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1、植物基因功能研究策略植物基因功能研究策略Strategy for Plant Gene Function 目录目录基因功能研究的内容基因功能研究的内容基因功能研究的意义基因功能研究的意义基因功能研究的现状基因功能研究的现状基因功能研究策略基因功能研究策略 正向遗传学策略正向遗传学策略 反向遗传学策略反向遗传学策略What is gene?In Genetics the basic unit of heredity that is transmitted from parents to offspring in reproduction, which determines inherited t
2、raits.In Molecular Biology - entire nucleic acid sequence necessary for the synthesis of a functional polypeptide (protein chain) or functional RNA现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列总称，是遗传物质的最小功能单位。What is Gene expression?基因功能研究的内容基因功能研究的内容基因功能研究内容功能基因鉴定基因表达规律基因产物生化功能基因表达的生理功能植物基因功能研究的目标植物基因功能研究的目标 确定和理
3、解决定植物生命活动的所有基因，从分子、生化和生理水平上揭示植物生命活动机理。这些知识最终将会提高人类驾驭植物生产的能力。植物基因功能研究的重要意义植物基因功能研究的重要意义提高利用常规方法培育新品种的能力；提高利用基因工程手段改良植物品种的能力；采取更有针对性的栽培生产措施，提高生产效率；更有效的利用植物资源生产人类所需要的产品；提高对珍稀植物的保护能力。植物基因功能研究的植物基因功能研究的现状现状在拟南芥、水稻基因组和其它作物已完成测定的序列中，只有部分基因进行了功能研究。多数只通过ESTs和OFR等进行了鉴定。许多基因在植物生长发育中的确切功能和作用还不清楚。基因测序的步伐远大于基因功能研
4、究的脚步，公共数据库的DNA序列每天都以数万核苷酸的速度增加。DNA序列的主要数据库序列的主要数据库http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ National Center for Biotechnology Information http:/www.maizegdb.org/ MaizeGDB is funded by a cooperative agreement through the USDA Agricultural Research Service.植物基因功能研究的现状植物基因功能研究的现状植物基因功能研究的植物基因功能研究的现状现状DNA序列的主要数据库序列的主
5、要数据库http:/www.yeastgenome.org/ SGDTM（ Saccharomyces Genome Database）is a scientific database of the molecular Saccharomyces biology and genetics of the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is commonly known as bakers or budding yeast. 植物基因功能研究的现状植物基因功能研究的现状植物基因功能研究策略植物基因功能研究策略正向遗传学策略正向遗传学策略 forward
6、 genetics strategyforward genetics strategy反向遗传学策略反向遗传学策略 reverse genetics strategyreverse genetics strategy正向遗传学正向遗传学策略策略forward genetics strategyforward genetics strategy表现型表现型 基因型基因型Phenotype Genotype正向遗传学正向遗传学策略策略诱变诱变 突变体筛选突变体筛选 克隆基因克隆基因 基因功能基因功能技技术术路路线线正向遗传学策略正向遗传学策略基因突变基因突变基因失活或基因失活或产物无功能产物无功能
7、recessive基因表达减弱基因表达减弱或产物活性或产物活性降低降低基因表达加强基因表达加强或产物具有或产物具有新功能新功能dominant基基因因突突变变类类型型正向遗传学策略正向遗传学策略诱变剂诱变剂 Mutagenesis化学诱变剂化学诱变剂 Chemical mutagens辐射辐射 RadiationTDNA和和 转座子插入转座子插入 TDNA or transposon insertion 诱诱 变变 基因突变的分子基础按突变发生的原因分类按突变发生的原因分类 自发突变自发突变(spontaneous mutation):(spontaneous mutation):在自然状况下
