《细菌的遗传分析》PPT课件.ppt

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1、第六章第六章 细菌的遗传分析细菌的遗传分析真核生物基因分离、真核生物基因分离、自由组合及连锁交换自由组合及连锁交换均通过有性过程均通过有性过程(减减数分裂数分裂受精受精)实实现。细菌和病毒均属现。细菌和病毒均属于原核生物不存在严于原核生物不存在严格意义上的有性过程。格意义上的有性过程。但细菌细胞内除了染色体外还有一但细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子些寄生性复制因子(如噬菌体和质如噬菌体和质粒，也被称为核外或染色体外因子粒，也被称为核外或染色体外因子)，它们可以在细胞间传递，并且，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的

2、重组体。与核外遗传因子间的重组体。这种重组体结构类似于真核生这种重组体结构类似于真核生物减数分裂过程中形成的重组物减数分裂过程中形成的重组体结构。体结构。第一节第一节 细菌的细胞和染色体细菌的细胞和染色体一、细菌细胞一、细菌细胞 细胞比较小，仅含有细胞比较小，仅含有1-2条染色体，条染色体，每条附着在细胞膜上的一定区域，无每条附着在细胞膜上的一定区域，无核膜，称拟核。细菌每核膜，称拟核。细菌每20分钟繁殖一分钟繁殖一代代二、细菌染色体二、细菌染色体 大都是双链大都是双链DNA环状结构，长度从环状结构，长度从2535000不等，裸露，无蛋白质结不等，裸露，无蛋白质结合，也不形成核小体，所以其染色

3、体合，也不形成核小体，所以其染色体的显著特点是：易于接受带有相同或的显著特点是：易于接受带有相同或不同物种的基因或不同物种的基因或DNA片段的插入。片段的插入。 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA以折叠或螺旋以折叠或螺旋状态存在，且依赖于状态存在，且依赖于RNA分子的作用。分子的作用。 第二节第二节 大肠杆菌的突变型及筛选大肠杆菌的突变型及筛选一、大肠杆菌的突变类型一、大肠杆菌的突变类型（一）合成代谢功能的突变型（一）合成代谢功能的突变型（anabolic functional mutants) : 合成代谢功能合成代谢功能(anabolic function):野生型（原养野生型（原养型）品

4、系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长型）品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必须的复杂有机物的功能。所必须的复杂有机物的功能。 营养缺陷型：营养缺陷型：一个必需的基因发生了突变不能进一个必需的基因发生了突变不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现。能的实现。 条件致死突变条件致死突变（二）分解代谢功能的突变型（二）分解代谢功能的突变型（catabolic functional mutants):条件致死突变型。条件致死突变型。 分解代谢功能（分解代谢功能（ anabolic function）：野野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖

5、复杂的不同碳源，生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能把复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简因为它能把复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能把复杂分子如氨基酸或脂肪酸单的糖类，也能把复杂分子如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间产物。这些降降解为乙酸或三羧酸循环的中间产物。这些降解功能称解功能称。 同样，一系列降解功能的实现也需要许多基同样，一系列降解功能的实现也需要许多基因的表达，其中任何一个基因突变都会影响降因的表达，其中任何一个基因突变都会影响降解功能的实现。解功能的实现。（三）抗性突变型：细菌由于某基因的突变而（三）抗性突变型：细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗菌

6、素产生抗性。对某些噬菌体或抗菌素产生抗性。二、突变型的筛选二、突变型的筛选营养缺陷型的筛选、鉴定：营养缺陷型的筛选、鉴定：选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养（补充）选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养（补充）培养基上的生长表现将菌株分为原养型培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原也称为原生营养型生营养型)与营养缺陷型与营养缺陷型(在基本培养基上不能正常在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长生长，只能在相应的营养培养基上生长)。其它突变类型的筛选、鉴定：其它突变类型的筛选、鉴定：对于其它的突变类型对于其它的突变类型(如温度敏感型如温度敏感型)，也可以通过，也可以通过

7、培养条件的选择培养来筛选与鉴定。培养条件的选择培养来筛选与鉴定。选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，仅采要检测分离含有多种突变型的混和菌株，仅采用选择培养法要进行多次试验才能够达到目的、用选择培养法要进行多次试验才能够达到目的、效率太低。效率太低。为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了德伯格夫妇设计了影印培养法影印培养法。该方法原理与选择培养法一致，但是采用影该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在印法将在完全培养基完全培养基上单菌落同时接种到不上单菌

8、落同时接种到不同选择培养基上同时对所有菌落进行选择培同选择培养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。养，鉴定效率大大提高。注意：注意：(1)最初的培养基必须是非选择性的，最初的培养基必须是非选择性的，即各种突变型都能够在其上生长；即各种突变型都能够在其上生长；(2)必须采用适当的方法如涂布或划线必须采用适当的方法如涂布或划线法，以使培养物菌落之间要分开。法，以使培养物菌落之间要分开。影印培养法：影印培养法：三、细菌基因的统一写法三、细菌基因的统一写法1. 基因座位写法基因座位写法（1）用）用三个三个缩写字母表示缩写字母表示（2）都用）都用小写小写字母字母（3）都用）都用斜体斜体字母

9、字母（4）用）用右上角右上角字母或符号表示野生字母或符号表示野生型（型（+）、突变型（）、突变型（-）、抗性（）、抗性（r）或敏感性（或敏感性（s）。）。如：如：gal+、gal-（1）用）用三个三个缩写字母表示缩写字母表示（2）第一个字母用）第一个字母用大写大写字母字母（3）都用）都用正体正体字母字母（4）用）用右上角右上角字母或符号表示野生字母或符号表示野生型（型（+）、突变型（）、突变型（-）、抗性（）、抗性（r）或敏感性（或敏感性（s）。）。如：如：Gal+、Gal-2. 表型的写法表型的写法（5）如果一个基因座位内部有多个基因位）如果一个基因座位内部有多个基因位点，在座位的后面用点，

10、在座位的后面用正体大写字母正体大写字母表示表示如：如：lac Z、 lac Y等等二、酵母菌基因的统一写法二、酵母菌基因的统一写法1. 基因座位写法基因座位写法（1）用）用三个三个缩写字母表示基因功能缩写字母表示基因功能（3）都用）都用斜体斜体字母字母（2）基因后面用数字表示不同的基）基因后面用数字表示不同的基因座位。因座位。如：如：GAL4，CDC282. 基因产物的写法基因产物的写法基因符号的基因符号的正体正体字形式字形式如：如：GAL4，CDC28四、细菌中常用的基因符号四、细菌中常用的基因符号基因基因符号符号表型功能表型功能基因基因符号符号表型功能表型功能ara不能利用阿拉伯糖不能利用

