A c 朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律： A = bc II020A = lgT = lg(I0/It) = bc A：吸光度；描述溶液：吸光度；描述溶液对光的吸收程度光的吸收程度 b：液：液层厚度（光程厚度（光程长度），度），单位位 cm c：溶液的摩：溶液的摩尔尔浓度，度，单位位 molL 1 ：摩：摩尔尔吸光系数，吸光系数，单位位 Lmol 1cm 1或或: A = lg(I0/It) = abc c：溶液的：溶液的浓度，度，单
13、位位 gL 1 a：吸光系数，：吸光系数，单位位 Lg 1cm 1 a与与的关系的关系为： = aM （M为摩摩尔尔质量）量） 21透光度（透光率）透光度（透光率）T：T = It /I0T：描述入射光透描述入射光透过溶液的程度溶液的程度吸光度吸光度A与透光度与透光度T的关系：的关系： A lgT u朗伯朗伯-比比尔尔定律是吸光光度法的理定律是吸光光度法的理论基基础 和定量和定量测定的依据。定的依据。u吸光度具有加和性：吸光度具有加和性：22摩尔吸光系数摩尔吸光系数 的讨论：的讨论：u吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；u不不随随浓浓度度和和光光
14、程程长长度度的的改改变变而而改改变变。在在温温度度和和波波长长等等条条件件一一定定时时， 仅仅与与吸吸光光物物质质本本身身的的性性质质有关；有关；u可作为定性鉴定的参数；可作为定性鉴定的参数；u同同一一吸吸光光物物质质在在不不同同波波长长下下的的不不同同。在在max处处的的常常以以max表表示示。max越越大大，该该物物质质的的吸吸光光能能力力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。23朗伯朗伯- -比尔定律的适用条件：比尔定律的适用条件：u入射光为单色光；应选用处或肩峰处测定。入射光为单色光；应选用处或肩峰处测定。u吸吸光光质质点点形形式式不不变变：离离解
15、解、络络合合、缔缔合合会会破破坏坏线线性性关关系系，应应控控制制测测定定的的条条件件（酸酸度度、浓浓度、介质等）。度、介质等）。u稀稀溶溶液液：吸吸光光质质点点之之间间不不存存在在相相互互作作用用；浓浓度增大，分子之间相互作用增强。度增大，分子之间相互作用增强。24朗伯朗伯- -比尔定律的偏离：比尔定律的偏离：标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时）。标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时）。引起这种偏离的因素（两大类）：引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理因素，即仪器非理想）物理因素，即仪器非理想 （2）化
16、学因素）化学因素25（1 1）物理因素）物理因素难以以获得真正的得真正的单色光。色光。分光光度分光光度计只能只能获得近乎得近乎单色的狭窄光色的狭窄光带。入射光：由两种波入射光：由两种波长1和和2的光的光组成成 A1 = lg(I01 /It1) = 1bc A2 = lg(I02 /It2) = 2bc故：故：It1 = I01 10 1bc It2 = I02 10 2bc 26 A总总 = lg(I0总总/It总总 ) = lg(I01 + I02)/(It1 + It2) = lg(I01 + I02)/(I01 10 1bc + I02 10 2bc) 若若 1 = 2，A = bc，
17、呈直，呈直线关系；关系；若若 1 2，A与与c不呈直不呈直线关系；关系； 1 与与 2差差别越大，偏离越越大，偏离越严重。重。克服偏离的措施：克服偏离的措施：1.选择较好的好的单色器；色器；2.选用用 max处的光作的光作入射光。入射光。27（2）化学因素）化学因素 朗朗伯伯-比比耳耳定定律律只只适适用用于于稀稀溶溶液液。高高浓度度时，吸吸光光粒子之粒子之间存在相互作用，改存在相互作用，改变其吸光能力。其吸光能力。 溶溶液液中中存存在在离离解解、聚聚合合、互互变异异构构、配配合合物物的的形形成等化学平衡，使吸光物成等化学平衡，使吸光物质的的浓度度发生生变化。化。 例：例： 铬酸酸盐或重或重铬酸