8、发在自然状况下发生的突变。生的突变。 诱发突变诱发突变(induced mutation):(induced mutation):有机体暴露在诱变剂有机体暴露在诱变剂中引起的突变。中引起的突变。一一. .自发突变的分子基础自发突变的分子基础 自发突变可能由自发突变可能由DNADNA复制错误复制错误, ,自发损伤和转座因子自发损伤和转座因子等多种原因引起等多种原因引起。( (一一)DNA)DNA复制中的错误复制中的错误 遗传物质是遗传物质是DNA,DNADNA,DNA复制是半保留复制复制是半保留复制, ,如果发生错如果发生错误误, ,引起碱基替换引起碱基替换(base substitution)
9、, (base substitution), 即一对碱基被即一对碱基被另一对碱基替换，造成另一对碱基替换，造成DNADNA遗传信息的改变。从而导致遗传信息的改变。从而导致基因突变基因突变。 正常情况下正常情况下,A-T配对配对,氨基态的腺嘌呤氨基态的腺嘌呤(A)只与胸腺嘧啶只与胸腺嘧啶(T)配对配对,但有时可转变成稀有的亚氨基形式但有时可转变成稀有的亚氨基形式,可以与胞嘧啶配对可以与胞嘧啶配对,形成形成A-C, 再再经一次复制经一次复制,DNA分子中的分子中的A-T对变成了对变成了G-C对对. 这种互变异构可以在这种互变异构可以在DNA复制中自发产生复制中自发产生。碱基替换可以分为转换和颠换碱
10、基替换可以分为转换和颠换: : 1. 1.转换转换(transitions):(transitions):嘌呤替代嘌呤嘌呤替代嘌呤, ,或嘧啶替或嘧啶替代嘧啶代嘧啶。 A AG G或或G GA , TA , TC C或或C CT T 2.2.颠换颠换(Tran versions):(Tran versions):嘌呤替代嘧啶嘌呤替代嘧啶, ,或嘧或嘧啶替代嘌呤啶替代嘌呤。 A AC, AC, AT , CT , CA, TA, TA A 3.3.移码突变移码突变（frame-shift mutationframe-shift mutation）: :在在DNADNA复制中发生增加或减少一个或几
11、个碱基对所造成的复制中发生增加或减少一个或几个碱基对所造成的突变。移码突变可造成蛋白质分子发生较大的结构突变。移码突变可造成蛋白质分子发生较大的结构改变改变。 ( (二二) ) 自发损伤自发损伤(spontaneous lesions) (spontaneous lesions) 即自然产生的即自然产生的DNADNA损伤引起突变损伤引起突变, ,如脱嘌呤和脱氨如脱嘌呤和脱氨基等。基等。 1.1.脱嘌呤脱嘌呤：最为常见，由于：最为常见，由于DNADNA分子中碱基和脱分子中碱基和脱氧核糖间的糖苷键受到破坏，从而引起一个鸟嘌呤氧核糖间的糖苷键受到破坏，从而引起一个鸟嘌呤(G)(G)或腺嘌呤或腺嘌呤(
12、a)(a)从从DNADNA分子上脱落下来。造成分子上脱落下来。造成DNADNA损伤，损伤，产生无嘌呤位点，在产生无嘌呤位点，在DNADNA复制中引入错误；或由修复复制中引入错误；或由修复系统移去无嘌呤位点或插入一个碱基而引起突变。系统移去无嘌呤位点或插入一个碱基而引起突变。 2.2.脱氨基脱氨基：胞嘧啶脱氨基变成：胞嘧啶脱氨基变成U,UU,U与与A A配对，结果配对，结果使使 G-CG-C对变成对变成 A-TA-T对（转换对（转换) )。 3.3.氧化性损伤氧化性损伤：个体自然产生的氧化基，氧化物：个体自然产生的氧化基，氧化物如超氧自由基如超氧自由基, ,氢氧自由基及过氧化基等，能对氢氧自由基
13、及过氧化基等，能对DNADNA造造成氧化性损伤，引起突变，导致人类疾病成氧化性损伤，引起突变，导致人类疾病。 烯醇式结构玉米中控制分枝的tb1基因是一个转录因子，该基因上游41kb作为顺式调控因子，调控tb1基因的表达，玉米中tb1的表达量是大刍草中的2倍，该基因表达上的变化造成玉米和大刍草形态上的巨大差异。Nature, 1997, 386: 485-488玉米中tga1基因控制颖壳的有无，该性状只有一个基因控制，由于tga1基因一个氨基酸的替换，造成玉米和大刍草如此巨大的表型差异。Nature, 2005, 436: 714-719水稻落粒基因在2006年的science上有两篇文章，一篇
14、是比较indica和野生稻sh4，是由于一个氨基酸的替换造成的，另一篇是日本人做的，比较indica和japonica的qSH1，此基因是由于调控区一个SNP引起的。 Science, 2006, 311: 1936-1939小麦的Q基因具有多效性，影响到脱粒、小穗长度，株高和抽穗等一系列性状。该基因也是一个转录因子。也是由于一个氨基酸的替换影响了同源二聚体的形成。Genetics, 2006, 172: 547-555小麦中的Gpc-B1基因，NAC类转录因子，在野生小麦中由于该基因的表达，籽粒蛋白含量、锌和铁含量较栽培小麦提高很大，而栽培小麦中，该基因由于一个碱基的插入造成移码突变而失活，