11、阿拉伯糖pur嘌呤不能合成嘌呤不能合成att原噬菌体附着点原噬菌体附着点pdx吡哆醇不能合成吡哆醇不能合成azi叠氮化钠抗性叠氮化钠抗性pyr嘧啶不能合成嘧啶不能合成bio生物素不能合成生物素不能合成rha鼠李糖不能利用鼠李糖不能利用gal半乳糖不能利用半乳糖不能利用str链霉素抗性链霉素抗性lac乳糖不能利用乳糖不能利用thi硫胺不能合成硫胺不能合成mal麦芽糖不能利用麦芽糖不能利用ton噬菌体噬菌体T1抗性抗性man 甘露糖不能利用甘露糖不能利用tsx噬菌体噬菌体T6抗性抗性mtl甘露糖醇不能利用甘露糖醇不能利用xyl木糖不能利用木糖不能利用第三节第三节 大肠杆菌的性别大肠杆菌的性别传统上

12、将这部分内容放在细菌的接合（传统上将这部分内容放在细菌的接合（conjugation）一节。）一节。一、大肠杆菌性别的发现一、大肠杆菌性别的发现1. E. coli接合的发现接合的发现1946年年Joshua Lederberg和和Edward Tatum发现发现了细菌之间通过直接接触传递遗传信息。了细菌之间通过直接接触传递遗传信息。Lederberg由于研究细菌的重组而获得由于研究细菌的重组而获得1958年年Nobel Medicine or physiology Prize。Tatum和和G.W.Beable提出的提出的“一个基因一个一个基因一个酶酶”也在此奖中。也在此奖中。（1）Lede

13、rberg-Tatum实验实验 菌株菌株Tatum的的K12菌株（菌株（当时并不知道含有当时并不知道含有F因子因子）。）。具有多重营养缺陷型（具有多重营养缺陷型（multiple-auxotroph）突变：突变：A strain：met - bio- thi+ leu+ thr+B strain：met + bio+ thi- leu- thr-都只能在完全培养基（都只能在完全培养基（complete medium）中生长。）中生长。Lederberg发明的用基本培养基（发明的用基本培养基（minimal medium）筛选原养型（）筛选原养型（prototroph）方法。）方法。 实验过程实

14、验过程对照（对照（control） 对实验结果的解释对实验结果的解释Lederberg和和Tatum从概率上和对照实验上从概率上和对照实验上排除了细菌发生恢复突变的可能性：排除了细菌发生恢复突变的可能性：a）单一性状恢复突变率是）单一性状恢复突变率是10-7，双性状，双性状恢复突变的概率是恢复突变的概率是10-14。结论：结论：在在A菌株与菌株与B菌株之间发生了遗传物质菌株之间发生了遗传物质的交换。的交换。b）对照培养的）对照培养的A、B菌株都没有生长出菌落。菌株都没有生长出菌落。2.2.对对Lederberg-Tatum实验解释的质疑实验解释的质疑 （1）实验获得的原养型重组菌可能是）实验获

15、得的原养型重组菌可能是转化的结果。转化的结果。（2）培养基中含有某些代谢产物，混合）培养基中含有某些代谢产物，混合后互相补充了对方的缺陷而得以生长。后互相补充了对方的缺陷而得以生长。3. Lederberg和和Tatum的补充试验的补充试验A（或（或B）菌株菌株基本培养基中培养基本培养基中培养细菌滤器过滤细菌滤器过滤滤液滤液B（或（或A）菌株菌株基本培养基中培养基本培养基中培养不能生长不能生长4. Bernard Davis实验的支持实验的支持1950年年Davis的的U形管实形管实验证实不同验证实不同菌株的杂交菌株的杂交需要细胞的需要细胞的直接接触。直接接触。5.5.杂交菌株的作用的区分杂交

16、菌株的作用的区分1952年年William Hayes和和Luca Cavalli-Sforza在重复在重复Lederberg-Tatum实验时发现：实验时发现：用高剂量的链霉素处理用高剂量的链霉素处理A、B菌株对杂菌株对杂交会产生不同的影响交会产生不同的影响。（1）Hayes实验实验strain A链霉素链霉素strain Bstrain A杂交转化杂交转化（2 2）实验推论）实验推论strain B链霉素链霉素strain Astrain B不能杂交转化不能杂交转化链霉素只阻止细菌分裂，但允许接触杂交。链霉素只阻止细菌分裂，但允许接触杂交。 供体：供体：strain A虽然被阻止分裂，但仍

17、然能完成虽然被阻止分裂，但仍然能完成杂交（给出杂交（给出DNA），结果产生分裂形成的），结果产生分裂形成的原养型菌落。原养型菌落。（3）Hayes的意外的意外结论结论异宗配合（异宗配合（heterothallic）：）：strain B 被阻止分裂，也仍然能完成杂被阻止分裂，也仍然能完成杂交（接收交（接收DNA），但不能分裂形成原养），但不能分裂形成原养型菌落。型菌落。 受体：受体：用在冰箱放了一年的一个用在冰箱放了一年的一个A菌株（链霉素菌株（链霉素敏感性的供体）与敏感性的供体）与B菌株杂交，结果不产菌株杂交，结果不产生原养型重组菌落！生原养型重组菌落！两个菌株在杂交过程中的作用不是相互的。

18、两个菌株在杂交过程中的作用不是相互的。（4）Hayes对意外的对意外的A菌株的菌株的“修理修理”strain A（strs）冰箱保存一年冰箱保存一年strain B（strs）不产生原养型菌落不产生原养型菌落?？strain A（strs）冰箱保存一年冰箱保存一年strain A（strr）诱变、筛选诱变、筛选strain A（strs）strain A（strr）Hayes的结论：的结论：strain A（strs）在冰箱中放置了一年，在冰箱中放置了一年，从从“雄性雄性”变变成了成了“雌性雌性”。不久，不久，Lederberg和妻子也发现了这种现象。和妻子也发现了这种现象。strain B（