18、酸盐溶液中存在下列平衡：溶液中存在下列平衡： CrO42 2H+ = Cr2O72 + H2O 溶溶液液中中CrO42 、Cr2O72 的的颜色色不不同同，吸吸光光性性质也也 不相同。故此不相同。故此时溶液溶液pH 对测定有重要影响。定有重要影响。289.2 9.2 光度计及其基本部件光度计及其基本部件1.基本组成基本组成2.类型类型29可见分光光度计可见分光光度计尤尼柯尤尼柯 20002000上海上海 723PC30紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计贝克曼贝克曼 U800岛津岛津 UV2550319.2.1 9.2.1 基本组成基本组成1. 1. 光源光源要要求求：在在整整个个紫紫外
19、外光光区区或或可可见见光光谱谱区区可可以以发发射射连连续续光光谱谱，具具有有足足够够的的辐辐射射强强度度、较较好好的的稳稳定定性性、较较长长的使用寿命。的使用寿命。 可可见光区：光区：钨灯，灯，波波长范范围320 2500 nm 紫外区：紫外区：氢灯或灯或氘灯，灯，波波长范范围180 375 nm光源光源单色器单色器样品室样品室检测器检测器显示器显示器322. 2. 单色器单色器作用：将光源发射的复合光分解成单色光，并可从作用：将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出一任波长单色光。中选出一任波长单色光。u入射狭缝：入射狭缝：光源的光由此进入单色器光源的光由此进入单色器u准直透镜：准直透镜
20、：使入射光成为平行光束使入射光成为平行光束u色散元件：色散元件：复合光分解成单色光，棱镜或光栅复合光分解成单色光，棱镜或光栅u聚焦透镜：聚焦透镜：透镜或凹面反射镜透镜或凹面反射镜u出射狭缝：出射狭缝：所需波长的光通过狭缝照射到试液上所需波长的光通过狭缝照射到试液上33棱镜单色器棱镜单色器u棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同而依据不同波长光通过棱镜时折射率不同而将不同波长的光分开将不同波长的光分开。u光栅：光栅：利用光的衍射与干涉作用制成。利用光的衍射与干涉作用制成。343. 3. 样品室样品室样品室放置各种类型样品室放置各种类型吸收池（比色皿）吸收池（比色皿）和相应和相应池架附件。
21、池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。354. 4. 检测器检测器利利用用光光电电效效应应将将透透过吸吸收收池池的的光光信信号号变成成可可测的的电信信号号，常常用用的的有有：光光电池池、光光电管管、光光电电倍倍增增管管（photomultiplier, PMT）、光光电电二二极极管管阵阵列列（photo-diode array, PDA）。5. 5. 结果显示记录系统结果显示记录系统检流计、微安表、电位计、数字电压表、记录检流计、微安表、电位计、数字电压表、记录仪、示波器及计算机
22、等进行仪、示波器及计算机等进行仪器自动控制和结仪器自动控制和结果处理果处理。369.2.2 9.2.2 分光光度计的类型分光光度计的类型1. 1. 单光束型单光束型简单，价廉，简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。器具有很高的稳定性。参比池参比池372. 2. 双光束型双光束型自自动动记记录录，快快速速全全波波段段扫扫描描。可可消消除除光光源源不不稳稳定定、检检测测器器灵灵敏敏度度变变化化等等因因素素的的影影响响，特特别别适适合于结构分析。仪器复杂，
23、价格较高。合于结构分析。仪器复杂，价格较高。 参比池参比池383. 3. 双波长型双波长型u通通过过波波长长选选择择可可校校正正背背景景吸吸收收：消消除除吸吸收收光光谱谱重重叠干扰，适合于混浊液和多组分分析。叠干扰，适合于混浊液和多组分分析。u只只使使用用一一个个吸吸收收池池：参参比比溶溶液液即即被被测测溶溶液液，避避免免单单波波长长法法中中因因两两种种溶溶液液组组成成、均均匀匀性性差差异异及及吸吸收收池差异所引入的误差。池差异所引入的误差。 1 2不不同同波波长长的的两两束束单单色色光光快快速速交交替替通过同一吸收池后到达检测器。通过同一吸收池后到达检测器。399.3 9.3 显色反应及显色
24、条件的选择显色反应及显色条件的选择1.显色反应的选择显色反应的选择2.显色条件的选择显色条件的选择3.显色剂显色剂409.3.1 9.3.1 显色反应的选择显色反应的选择显色反应：显色反应： Mn+ + R = M-R 待待测组分分颜色色A显色色剂颜色色B有色化合物有色化合物颜色色C配位显色反应配位显色反应氧化还原显色反应氧化还原显色反应 测定其吸光度定其吸光度或吸收曲或吸收曲线橙红色橙红色41显显色反色反应应选选择择需需考考虑的因虑的因素：素：1.灵敏度高灵敏度高 ：一般一般 1042.选择性性好好3.显色色剂在在测定波定波长处无明无明显吸收吸收 试剂空空白白小小，提提高高准准确确度度；两两