15、但却使持绿性增强。Science, 2006, 314: 1298-1301拟南芥中控制种子大小的AP2基因突变体中在第一个AP2结构域有一个11bp的缺失，造成null mutation，结果种子增大，细胞数增大，细胞体积增大。PNAS, 2005, 102: 3123-3128控制番茄果型大小的fw2.2是最早克隆的QTL，仅仅因为成熟晚期表达丰度的不同，造成野生型和栽培型果型大小的如此大的差别。Science, 2000, 289:85-88 二二 诱发突变的分子基础诱发突变的分子基础 各种诱变剂（物理或化学的）可诱发基因的突变。诱变剂可以取各种诱变剂（物理或化学的）可诱发基因的突变。诱
16、变剂可以取代碱基，改变碱基或破坏碱基，使代碱基，改变碱基或破坏碱基，使DNADNA发生错配，而引起基因突变。发生错配，而引起基因突变。( (一一) )碱基类似物：与碱基结构类似，可替代正常碱基掺入碱基类似物：与碱基结构类似，可替代正常碱基掺入DNADNA分子，分子，引起碱基替换。如引起碱基替换。如5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（BUBU）是胸腺嘧啶）是胸腺嘧啶T T的类似物，可掺的类似物，可掺入入DNADNA分子中。分子中。BUBU有两种互变异构体酮式和烯醇式。酮式与有两种互变异构体酮式和烯醇式。酮式与A A配对，配对，而烯醇式与而烯醇式与G G配对，这样很容易引起配对，这样很容易引起G-CG-C
17、对与对与A-TA-T对的互相转换。除对的互相转换。除BUBU外，外，5-5-溴脱氧尿苷（溴脱氧尿苷（BrdUBrdU），），5-5-尿嘧啶，尿嘧啶，5-5-氯尿嘧啶及其脱氧核氯尿嘧啶及其脱氧核苷。苷。2-2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP2-AP）等都是碱基类似物。）等都是碱基类似物。正向遗传学策略正向遗传学策略mispairingATABuGBuGCBumutation碱基类似物碱基类似物诱变机制诱变机制诱诱 变变 (二二)烷化剂：烷化剂：常用的烷化剂有硫酸二乙脂（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、异丙基甲烷磺酸酯（iPMS）、芥子气类。另外，亚硝基乙基脲烷（NEU）、
18、亚硝基乙基脲（NEH）、亚硝基甲基脲烷（NMU）、乙烯亚胺（EI）、1,4-双重氮乙酰丁烷，也是有效的诱变剂，但是有毒，应用危险，是潜在致癌物质( (三三) )嵌合剂：嵌合剂：吖啶类染料的分子为平面结构，大小与碱基对吖啶类染料的分子为平面结构，大小与碱基对 差不多，可差不多，可插入插入DNADNA双链核心堆积的碱基对之间，在嵌入的位置引起单双链核心堆积的碱基对之间，在嵌入的位置引起单 个碱基对的插入个碱基对的插入或缺失，造成移码突变。如口丫啶橙，溴化已啶（或缺失，造成移码突变。如口丫啶橙，溴化已啶（EBEB），原黄素和黄素等。），原黄素和黄素等。( (四四) )紫外线（紫外线（UVUV）: :
19、可使可使DNADNA产生很多光生成物，如环丁烷嘧啶二聚体。产生很多光生成物，如环丁烷嘧啶二聚体。( (五五) )电离辐射：电离辐射：使使DNADNA分子发生氢键断裂，分子发生氢键断裂，DNADNA单链或双链断裂，碱基或单链或双链断裂，碱基或糖基损伤，糖基损伤，DNADNA，蛋白质相互交联等。，蛋白质相互交联等。x x射线，射线，射线等，具有较高的能量可引射线等，具有较高的能量可引起原子的电离，导致起原子的电离，导致DNADNA的损伤，基因突变和染色体结构变异。的损伤，基因突变和染色体结构变异。( (六六) )黄曲霉素黄曲霉素B1(AFB1)B1(AFB1)：霉变的花生等食物中含有大量的霉变的花
20、生等食物中含有大量的AFB1 AFB1 ，AFB1AFB1是一种强致癌剂。可在是一种强致癌剂。可在G G的的N-TN-T位形成一个加成复合物即产生无嘌呤位点，位形成一个加成复合物即产生无嘌呤位点，使使GCGC颠换为颠换为T-AT-A，引起基因突变。可导致肝癌。，引起基因突变。可导致肝癌。 其它诱变剂：如亚硝酸、羟胺（NH2OH）、氮蒽、叠氮化钠（NaN3）等物质，均能引起染色体畸变和基因突变。尤其是叠氮化物在一定条件下可获得较高的突变频率，而且相当安全，无残毒。亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。 HNO2胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） HNO2腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H） HNO2鸟嘌呤（G） 黄