19、strs）strain A（strr） 产生原养型菌落产生原养型菌落（5） Hayes等对等对“雄性雄性”细细菌和菌和“雌性雌性”细细菌的菌的解解释释（1）供体（）供体（donor）菌株：（）菌株：（fertility）（2）受体（）受体（recipient）菌株：）菌株：“雄性雄性”是由于细胞内含有一种致育因是由于细胞内含有一种致育因子（子（fertility factor）。表示为）。表示为F +。“雌性雌性”菌株缺乏菌株缺乏F因子。表示为因子。表示为F -。从逻辑上预言了从逻辑上预言了F因子（因子（F factor）的）的存在。存在。6. F因子的因子的实质实质(04D,3,31)是一种

20、质粒（是一种质粒（plasmid）。）。（1）质粒（）质粒（plasmid）存在于细菌染色体以外的存在于细菌染色体以外的DNA。对细菌的。对细菌的生存并非必须，但能给细菌带来一些额外生存并非必须，但能给细菌带来一些额外的功能（如抗菌素抗性等）。的功能（如抗菌素抗性等）。（2）F factor共价闭合环状共价闭合环状DNA，全长，全长94.5kb。F factor的几个特点的几个特点有有4个插入序列（个插入序列（insertion sequence，IS）。）。功能：功能：通过和宿主染色体上的通过和宿主染色体上的IS同源序列重组（或同源序列重组（或转座）使转座）使F因子整合到宿主染色体上。因子整

21、合到宿主染色体上。宿主染色体上的宿主染色体上的IS方向不同，使方向不同，使F因因子整合的方向随之不同。子整合的方向随之不同。IS1IS3IS2（3 3）F F因子的组成因子的组成 重组区重组区 自主复制区自主复制区有转移起点和两个复制起点。有转移起点和两个复制起点。oriTincoriV功能：功能：oriT是染色体转移时进行滚环复制的起是染色体转移时进行滚环复制的起点，点，oriV是独立复制的起点。是独立复制的起点。 转移区转移区包含约包含约40个基因，合成个基因，合成F纤毛（性伞纤毛（性伞毛）的操纵子。毛）的操纵子。GHFCBELAY7. F因因子传递子传递1957年拍到了第年拍到了第一张细

22、菌接合照一张细菌接合照片。片。但当时对但当时对F因子因子并不太了解。并不太了解。8. 高频重组菌株（高频重组菌株（Hfr）1950年年Luca Cavalli-Sforza用氮芥（用氮芥（nitrogen mustard）处理）处理A菌株，从存活下来的菌中分离菌株，从存活下来的菌中分离到一株能与到一株能与B菌株以菌株以10-4频率杂交的菌株，称之频率杂交的菌株，称之为为Hfr（high frequency recombination）。）。是一种是一种F+。F+ F-F+Hfr F-F-低频率重组低频率重组,10-7高频率重组高频率重组,10-49. 高频重组与高频重组与F因子的关系因子的关系

23、（1）Hfr与与F factor的异同处：的异同处： 都能与都能与F F-杂交杂交 杂交时都要通过接合的形式杂交时都要通过接合的形式 高剂量的链霉素处理不影响杂交高剂量的链霉素处理不影响杂交 产生的重组菌落的频率不同产生的重组菌落的频率不同 F+ F-的后代是的后代是F+ ； Hfr F-的后代是的后代是F- F+经丫啶橙处理变成经丫啶橙处理变成F-；而；而Hfr经丫经丫啶橙处理仍为啶橙处理仍为Hfr，能与能与 F-杂交杂交相相同同点点不不同同点点（2）Hfr的形成的形成F因子整因子整合到染色合到染色体上。体上。（3）Hfr的传递的传递（4）Hfr重组频率高于重组频率高于F因子的原因因子的原因

24、 HfrHfr接合后染色体基因进入受体菌，接合后染色体基因进入受体菌，但一般在但一般在F F（整合的）进入受体前，结合（整合的）进入受体前，结合管就断裂了。结果是管就断裂了。结果是F F-。 HfrHfr接合后染色体基因进入受体菌，接合后染色体基因进入受体菌，重组重组（能筛选的标记）的概率是（能筛选的标记）的概率是1010-4-4。 独立的独立的F F因子的菌株因子的菌株整合整合进入染色体进入染色体成为成为HfrHfr的概率是的概率是1010-3-3。 F F只有先只有先整合整合到染色体上形成到染色体上形成HfrHfr（1010-3-3），），HfrHfr才能将染色体基因送才能将染色体基因送入

25、受体入受体重组重组（1010-4-4）。所以通过）。所以通过F F因子被因子被检测到检测到重组重组（1010-7-7）。）。AAHfrF+F-10-310-4使使F-变成变成F+F+F-使使F-变成变成F+F+传递传递A基因的频率基因的频率10-710-7AAAHfrF-10-4A基因转入的基因转入的频率频率10-4AHfr传递传递A基因基因第四节第四节 中断杂交与重组作图中断杂交与重组作图一、中断杂交实验原理一、中断杂交实验原理 基因从基因从Hfr 细胞按次序转入细胞按次序转入F-细胞，可根据基因进入细胞，可根据基因进入F-细胞的时间和次序制作基因图谱。细胞的时间和次序制作基因图谱。 Wol

26、lman和和Jacob于于1954年在大肠杆菌中曾进行了以下杂交实验：年在大肠杆菌中曾进行了以下杂交实验： Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strs F-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把把接合中的细菌在不同时间取样，并把样接合中的细菌在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析受品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析受体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中用来体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中用来测定基因位置的一种方法。测定基因位置的一种方法。Wollman 和 Jacob想了解Hfr品系在杂交时，什么时候把基因转移给F细菌，他们把两

27、个品系进行杂交 问题问题1： 如何确定基因转移的顺序和时间? 混合培养液进行通气培养，每隔一定时间取样，把菌液放入搅拌器内搅动以打断配对的接合管，使接合的细胞分开以中断杂交然后检查某一基因是否发生重组。 问题问题2：如何检出某一基因的重组子? 把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌都能生长。影响检别，我们只需要把发生重组的重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重组子，如在基本培养基中培养选择thr + leu+重组子。这时thr+leu+为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己

28、不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。 因此，把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型必定是thr+leu+strr。因为只有这种重组子才能生长。并说明供体thr+和leu+已进入受体并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基因thr+和leu+为选择标记，而始终不被选择的strs为反选择标记基因，而那些还没有进行选择检定的基因为非选择标记。 问题问题3：在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因。 对每一时刻的重组thr+leu+strr的菌落影印培养接种到不同的培养基上（如乳糖lac+ 伊红红，gal