25、种种有有色色物物最最大大吸吸收收波波长之差（之差（对比比度，度， ） 60 nm。生成的有色化合物生成的有色化合物组成恒定，性成恒定，性质稳定定。Mn+ + R = M-R 429.3.2 9.3.2 显色条件的选择显色条件的选择显色色剂用量用量酸度酸度显色温度色温度显色色时间干干扰的消除的消除Mn+ + R = M-R 1.1.显色剂显色剂用量（用量（cM、pH一定）一定）必须严格控制必须严格控制显色剂用量显色剂用量吸光度与显色剂浓度的关系曲线吸光度与显色剂浓度的关系曲线选择曲线变化平坦处，选择曲线变化平坦处，对显色剂用量要求不对显色剂用量要求不太严格。太严格。432.2.反应体系的酸度反应
26、体系的酸度（cM、cR一定）一定）酸度影响酸度影响HR的存在型体，的存在型体，可能影响金属离子的水解。可能影响金属离子的水解。大多数有机大多数有机显色色剂是有机弱酸：是有机弱酸：HR H+ + RMR +Mn+ 选择曲曲线中中吸吸光光度度较大大且且恒恒定定的的平平坦坦区区所所对应的的pH范范围。pH A443.3.显色温度显色温度通过实验找出适宜的温度范围。通过实验找出适宜的温度范围。ATATATATAT4.4.显色时间显色时间通通过实验，作，作A t 曲曲线，找出适宜的，找出适宜的显色色时间。455. 5. 干扰离子的消除干扰离子的消除（1 1）掩蔽）掩蔽（配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂）（配位
27、掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂） 使干扰离子生成无色配合物或无色离子使干扰离子生成无色配合物或无色离子（2 2）选择适当的显色条件）选择适当的显色条件如：用磺基水杨酸测定如：用磺基水杨酸测定Fe3+时，时，Cu2+与试剂形成黄色配合物，与试剂形成黄色配合物， 干扰测定；控制干扰测定；控制pH在在2.5左右，左右，Cu2+则不与试剂反应。则不与试剂反应。（3 3）分离干扰离子）分离干扰离子（沉淀、离子交换、萃取）（沉淀、离子交换、萃取）（4 4）选择适当的光度测量条件）选择适当的光度测量条件（波长、参比溶液）（波长、参比溶液）Mn+ + R = M-R N 469.3.3 9.3.3 显色剂显色剂1.1
28、.无机显色剂：无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等。硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等。2.2.有机显色剂：有机显色剂：种类繁多，应用广泛。种类繁多，应用广泛。偶偶氮氮类类：性性质质稳稳定定，显显色色反反应应灵灵敏敏度度高高，选选择择性性好好，对比度大，应用最广泛。对比度大，应用最广泛。三苯甲烷类：三苯甲烷类：铬天青铬天青S S、二甲酚橙等、二甲酚橙等。偶氮偶氮胂III铬天青天青S47（a）发色团（生色团）发色团（生色团） （偶氮基）（偶氮基）NN （亚硝基）硝基）NO（硫羰基）（硫羰基） C=S使化合物使化合物产生生颜色或在紫外色或在紫外-可可见光区光区产生吸收生吸收不不饱和基和基团（醌基）（
29、醌基）（b）助色团）助色团不不使使化化合合物物产生生颜色色，能能使使发色色团的的吸吸收收峰峰向向长波方向移波方向移动，同，同时使吸收使吸收强强度增加；度增加；通常由含有孤通常由含有孤对电子的原子子的原子组成。成。 OH、SH、NH2、 Br48红移与蓝移，增色效应与减色效应红移与蓝移，增色效应与减色效应红移红移增色增色减色减色蓝移蓝移波长波长 吸吸收收499.4 9.4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择1.入射光波长的选择入射光波长的选择2.参比溶液的选择参比溶液的选择3.吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择50 一般一般选择 max 若若max处有共存组分干扰，应考虑选择灵敏度处
30、有共存组分干扰，应考虑选择灵敏度 稍低但能避免干扰的入射光波稍低但能避免干扰的入射光波长。长。9.4.1 9.4.1 入射光波长的选择入射光波长的选择选选500 nm，灵灵敏敏度度下下降降，却却消消除除了了干干扰扰，提提高高了了测测定定的的选择性和准确度。选择性和准确度。A：钴配合物：钴配合物B：显色剂：显色剂51采用参比溶液的目的：采用参比溶液的目的：测得的吸光度真实反映待测溶液对光的吸收。测得的吸光度真实反映待测溶液对光的吸收。9.4.2 9.4.2 参比溶液的选择参比溶液的选择 选择参比溶液的方法：选择参比溶液的方法： 试液、显色剂和条件试剂（如缓冲溶液、掩试液、显色剂和条件试剂（如缓冲