21、嘌呤（X） 这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。正向遗传学策略正向遗传学策略ATHTHCGCHNO2HNO2mispairingmutation化学诱变机制化学诱变机制诱诱 变变 基因突变对遗传信息的影响基因突变对遗传信息的影响( (一）碱基替换的影响：单个碱基替换如果发生在基因一）碱基替换的影响：单个碱基替换如果发生在基因编码区，则会改变一个密码子，可以引起蛋白质一级结编码区，则会改变一个密码子，可以引起蛋白质一级结构中某个氨基酸的变化。构中某个氨基酸的变化。 1 1 同义突变同义突变(samesense mutation) (samesense mutati
22、on) ：由于遗传密码：由于遗传密码具有简并性。所以有时碱基替换密码子改变但并不改变具有简并性。所以有时碱基替换密码子改变但并不改变氨基酸。如氨基酸。如GAUGACGAUGAC，但仍是天冬，但仍是天冬AAAA，无突变效应，密，无突变效应，密码子的简并性大大削弱了突变的危害性，是码子的简并性大大削弱了突变的危害性，是DNADNA的容错的容错机制。机制。 2 2 错义突变错义突变（missense mutationmissense mutation）：指碱基替换密）：指碱基替换密码子改变引起氨基酸的改变。错义突变使蛋白质一级结码子改变引起氨基酸的改变。错义突变使蛋白质一级结构改变，导致蛋白质活性和
23、功能不同程度的改变。一般构改变，导致蛋白质活性和功能不同程度的改变。一般性质相似的氨基酸替换对蛋白质的影响小，而性质不同性质相似的氨基酸替换对蛋白质的影响小，而性质不同的氨基酸的替换可能强烈的影响蛋白质的功能。的氨基酸的替换可能强烈的影响蛋白质的功能。 3 3 无义突变无义突变（nonsense mutation):nonsense mutation):碱基替换使编碱基替换使编 码氨码氨基酸的密码子突变为终止密码子，转录出的基酸的密码子突变为终止密码子，转录出的mRNAmRNA在翻译时在翻译时提前终止，形成的肽链不完全，一般没有活性。形成的终提前终止，形成的肽链不完全，一般没有活性。形成的终止
24、密码子为止密码子为UAGUAG、UAAUAA或或UGA UGA 。 4 4 通读通读（reading through):reading through):碱基替换使终止密码子突碱基替换使终止密码子突 变为编码氨基酸的密码子，转录出的变为编码氨基酸的密码子，转录出的mRNAmRNA在翻译时不能适在翻译时不能适时终止，直到另一终止密码子为止。时终止，直到另一终止密码子为止。 移码突变的影响：移码突变的影响：在在DNADNA分子的外显子中遗传信分子的外显子中遗传信 息息是按三联体密码子排列的，插入或缺失个或个或个是按三联体密码子排列的，插入或缺失个或个或个碱基会改变阅读框架，结果翻译出来的蛋白质的氨
25、基酸序碱基会改变阅读框架，结果翻译出来的蛋白质的氨基酸序列也完全改变，但如果插入或缺失个碱基，则在翻译出列也完全改变，但如果插入或缺失个碱基，则在翻译出的多肽链上只是多或少一个的多肽链上只是多或少一个AAAA，而不会完全打乱，而不会完全打乱AAAA序列。序列。 突变热点和增变基因：突变热点和增变基因：理论上，理论上，DNADNA任何位点都可以发生突变，但实际上任何位点都可以发生突变，但实际上DNADNA分分子上不同部位有着不同的突变率。子上不同部位有着不同的突变率。 1 1 突变热点突变热点：突变率大大高于平均突变率的位点。如：突变率大大高于平均突变率的位点。如甲基胞嘧啶（甲基胞嘧啶（MeCM
26、eC）的存在，）的存在，MeCMeC脱氨后生成脱氨后生成T T，不可被，不可被校正，而引起突变，校正，而引起突变，C C脱氨后变成脱氨后变成U U，容易被校正。另外，容易被校正。另外一些短的重复系列也易形成突变热点，易发生嵌入和缺一些短的重复系列也易形成突变热点，易发生嵌入和缺失，因失，因DNADNA复制前模板链与新生链之间的滑动造成。复制前模板链与新生链之间的滑动造成。 2 2 增变基因增变基因（mutator genemutator gene）：指某些基因突变后可使）：指某些基因突变后可使整个基因组中的突变率明显上升的基因。如整个基因组中的突变率明显上升的基因。如DNADNA聚合酶基聚合酶
27、基因突变，因突变，3 3校正功能降低或丧失，是基因突变率校正功能降低或丧失，是基因突变率升高。另如升高。另如damdam基因突变，则错配修复功能丧失，引起突基因突变，则错配修复功能丧失，引起突变率升高。变率升高。 射线诱变正向遗传学策略正向遗传学策略 在基因工程中，在基因工程中，T -DNAT -DNA中的基因被中的基因被除掉，保留两侧的重复序列，加入除掉，保留两侧的重复序列，加入欲转移的基因。在用欲转移的基因。在用 T- DNA T- DNA 诱导诱导突变时，不用加入其它基因。突变时，不用加入其它基因。Transposition and transposable elements(Ac/Ds