29、+ 美兰红色）。记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间，得右图（Hfr的非选择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非选择标记在各个时间出现的频率作图）。从图中可以看到，从Hfr菌株的基因在F-细菌中出现的开始，随着时间的增加，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一频率为止。而且某一基因出现的时间愈早，它达到的频率愈高。解释解释 ： 因为基因在染色体上，从染色体的一端开始，以线性方式按一定的时间顺序依次进入F-细胞，始端称为原点（origin）或0。显然，基因离开原点越远，进入F-细胞越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前，仍未转移，因而频率较低，达到的最高值也较小。

30、 根据以上实验，如果以转移的时间单位（每分钟）作为基因间的距离单位，就可以作出Hfr染色体上的基因分布图。 如果杂交持续2小时，然后中断交配，就会发现一些细胞转变为Hfr。这说明致育因子是最后转移到受体，是染色体的最后单位。所以频率很低。 二、中断杂交法作图二、中断杂交法作图（06A 2/4）1961年，年，Ellie Wollman和和Francois Jacob又又建立了另一种绘制建立了另一种绘制E.coli遗传图的方法：遗传图的方法：1. 中断杂交（中断杂交（interrupted mating technique)Hfr与与F - 杂交，在混合后的不同时间进行杂交，在混合后的不同时间进

31、行搅拌，使接合管断裂，终止染色体向搅拌，使接合管断裂，终止染色体向F- 细细胞移动。胞移动。2. 作图原理作图原理越是排在前面的基因进入越是排在前面的基因进入F - 的机会越多，的机会越多，重组率也越大。在不同的时间中断重组率也越大。在不同的时间中断3. 实验结果实验结果杂交，根据不同基因的重组率就能推断出杂交，根据不同基因的重组率就能推断出基因的顺序。基因的顺序。Hfr H strs thr+ leu+ azis tonr lac+ gal+ strr thr- leu- azir tons lac- gal- F-(2)选择标记：选择标记：strs thr+ leu+ (1)菌株菌株(3)

32、其他基因出现时间：其他基因出现时间：中断杂交不同取样时间非标记基因的重组率中断杂交不同取样时间非标记基因的重组率取样时间取样时间（min）各非选择标记基因的重组频率各非选择标记基因的重组频率thr+/leu+azistonslac+gal+50000010100123001510070310020100887112204010090753820azir （10分钟）；分钟）；tonr （15分钟）；分钟）；lac+ （20分钟）；分钟）；gal+ （25分钟）分钟）4. 基因排列顺序图基因排列顺序图0510152025起点起点thr/leuazi tonlacgal（min）5. E.coli

33、的染色体是环状的的染色体是环状的Wollman和和Jacob用用4个不同的个不同的Hfr菌株同菌株同F - 进行中断杂交，得到的基因排列顺序进行中断杂交，得到的基因排列顺序相同，但是进入的时间早晚（重组率）相同，但是进入的时间早晚（重组率）不同。不同。（1 1）不同的）不同的HfrHfr菌株中断杂交的结果菌株中断杂交的结果（2 2）解释）解释i）Hfr染色体上染色体上F因子的整合位点不同，因子的整合位点不同，整合方向也不同。整合方向也不同。ii）传递的起始点不同。）传递的起始点不同。iii）E.coli的染色体是环状的。的染色体是环状的。（3）E.coli染色体染色体图（以分钟为单位）图（以分

34、钟为单位）1963年，年，中断杂交中断杂交法绘制法绘制map units in minutes四、四、 细菌的重组频率和遗传作图细菌的重组频率和遗传作图（一）、传递等级绘图（一）、传递等级绘图1956年年Wollman、Jacob和和Hayes用用E.coli K12的的Hfr进行了重组试验。进行了重组试验。1. 亲本菌株亲本菌株Hfr H：thr+ leu+ azis lac+ gal+ ()- strs mal+ mtl+thr- leu- azir lac- gal- ()+ strr mal- mtl-F-（1） thr+ leu+ strr thr+ leu+ azis lac+ g

35、al+ ()- strs mal+ mtl+thr- leu- azir lac- gal- ()+ strr mal- mtl-（2） gal+ strr 双交换双交换thr+ leu+ azis lac+ gal+ ()- strs mal+ mtl+thr- leu- azir lac- gal- ()+ strr mal- mtl-双交换双交换2. 选择标记选择标记3. 实验过程实验过程HfrF-str选择培养基选择培养基（1）第一次选择培养基：）第一次选择培养基：（1）加入）加入str，但不加，但不加Thr和和Leu；（2）加入）加入str，但不加，但不加Gal；混合混合能在选择培养

36、基上生长的菌株一定是能在选择培养基上生长的菌株一定是thr+ leu+ strr 或或 gal+ strr 第一次选择得到的重组菌再进行第一次选择得到的重组菌再进行Lac等其他标记的选择。等其他标记的选择。如：能在不加如：能在不加lac的培养基中生长的一定的培养基中生长的一定是是thr+ leu+ strr lac+ 或者或者 gal+ strr lac+ （3）计算第二次选择标记的出现频率）计算第二次选择标记的出现频率（2）二次选择：）二次选择：第二次的菌落数第二次的菌落数第一次的菌落数第一次的菌落数100%4. 实验结果实验结果thr+ leu+ strr lac+ Lac的重组率的重组率

37、:thr+ leu+ strr 100%= 49%选择选择标记标记二次选择标记二次选择标记thr+/leu+azistonslac+gal+()mal+xyl+mtl+thr+ leu+ strr 9273493115000gal+ strr 7575747484000xyl：木桐糖：木桐糖mtl：甘露醇糖：甘露醇糖5. 推理作图推理作图实验结果表明：实验结果表明：第二次选择的标记的出现频率显示了第二次选择的标记的出现频率显示了不同的等级不同的等级: 离第一次选择标记越近离第一次选择标记越近的，出现的频率越高。的，出现的频率越高。可以利用第二次选择标记出现的频率来代可以利用第二次选择标记出现的

38、频率来代表它与第一次选择标记基因的距离进行遗表它与第一次选择标记基因的距离进行遗传作图。传作图。重组的特点: 1、形成部分二倍体部分二倍体（partial diploid）或部部分合子分合子（merozygote） 2、只有偶数次交换才能产生平衡的重组子。 3、相反的重组子不会出现。图示：图示：(1)单交换产生不平衡的线性染色体。 (2)双交换产生有活性的重组子和片段，片段以后在细胞分裂中失去，所以重组子不会出现。在中断杂交中，根据基因转移的先后次序，以时间为单位求出各基因间的距离，叫做时间作图法时间作图法。如果基因间转移的时间在两分钟以内，用这种方法求得的基因间距离就不很精确可靠，重组作图是