31、溶液、掩 蔽剂等）均无吸收蔽剂等）均无吸收 参比溶液：参比溶液：纯溶剂（水纯溶剂（水) )；Mn+ + R = M-R II052 显色剂或条件试剂略有吸收显色剂或条件试剂略有吸收, ,而试液无吸收而试液无吸收 参比溶液：参比溶液：“试剂空白试剂空白”( (不加试液不加试液) ) Mn+ + R = M-R 显色剂、条件试剂无吸收，而试液有吸收显色剂、条件试剂无吸收，而试液有吸收 参比溶液：参比溶液：“试液空白试液空白”( (不加显色剂和条件试剂不加显色剂和条件试剂) )Mn+ + R = M-R 显色剂、条件试剂、试液中其他组分均有吸收显色剂、条件试剂、试液中其他组分均有吸收 参比溶液：参比
32、溶液：在试液中加入掩蔽剂，将待测组分掩蔽，在试液中加入掩蔽剂，将待测组分掩蔽， 再加显色剂。再加显色剂。Mn+ + R = M-R 539.4.3 9.4.3 吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择分光光度计测量的是分光光度计测量的是透光度透光度 T；光度计的读数误差（光度计的读数误差（ T）一般为一般为0.2 2%。A = lgT = bc lgT = bc （式（式1）微分：微分：d(lgT) = 0.4343d(lnT) = 0.4343 dT/T = bdc （式（式2）式式2除以式除以式1，得，得54c/c：测量量结果的相果的相对误差差 ErT ：（0.22）T ：透光度：透光度读
33、数数不同的透光度读数，产生的误差大小不同。不同的透光度读数，产生的误差大小不同。TEr 100T = 0.5%Er 最小值为最小值为 1.4，此时，此时 T = 36.8%，A = 0.434若需保证若需保证Er 2%，则，则 T = 12% 70% A = 0.15 0.92一般：一般：0.2 0.8559.5 9.5 吸光度法的应用吸光度法的应用1.试样中微量组分的测定试样中微量组分的测定2.弱酸和弱碱离解常数的测定弱酸和弱碱离解常数的测定3.络合物组成及稳定常数的测定络合物组成及稳定常数的测定569.5.1 9.5.1 试样中微量组分的测定试样中微量组分的测定1. 1. 单组分测定单组分
34、测定（A c 曲线法）曲线法）铁含量的测定：邻二氮菲法铁含量的测定：邻二氮菲法（橙红色配合物）（橙红色配合物）氨基酸的测定：茚三酮法氨基酸的测定：茚三酮法（紫色化合物）（紫色化合物）蛋白质的测定：考马斯亮蓝法蛋白质的测定：考马斯亮蓝法（深蓝色复合物）（深蓝色复合物）水质总磷的测定：钼酸铵分光光度法（水质总磷的测定：钼酸铵分光光度法（GB 11893-89） （蓝色络合物）（蓝色络合物）572. 2. 多组分分析多组分分析 各组分的吸收曲线不重叠各组分的吸收曲线不重叠 各组分的吸收曲线重叠各组分的吸收曲线重叠利用吸光度的加合性：利用吸光度的加合性： A1 = a1 bca b1bcb A2 =
35、a2 bca b2bcb解联立方程得解联立方程得 ca、cb 值值分别由纯分别由纯A、纯、纯B在在 1和和 2处测处测A后计算求出。后计算求出。58HL = H+ + L- (1) 配制一系列总浓度配制一系列总浓度(c)相等，而相等，而pH不同的不同的HL溶液；溶液；(2) 测定各溶液的测定各溶液的pH值；值；(3) 在酸式在酸式(HL)或碱式或碱式(L-)最大吸收波长处，测吸光度最大吸收波长处，测吸光度。9.5.2 9.5.2 弱酸（碱）解离常数的测定弱酸（碱）解离常数的测定b = 1 cm59(4)假设高酸度时，弱酸全部以酸式形式存在，则假设高酸度时，弱酸全部以酸式形式存在，则: AHL=
36、 HLc(5)在低酸度时，弱酸全部以碱式形式存在，则在低酸度时，弱酸全部以碱式形式存在，则: AL= Lc截距为截距为 pKa60摩尔比法（饱和法）摩尔比法（饱和法） M + nL = MLn(1) cM固定，固定，cL逐渐增大，逐渐增大， 测吸光度。测吸光度。(2) cL/cMn，配位不完全，配位不完全 cL/cMn，配位完全，配位完全9.5.3 9.5.3 络合物组成的测定络合物组成的测定61本章小结本章小结朗伯比尔定律：朗伯比尔定律：A = bc A = abc （计算）（计算）光度计组成（光源、比色皿）光度计组成（光源、比色皿）吸光度测量条件的选择（吸收波长、参比溶液、吸光度测量条件的选择（吸收波长、参比溶液、读数范围）读数范围）吸光光度法的应用（微量铁的测定）吸光光度法的应用（微量铁的测定）