28、)T-DNA 插入突变插入突变诱诱 变变Ti plasmid130 bpT DNALBRB正向遗传学策略正向遗传学策略 TDNA诱诱 变变 vir genesTDNA 插入突变插入突变Insertional mutagenesis by T-DNAWhen and Where Mutations HappenIn eukaryotes, mutations that occur in the somatic cells (somatic mutations) are not inherited; mutations that occur any time in the germ line ar
29、e inherited. We usually measure the rate in mutations per gametesomatic mutationgerm line mutationGerm lineSoma突变体的筛选方法突变体的筛选方法 受细胞核内遗传物质控制的遗传现象，叫做受细胞核内遗传物质控制的遗传现象，叫做细胞核遗传（核遗传）。细胞核遗传（核遗传）。母本母本父本父本母本母本父本父本正交正交子代子代反交反交子代子代正向遗传学策略正向遗传学策略 受细胞质内遗传物质控制的遗传现象，受细胞质内遗传物质控制的遗传现象，叫做细胞质遗传。叫做细胞质遗传。母本母本父本父本母本母本父本父
30、本正交正交子代子代反交反交子代子代正向遗传学策略正向遗传学策略正向遗传学策略正向遗传学策略根据发生突变基因的性质，根据发生突变基因的性质，将众多突变体分成不同的突将众多突变体分成不同的突变系。称为突变体筛选。变系。称为突变体筛选。常用的筛选方法是互补检验常用的筛选方法是互补检验（complementation test）突突变变体体筛筛选选正向遗传学策略正向遗传学策略互补检验（互补检验（complementation test） 以豌豆花色为例，野生型为紫色，以豌豆花色为例，野生型为紫色，现有一批突变体花色为白色，它们现有一批突变体花色为白色，它们是相同基因突变，还是不同基因突是相同基因突变，
31、还是不同基因突变？变？ 假定突变都是隐性（假定突变都是隐性（recessive）突变。突变。突突变变体体筛筛选选正向遗传学策略正向遗传学策略 互补检验互补检验假定两个突变体基因型分别为假定两个突变体基因型分别为aa 和和bb突突变变体体筛筛选选如果a与b是等位基因aaBBAAbbAaBb紫色wildtype白色mutant如果a与b不是等位基因基因组图谱基因组图谱遗传图谱遗传图谱（genetic map）物理图谱物理图谱（physical map）遗传图谱遗传图谱（genetic map） 采用采用遗传分析的方法遗传分析的方法将基因或其它将基因或其它DNADNA序列标定在染色体上构建连锁图。序
32、列标定在染色体上构建连锁图。遗传标记遗传标记q有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。的相对位置。q构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征标记。构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征标记。q包括：包括： 形态标记形态标记 细胞学标记细胞学标记 生化标记生化标记 DNA DNA分子标记分子标记多态性（多态性（polymophism）所有的标记都必须具有多态性所有的标记都必须具有多态性！v 花色：白色、红色花色：白色、红色v 株高：高、矮株高：高、矮v 血型：血型：A A、B B、O O型型v 淀粉：糯、非糯淀粉：糯、非糯所有
33、多态性都是基因突变的结果！所有多态性都是基因突变的结果！形态标记形态标记形态性状：株高、颜色、白化症等形态性状：株高、颜色、白化症等又称表型标记又称表型标记数量少数量少很多突变是致死的很多突变是致死的受环境、生育期等因素的影响受环境、生育期等因素的影响q 最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形态性的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距离，绘制状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的。而成的。q 控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就控制性状的其实是基因，
34、所以形态标记实质上就是基因标记。是基因标记。果果蝇蝇连连锁锁图图细胞学标记细胞学标记v明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 染色体的核型染色体的核型 染色体的带型染色体的带型 染色体的结构变异染色体的结构变异 染色体的数目变异染色体的数目变异v优点：不受环境影响优点：不受环境影响v缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利不利生化标记生化标记v 又称蛋白质标记又称蛋白质标记v 就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。 如：同工酶、贮藏蛋白如：同工酶、贮藏蛋白v