39、根据基因间重组率进行定位的。接合重组作图的特点：（与减数分裂生物的区别） (1)不用亲本类型 (i)无法区分，(ii)不重组将丢失。 (2)两对基因间的交换频率，必须在形成部分二倍体的条件下，计算重组率。 (3)部分二倍体如果不发生重组，无法鉴别。只有最后一个基因进入受体细胞，长并发生重组才能鉴别，即最后一个基因发生重组的条件下，计算两基因的重组率。 (4)接合重组不产生相反的重组类型。 例如根据中断杂交试验知 lac 和 ade 基因是紧密连锁的而且 lac 比 ade 先进入受体。试验试验 ：Hfr lac+ade+strs F-lae-ade-strr 混合60分，链霉素基本培养基。未杂

40、交的被杀死。选出来的都是ade+strr。因为ade+是在lac+之后进入F，所以，lac自然进入，形成了部分二倍体。在ade后部发生了交换，但另一交换位置需进一步鉴别。 将重组子菌落影印培养在EMB（曙红+美蓝）培养基上，如果是紫红色，说明重组子含有lac+ade+，另一交换发生在lac前端，如果粉红色，说明交换发 生在lac和ade之间，为lac-ade+重组子。lac+ade不会产生。 用时间单位法lac-ade的图距是一分钟，所以时间单位和重组值的关系大致是1分钟 = 20%的重组值 第五节第五节 F因子与性导因子与性导一一 F因子与因子与F菌株菌株 Hfr F+因子的时候，因子的时候

41、，F因子偶尔可能获得细菌染色因子偶尔可能获得细菌染色体的一部分体的一部分,而保留着对遗传地点的而保留着对遗传地点的“记忆记忆”。这种。这种带有部分细菌染色体的带有部分细菌染色体的F因子称因子称F因子。当因子。当F因子因子再整合到细菌染色体时，它就只能在原来的地点配再整合到细菌染色体时，它就只能在原来的地点配对、交换而插入其中，而不能象对、交换而插入其中，而不能象F因子那样可以在任因子那样可以在任何位点整合。何位点整合。 F菌株菌株：指带有指带有F因子的细菌。因子的细菌。二、性导 F因子转入受体细胞后，由于引入体细胞的部分基因，从而形成部分二倍体，这种利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二

42、倍体的过程叫性导（sexduction或Fduction ） 第六节第六节 转化与转导作图转化与转导作图一、转化一、转化(transformation) (一一)、细菌转化实验、细菌转化实验 (二二)、转化过程、转化过程 *(三三)、共同转化与遗传图谱绘制、共同转化与遗传图谱绘制一、细菌转化实验一、细菌转化实验1. 基础知识基础知识野生型肺炎双球菌野生型肺炎双球菌(Strep-tococcus pneumoniae)菌落为光滑菌落为光滑型，一种突变型为粗糙型，一种突变型为粗糙型，两者根本差异在于型，两者根本差异在于荚膜形成；荚膜形成；荚膜的主要成分是多糖，荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性；

43、具特殊的抗原性；不同抗原型是遗传的、不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不稳定的，一般情况下不发生互变。发生互变。荚膜荚膜 菌落菌落 毒性毒性类型类型光滑型光滑型S 发达发达 光滑光滑有有I, II, III粗糙型粗糙型R无无粗糙粗糙无无I, II2. Griffith转化研究转化研究(1928)Griffith对其试验结论及发展对其试验结论及发展 根据上述研究结果根据上述研究结果Griffith认为：认为：(有毒有毒)死细菌中的某种物质转移到死细菌中的某种物质转移到(无毒无毒)活细菌中，并使之具有毒性，导致小家活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡。鼠死亡。他将这种细菌遗传类型的转变称为

44、转化，他将这种细菌遗传类型的转变称为转化，并将引起转化的物质称为转化因子并将引起转化的物质称为转化因子(tranforming principle)。但是当时的化学与生化分析技术还无法但是当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌中的成分，因而不知转化鉴定杀死细菌中的成分，因而不知转化因子为何物。因子为何物。以后一些研究者重复上述试验，并且加以后一些研究者重复上述试验，并且加入了体外培养试验，即：将加热杀死的入了体外培养试验，即：将加热杀死的SIII细菌与无毒细菌与无毒RII细菌混合培养，然细菌混合培养，然后注入小家鼠体内，同样导致家鼠死亡。后注入小家鼠体内，同样导致家鼠死亡。表明：表明：细菌

45、在培养条件下也能够实现遗传类细菌在培养条件下也能够实现遗传类型间的定向转化。型间的定向转化。3. 阿维利阿维利(Avery)等的转化实验等的转化实验(1944)实验结论实验结论上述实验结果表明：来源于加热杀死的上述实验结果表明：来源于加热杀死的SIII细菌，并使细菌，并使 RII细菌转化成为细菌转化成为SIII型细菌的型细菌的转化因子是转化因子是DNA。正是在这一认识的基础上，将正是在这一认识的基础上，将转化定义为转化定义为：某某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的因型的DNA而使它的基因型和表现型发生相而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象

46、。应变化的现象。Avery等人的实验实际上也表明：决定等人的实验实际上也表明：决定细菌遗传类型的物质是细菌遗传类型的物质是DNA，即证明了即证明了DNA就是遗传物质。就是遗传物质。但由于他们采用的实验方法当时不被但由于他们采用的实验方法当时不被人们广泛接受，而且得出的结论与当人们广泛接受，而且得出的结论与当时人们的传统观念时人们的传统观念(认为蛋白质是遗传认为蛋白质是遗传物质物质)不符合，而长期没有得到人们的不符合，而长期没有得到人们的承认。承认。(二二)、转化过程、转化过程 转化现象在细菌中是一种普遍现象。不转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们同细菌转化过程有

47、一定差异，但是它们都存在几个共同特征，即：都存在几个共同特征，即：1. 感受态与感受态因子：感受态与感受态因子：感受态感受态指细菌能够从周围环境中吸收指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。分子进行转化的生理状态。感受态主要受一类蛋白质感受态主要受一类蛋白质(感受态因子感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌间进行影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。态细菌中，可以使后者变为感受态。一般认为感受态出现在细菌对数生长一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或后期，并且某些

48、处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用加强感受态，以大肠杆菌为例，用Ca2+(如如CaCl2)处理对数生长后期的大处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。肠杆菌可以增强其感受能力。2.供体供体(donor)DNA与受体与受体(receptor)细胞结合细胞结合(binding)：结合发生在受体细胞特定部位结合发生在受体细胞特定部位(结合点结合点)；对供体对供体DNA片段有一定要求片段有一定要求(20000个核苷酸对）个核苷酸对）；结合过程是一个可逆过程。结合过程是一个可逆过程。3.DNA摄取：摄取：当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源DN

49、A；往往只有一条往往只有一条DNA单链进入细胞单链进入细胞(单链摄入单链摄入)，另一条链在膜上降解。另一条链在膜上降解。4.联会联会(synapsis)与外源与外源DNA片段整合片段整合(integration)：整合就是指单链的转化整合就是指单链的转化DNA与受体与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地掺对应位点的置换，从而稳定地掺入到受体入到受体DNA中的过程。中的过程。实际上就是一个遗传重组的过程。因实际上就是一个遗传重组的过程。因而研究整合的分子机制事实上也为遗而研究整合的分子机制事实上也为遗传重组的分子机制作出了贡献。传重组的分子机制作出了贡献。具体过程包括几个连续的阶段： (1)双链

50、DMA分子和细胞表面受体部位进行可逆性结合。 (2)供体DNA片断被吸入受体细胞，并要防止受体DNA酶的破坏。 (3)供体DNA进入受体后，立即从双链DNA转变成单链DNA，其中一条单链被降解。 (4)未被降解的一条单链DNA部分地或整个地插入受体细胞的DNA链中，形成杂合的DNA分子。 (5)这种杂合DNA复制，分离以后，形成一个受体亲代类型的DNA和一个供体与受体DNA结合的杂种双链DNA。从而导致基因重组，形成各种类型的转化子（transformant）。图示：转化中单链外基因组片与双链内基因驵间整合过程。 (6)供体单链与受体DNA之间结合形成一段异源双链区。转化过程的最后结果取决于误

51、配核苷酸对的修复校正。如切除供体单链，则无重组发生。如切除受体单链则产生重组体，如果无校正作用发生，则该细菌经DNA复制和细胞的分裂产生一个有受体基因型的细胞，一个具有重组体基因型的细胞。 从一个供体菌株分离出来的DNA与另一受体菌株活细胞接触，大约只有1%的受体细菌细胞可吸收外源DNA，并发生遗传性的转化。转化频率低的原因可能是： (1)只是在特定区域形成临时性通道受体部位。数目有限。 (2)还必须有酶，或蛋白质分子以及能量等的协同作用。能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞称为感受态细胞；而促进转化作用的酶或蛋白质分子称为感受态因子。 *(三三)、共同转化与遗传图谱绘制、共同转化与遗传图谱

52、绘制利用利用共同转化共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：基本原理：相邻基因发生共同转化的概率与两者的相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。发生共同转化的频率越高，反之越低。因此可以通过测定两基因共同转化的频因此可以通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。率来指示基因间的相对距离。(P158)（1）连锁关系的确定 观察DNA浓度降低时的转化频率的改变。因为在较低的浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成正比关系。 如果A和B是连锁的，那么当DNA浓度下降时，AB

53、同时转化频率下降和A或B转化频率下降程度相同；如果A和B并不连锁，那么AB转化频率下降将远远超过A或B转化频率下降的程度。（2）Nester等用枯草杆菌的一个菌株作为供体trp2+， his2+,try1+，提取其DNA向受体trp2,his2,try1，菌株进行转化，结果如表65。转化基因间重组值的计算转化基因间重组值的计算 转化子数转化子数( (重组体数重组体数) ) 亲组合数亲组合数+ +转化子数转化子数例例: :供体供体 trptrp2 2+ his+ his2 2+ tyr+ tyr1 1+ + trptrp2 2- his- his2 2- tyr- tyr1 1- - P158

54、P158 表表6-56-5的重组值的重组值 trptrp2 2hishis2 2的重组值的重组值=34%=34% trp trp2 2tyrtyr1 1的重组值的重组值=40%=40% his his2 2tyrtyr1 1的重组值的重组值=13%=13% 根据重组值作图：根据重组值作图： trptrp2 2 3434 his his2 2 13 tyr 13 tyr1 1重组值重组值= = = = (+ -)+(- +)(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +) 二二 转导与作与作图一）、转导的发现一）、转导的发现1952年，年，J. Lede

55、rberg和他的学生和他的学生N.Zinder在鼠在鼠伤寒沙门氏菌（伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium）中作）中作的重组实验：的重组实验：1. 菌株菌株Strain LA-2：phe+ trp+ met - his-Strain LA-22：phe- trp- met + his+2. 杂交交结果果Strain LA-2：Strain LA-22：10-5 Prototrophsphe+ trp+ met + his+3. Davis U-tube实验实验将两个亲本分别放在将两个亲本分别放在U形管两臂中，结形管两臂中，结果同样能获得原养型重组菌！而且只在果同样能获得原养

56、型重组菌！而且只在LA-22中！中！高频？高频？4. 解解释一种可以通过细菌虑片的因子把遗传信息一种可以通过细菌虑片的因子把遗传信息从从LA-2传给了传给了LA-22。他们称之为他们称之为FA（filterable agent）5. What is the FA?（1）进一步实验的观察）进一步实验的观察 LA-2产生产生FA时要求时要求LA-22的存在。的存在。LA-2单独培养单独培养培养基培养基LA-22不能重组不能重组过滤过滤（2）推）推论 FA不是裸露的不是裸露的DNA加入加入DNase并不能减弱并不能减弱FA的效力。（排的效力。（排除了转化）除了转化） FA不能穿过噬菌体虑片。不能穿过

57、噬菌体虑片。 鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌LA-22中有温和噬中有温和噬菌体菌体P22LA-22中的原噬菌体中的原噬菌体P22偶然裂解，穿过偶然裂解，穿过滤片后感染并裂解滤片后感染并裂解LA-2，包装了，包装了LA-2的的基因，返回滤片感染基因，返回滤片感染LA-22并溶源化。给并溶源化。给LA-22带入带入phe+ trp+ 。形成原养型。形成原养型。穿过滤片穿过滤片原养型原养型LA-22 (+ P22)P22偶然偶然 溶菌溶菌P22感染感染LA-22LA-22 重组重组感染感染LA-2偶然包装偶然包装LA-2基因基因P22P22定义：定义：以温和以温和噬菌体噬菌体为媒介，将供体媒介，将供体