35、优点：数量较多，受环境影响小优点：数量较多，受环境影响小v 缺点：受发育时间的影响、有组织特异缺点：受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息性、只反映基因编码区的信息DNADNA分子标记分子标记简称分子标记简称分子标记以以DNADNA序列的多态性作为遗传标记序列的多态性作为遗传标记优点：优点：v 不受时间和环境的限制不受时间和环境的限制v 遍布整个基因组，数量无限遍布整个基因组，数量无限v 不影响性状表达不影响性状表达v 自然存在的变异丰富，多态性好自然存在的变异丰富，多态性好v 共显性，能鉴别纯合体和杂合体共显性，能鉴别纯合体和杂合体限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（r
36、estriction fragment length polymorphism，RFLP）v DNADNA序序列列能能或或不不能能被被某某一一酶酶酶酶切切，相相当当于于一一对对等位基因的差异。等位基因的差异。 v 如如有有两两个个DNADNA分分子子（一一对对染染色色体体），一一个个具具有有某某一一种种酶酶的的酶酶切切位位点点，而而另另一一个个没没有有这这个个位位点点，酶切后形成的酶切后形成的DNADNA片段长度就有差异，即多态性。片段长度就有差异，即多态性。v 可可将将RFLPRFLP作作为为标标记记，定定位位在在基基因因组组中中某某一一位位置置上。上。v人人类类基基因因组组中中有有1010
37、5 5个个RFLPRFLP位位点点，每每一一位位点点只只有有两个等位基因。两个等位基因。RFLPRFLP分析分析微卫星微卫星（microsatellite）标记标记v微微卫卫星星又又称称为为简简单单重重复复序序列列（simple simple sequence sequence repeatrepeat，SSRSSR）。）。v这这种种重重复复序序列列的的重重复复单单位位很很短短，常常常常只只有有2 2个个、3 3个或个或4 4个核苷酸个核苷酸v如一条染色体如一条染色体TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC 另一染色体另一染色体 TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGAGA
38、GAGAGAGAGAGAGACGCCGC，就构成就构成了多态性。了多态性。遗传图谱的构建方法遗传图谱的构建方法 v 理论基础理论基础: 连锁与交换连锁与交换v 基本方法基本方法: 两点测验法和三点测验法两点测验法和三点测验法植物遗传图谱的构建植物遗传图谱的构建v 选择研究材料（亲本）选择研究材料（亲本）v 构建分离群体构建分离群体v 遗传标记检测遗传标记检测v 标记间的连锁分析标记间的连锁分析选择亲本选择亲本 要求亲缘关系远，遗传差异大要求亲缘关系远，遗传差异大 但又不能相差太大以导致引起子代不育。但又不能相差太大以导致引起子代不育。 对对备备选选材材料料进进行行多多态态( (差差异异) )性
39、性检检测测，综综合合测测定定结结果果，选选择择有有一一定定量量多多态态性性的的一一对对或或几几对对材材料料作作为为遗遗传传作作图亲本。图亲本。构建作图群体构建作图群体 标记间的连锁分析标记间的连锁分析v利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中所有个体的基因型所有个体的基因型v根据连锁交换的情况，确定标记之间的连锁关系和根据连锁交换的情况，确定标记之间的连锁关系和遗传距离遗传距离v有计算机软件可以应用有计算机软件可以应用遗传图谱的缺陷遗传图谱的缺陷v 分别率有限分别率有限v 人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量人类只能研究少数减数分裂事件，不
40、能获得大量子代个体子代个体v 测序要求每个标记的间隔小于测序要求每个标记的间隔小于100100kbkbv 实际是实际是599599kbkb精确性不够精确性不够经典遗传学认为，交换是随机发生的经典遗传学认为，交换是随机发生的基因组中有些区域是重组热点基因组中有些区域是重组热点倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组物理图谱的构建物理图谱的构建v 用用分子生物学方法分子生物学方法直接检测直接检测DNADNA标记在染标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱。色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱。v 有遗传图谱为什么还要构建物理图谱？有遗传图谱为什么