58、细胞的胞的DNA片段携片段携带到受体到受体细胞中，通胞中，通过交交换与整合，从而使后者与整合，从而使后者获得前者部分得前者部分遗传性状的性状的现象，称象，称为转导。 获得新得新遗传性状的受体性状的受体细胞，称胞，称转导子子。2.转导的种类转导的种类 完全普遍转导完全普遍转导 普遍转导普遍转导 流产普遍转导流产普遍转导 转导转导 低频转导低频转导 局限转导局限转导 高频转导高频转导过程：过程：供体菌供体菌 正常噬菌体正常噬菌体 + + 完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体 少量裂解物少量裂解物 + + 大量受体菌大量受体菌 遗传稳定的转导子遗传稳定的转导子（1） 普遍性转导（普遍性转导（generali

59、zed transduction）定定义义：通通过过完完全全缺缺陷陷噬噬菌菌体体对对供供体体菌菌任任何何DNADNA小小片片段段的的“误误包包”而而实实现现其其遗遗传传性性状状传传递递至至受受体体菌菌的的转转导导现现象，称为象，称为普遍性转导普遍性转导。1.11.1完全完全( (普遍性普遍性) )转导：转导：complete transductioncomplete transduction。19521952年年发发现现，在在Salmonella Salmonella typhimuriumtyphimurium中中存存在在转转导现象。在它的完全普遍性转导实验中：导现象。在它的完全普遍性转导实

60、验中：v以其野生型菌株作为供体菌以其野生型菌株作为供体菌v营养缺陷型菌株作为受体菌营养缺陷型菌株作为受体菌vP22P22噬噬菌菌体体作作为为转转导导媒媒介介，对对供供体体菌菌是是烈烈性性噬噬菌菌体体，对对受受体体菌是温和噬菌体菌是温和噬菌体裂解裂解完全普遍转导完全普遍转导（1） 普遍性转导（普遍性转导（generalized transduction）过程：过程：vP22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（体成熟与包装之际，极少数（10 6 10 8）噬菌体的）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体衣壳

61、将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺的缺陷噬菌体。陷噬菌体。v供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其使其感染复数（感染复数（m.o.i）1，这种完全缺陷噬菌体就会将这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源这一外源DNA片段导入受体细胞内。片段导入受体细胞内。v在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其噬菌体，故受体细胞不会发生往

62、常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个者成为一个遗传性状稳定的转导子。遗传性状稳定的转导子。感染复数（感染复数（m.o.i，multiplicity of infection）:感感染染复复数数由由于于每每一一宿宿主主细细胞胞表表面面的的特特异异性性受受体体有有限限，因因此此所所能能吸吸附附的的噬噬菌菌体体数数

63、目目也也有有一一个个限限量量。每每一一敏敏感感细细胞胞所所能能吸吸附附的的噬噬菌菌体体的的数数量量,m.o.i一一般般很大，可达很大，可达250360。由由于于超超m.o.i的的外外源源噬噬菌菌体体吸吸附附而而引引起起的的、不不能能产产生生子子代代噬噬菌菌体体的的裂裂解解，称称为为自自外外裂裂解解（lysis from without）。噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1 1）包入的完全是噬菌体的）包入的完全是噬菌体的DNADNA（正常噬菌体正常噬菌体）2 2）包入的完全是细菌）包入的完全是细菌DNADNA（完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体）3 3）部分

64、带有噬菌体基因的）部分带有噬菌体基因的DNADNA（部分缺陷噬菌部分缺陷噬菌体体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。噬菌体裂解第一个宿主噬菌体裂解第一个宿主普遍性转导过程普遍性转导过程一个稳定的转导子的形成一个稳定的转导子的形成1.第一次交换2.第二次交换3.交换完成，外源DNA掺入染色体组中1.2流产普遍性转导（流产普遍性转导（abortive transduction）概念：概念：受体菌经转导获得的供体受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和

65、转译（性状表达），这种现象就称为是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导流产转导。现象：现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物细胞仅获得供体基因的产物酶，在表型上表现酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，次稀释，所以，能在选择性所以，能在选择性培养基平板上形成培养基平板上形成微小菌落就是流产微小菌落就是流产转导的特点。转导的特点。2. 局限性转导局限性转导定

66、义定义：通过：通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特点特点：v噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体v只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）点两侧的基因）v该特定基因由该特定基因由部分缺陷的噬菌体部分缺陷的噬菌体携带携带v缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约10 5）“误切误切”，或由于，或由于双重溶源菌

67、双重溶源菌的裂解而形成的裂解而形成（约形成（约形成50%缺陷噬菌体）缺陷噬菌体）分类分类：低频转导与高频转导：低频转导与高频转导转导的过程转导的过程该该溶溶源源菌菌被被诱诱导导裂裂解解时时，有有极极少少数数（ 10 5） 的的 前前 噬噬 菌菌 体体（prophage）发发生生不不正正常常切切离离（abnormal excesion），其其结结果果会会将将插插入入位位点点两两侧侧之之一一的的少少数数宿宿主主基基因因（如如E.coli 前前噬噬菌菌体体的的两两侧侧分分别别为为发发酵酵半半乳乳糖糖的的gal基基因因或或合合成成生生物物素素的的bio基基因因）连连接接到到噬噬菌菌体体DNA上上（而而

68、噬噬菌菌体体也也将将相相应应的的一一段段DNA遗遗留留在在宿宿主主的的染染色色体体组组上上），通通过过衣衣壳壳的的“误误包包”，就就形形成成了了一一种种特特殊殊的的噬噬菌菌体体缺缺陷陷噬噬菌菌体体（defective phage）。它它们们没没有有将将宿宿主主溶溶源源化化的的能能力力，而而是是使使宿宿主主成成为为一一个个局局限限转转导导子子，对对 噬噬菌菌体体没没有免疫性。有免疫性。温温和和噬噬菌菌体体感感染染受受体体菌菌后后，其其DNA会会开开环环，以以线线状状形形式式整整合合到到宿宿主主染染色色体体的的特特定定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。位点上，从而使

69、宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。特异性转导过程特异性转导过程噬菌体在大噬菌体在大肠肠杆菌中的插入位点杆菌中的插入位点att（attachment site）称）称为为attB或或att ，位于，位于gal与与bio基因之基因之间间。插入插入正常环出正常环出异常环出异常环出溶源性转导溶源性转导重组性转导重组性转导v一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（噬菌体的比例是极低的（10 4 10 6）。把这）。把这种裂解物称为

70、种裂解物称为LFT（低频转导）裂解物低频转导）裂解物 。v用用LFT裂解物以裂解物以低低 m. o. i（感染复数）感染复数）感染宿主，感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。2.1低频转导（低频转导（LFT，low frequency transduction）E.coli K12 ( )gal+(供体菌供体菌) (大量大量) + dgal+（10-5）E.coliK12Sgal-(受体菌受体菌) E.coliK12Sgal-/ dgal+E.coliK12Sgal-/ dgal+/ E.coliK12Sgal-/ dgal+/ （双重容源菌供

71、体）双重容源菌供体） (50%) + dgal+（50%）E.coliK12Sgal-(受体菌受体菌) E.coliK12Sgal-/ dgal+（转导子）转导子） （双重容源（双重容源转导子）转导子）高频转导和低频转导图解高频转导和低频转导图解低频转导低频转导高频转导高频转导U.V.U.V.双重容源菌双重容源菌【E.coliK12( / dg)】转导噬菌体（转导噬菌体（ dg） + 辅助噬菌体（辅助噬菌体（ ）转导子菌落转导子菌落噬菌斑噬菌斑U.V.附附当当用用LFT裂裂解解物物以以高高m. o. i 感感染染E. coli gal（不不发发酵酵半半乳乳糖糖的的营营养养缺缺陷陷型型）菌菌株株

72、时时，凡凡是是感感染染有有dgal噬噬菌菌体体任任一一细细胞胞，几几乎乎都都同同时时感感染染有有正正常常的的 噬噬菌菌体体。这这时时 与与dgal同同时时整整合合在在一一个个受受体体菌菌的的核核染染色色体体组组上上，从从而而使使它它成成为为一一个个双双重重溶溶源源菌菌（double lysogen）。当当双双重重溶溶源源菌菌被被紫紫外外线线等等诱诱导导时时，其其中中的的正正正正常常常常 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的基基基基因因因因可可可可补补补补偿偿偿偿 dgaldgal缺缺缺缺失失失失的的的的部部部部分分分分基基基基因因因因功功功功能能能能，因因而而两两种种噬噬菌菌体体就就同同时时获获得

73、得复复制制的的机机会会。所所以以在在双双重重溶溶源源菌菌中中的的正正常常 噬噬菌菌体体被被称称为为助体（或辅助）噬菌体（助体（或辅助）噬菌体（helper phage）。双双重重溶溶源源菌菌的的裂裂解解物物中中含含有有等等量量的的 和和dgal粒粒子子，称称为为HFT（高频转导）裂解物。高频转导）裂解物。用用HFT裂裂解解物物以以低低 m. o. I 感感染染另另一一个个E. coli gal（不不发发酵酵半半乳乳糖糖的的营营养养缺缺陷陷型型）受受体体菌菌，就就可可以以高高频频率率地地把把它它转转化化为为能能发发酵酵半半乳乳糖糖的的E. coli gal+ 转转导导子子。是是为为高频转导高频转

74、导2.2 高频转导（高频转导（HFT，high frequency transduction）三、共转导与细菌作图三、共转导与细菌作图实验实验选择标记选择标记非选择标记共转导率非选择标记共转导率1leu+azir 50%； thr+ 20%2thr+leu+ 30%3thr+ leu+azir 0%thrleuazi共转导率大，基因之间的距离近。共转导率大，基因之间的距离近。实验实验1：leu离离azi近。近。thrleuazi或或实验实验2：thr离离leu近。近。 实验实验3：thr与与leu中间无中间无azi。五、普遍转导作图五、普遍转导作图一般借助一般借助2或或3个基因的共转导，分析重

75、个基因的共转导，分析重组菌（转导子）中存在或缺少那些供体组菌（转导子）中存在或缺少那些供体标记基因。计算标记基因。计算共转导率，推理作图。共转导率，推理作图。a+ b- c+供体：供体：a- b+ c-受体：受体：选择标记：选择标记：a+ ，共共1000个转导子个转导子转导子基因型转导子基因型菌落数菌落数转导子基因型转导子基因型菌落数菌落数b+ c+12b- c+501b+ c-243b- c-244例：例：（1）ab的共转导率的共转导率来自供体菌的来自供体菌的 b- 转导子：转导子：501+244=745所有的来自供体的所有的来自供体的a+转导子：转导子：12+243+501+244=100

76、0ab的共转导率的共转导率=7451000100%=74.5%（2）ac的共转导率的共转导率ac的共转导率的共转导率=12+5011000100%=51.3%（3）bc的共转导率：（的共转导率：（ a+ ）来自供体的来自供体的b- c+转导子：转导子：501bc的共转导率的共转导率=5011000100%=50.1%（4）三个基因之间的位置关系）三个基因之间的位置关系a+ b- 时多为时多为c-； a+ c+时多为时多为b- 。说明说明b在在ac之间之间。转导子基因型转导子基因型菌落数菌落数转导子基因型转导子基因型菌落数菌落数b+ c+12b- c+501b+ c-243b- c-244abc

77、abac= bc（5）基因位置推定）基因位置推定共转导率共转导率ac= bc说明：说明：当当ac都转导过去时，都转导过去时，b也同时过去了。也同时过去了。a是第一选择标记，选到的是第一选择标记，选到的bc转导子转导子同时也一定是同时也一定是a+） 作图作图比较项目比较项目普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导转导的基因转导的基因供体染色体或染色供体染色体或染色体外的任何基因体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生噬菌体寄生的位置的位置不结合在寄主染色不结合在寄主染色体特定位置上体特定位置上结合在寄主染色体特定位置结合在寄主染色体特定位置上上获得转导噬获得转导噬菌体的方法菌体的方法通过敏感菌的裂解通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌紫外线诱导容源菌转导子的区转导子的区别别一般稳定，非溶原一般稳定，非溶原性（不表现出任何性（不表现出任何噬菌体的性状，包噬菌体的性状，包括免疫性）括免疫性）一般不稳定，呈缺陷溶原性一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性但不表现出其它噬菌体的性状）状）普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较