41、还要构建物理图谱？ v遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。v物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离物理距离碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。酵母酵母遗传遗传图与图与物理物理图比图比较较A A 遗传图遗传图B B 物理图物理图Comparison of genetic (likage) and physical mapsphysical(bp)genetic(cM)ArabidopsischromosomIV
42、 基于基于基因图谱的基因分离技术基因图谱的基因分离技术图谱定位克隆，简称图位克隆（图谱定位克隆，简称图位克隆（Map-based cloning)1 1、原理：、原理：利用利用同源染色体的随机交换和连锁不平衡同源染色体的随机交换和连锁不平衡的原理，的原理，先将与先将与某一特定性状某一特定性状相关联的目的基因定位到染色相关联的目的基因定位到染色体上，在目的基因的两侧确定一对与目的基因紧密体上，在目的基因的两侧确定一对与目的基因紧密连锁的连锁的分子标记分子标记，接着将位于两个分子标记间的候，接着将位于两个分子标记间的候选基因选基因DNADNA片段分离出来，最后再通过遗传互补试验片段分离出来，最后再
43、通过遗传互补试验鉴定出目的基因。鉴定出目的基因。特点：特点： 在不知道基因所编码蛋白信息的条件下分离基因。在不知道基因所编码蛋白信息的条件下分离基因。要求：要求： 1 1、需要构建性状上存在分离的群体；、需要构建性状上存在分离的群体； 2 2、高密度的分子标记图谱进行连锁分析；、高密度的分子标记图谱进行连锁分析； 3 3、需要获得与性状紧密连锁的分子标记；、需要获得与性状紧密连锁的分子标记； 4 4、高质量的基因组文库；、高质量的基因组文库；植物基因组遗传图谱的构建植物基因组遗传图谱的构建A、选择亲本B、构建作图群体C、遗传标记的染色体定位D、标记间的连锁分析分子标记分子标记(Molecula
44、r markers)(Molecular markers) A DNA sequence that exists as two or more readily distinguished versions and which can therefore be used to mark a map position on a genetic, physical or integrated genome map.即：同源染色体之间即：同源染色体之间DNADNA序列上的差异，用来序列上的差异，用来表示某个特定的染色体区段。表示某个特定的染色体区段。Indica (1)Japonica (1)CGGC
45、ATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATG- - - - - - - - - - -CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATSTSs Sequence tagged sitesLeft primerIndica (40) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Japonica (51) TCCATC TTTTGTAGGC
46、TATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica (40) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica (41) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica (15
47、1) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTRight primerInDels: insertions and deletions网站网址Supplemental material for this paperhttp:/carnegiedpb.stanford.edu/methods/ppsuppl.htmlNottingham Stock Centre（U.K.）http:/nasc.nott.ac.uk/Recombinant Inbred map http:/nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlO
48、hio Stock Center（U.S.A.） http:/aims.cps.msu.edu/aims/TAIR database*， homepage http:/www.arabidopsis.orgRecombinant Inbred map（mirror site） http:/www.arabidopsis.org/cgi-bin/maps/RiintromapCAPS markers http:/www.arabidopsis.org/aboutcaps.htmlSequence table http:/www.arabidopsis.org/cgi-bin/maps/Seqta
49、ble.plSNP collection http:/www.arabidopsis.org/SNPs.htmlCEREON collection of polymorphisms http:/www.arabidopsis.org/cereonSSLP markershttp:/genome.bio.upenn.edu/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR， genome annotations http:/www.tigr.org/tdb/athl/htmls/index.htmlDatabase of Ler sequences http:/www.tigr.org/tdb/a
50、tgenome/Ler.htmlKasuza DNA Research Institute， genome annotations http:/www.kazusa.or.jp/kaos/MIPS genome annotations http:/websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions http:/www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：The Arabidopsis Information Reso
51、urce （TAIR）Marker1ACAGAGTAGGAGGCAAAC GTCGCGCGTAACGTCACGCGTAACGCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC.GCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC .GCTACTTACACGGACAPrimerPrimer杂合=1-(1/2*1/2+ 1/2*1/2)10-20MarkerP1P2P1 P2PoolPoolChr-1Chr-2 Chr-3 Chr-4Chr-5交换率 50% 自由组合交换率50% F1F2Marker1MarkerPoolF1 PMarker1AGeneBCPCR
52、1.300PCR 1.300Marker1Marker2RRTarget geneM1M2RRRRRRRRRRTarget geneM1M2初步定位初步定位精细定位精细定位水稻半矮秆基因水稻半矮秆基因sd1sd1的克隆的克隆图位克隆法举例图位克隆法举例1： 水稻半矮秆基因水稻半矮秆基因sd1sd1被称为被称为“绿色革命基绿色革命基因因”，MonnaMonna等人通过图位克隆的方法克隆等人通过图位克隆的方法克隆到，它是编码赤霉素代谢合成途径中一个关到，它是编码赤霉素代谢合成途径中一个关键的酶键的酶GA20GA20氧化酶。氧化酶。水稻高杆和半矮杆植株水稻高杆和半矮杆植株半矮杆半矮杆Indicaja
53、ponicaHabatakiSasanishikiF1正常株高正常株高SasanishikiSBIL5Marker assistedSelection (MAS)Chr 1SBIL5 F2 segregating population (n=263)sd-1 can be treated as a mendelian factor in this population水稻半矮杆基因的精细定位水稻半矮杆基因的精细定位通过对通过对34773477个个分离单株的分分离单株的分子标记检测子标记检测（CAPSCAPS、SNPSNP等）找到了一等）找到了一个个6kb6kb的候选的候选基因区域。基因区域。水
54、稻分蘖基因的克隆水稻分蘖基因的克隆图位克隆法举例图位克隆法举例2：理想株型是当前国内外超级稻研究中的一个核理想株型是当前国内外超级稻研究中的一个核心领域，即通过改变水稻在分蘖、茎秆、穗粒心领域，即通过改变水稻在分蘖、茎秆、穗粒等方面的结构特点，提高水稻产量。等方面的结构特点，提高水稻产量。对于分蘖基因的克隆及机理研究有助于促进水对于分蘖基因的克隆及机理研究有助于促进水稻稻秆壮穗大的理想株型秆壮穗大的理想株型的实现，在高产育种中的实现，在高产育种中具有重要应用前景。具有重要应用前景。 水稻分蘖是在基部不延长的节间形成，并独立与主杆生水稻分蘖是在基部不延长的节间形成，并独立与主杆生长。水稻分蘖的发
55、生分二个阶段：腋芽形成和生长。长。水稻分蘖的发生分二个阶段：腋芽形成和生长。我国李家洋实验室克隆我国李家洋实验室克隆到了控制水稻分蘖的基到了控制水稻分蘖的基因因MONOCULM1（MOC1）。）。The moc1突变突变体只有一根主杆，没有体只有一根主杆，没有分蘖，因为不能形成分分蘖，因为不能形成分蘖芽。蘖芽。 通过通过PCR方法将方法将MOC1和和moc1基因扩增出，基因扩增出，序列比较后发现有一个序列比较后发现有一个1.9kb的反向转座因子插入的反向转座因子插入到到moc1突变体的突变体的ORF中。功能互补试验证明带有中。功能互补试验证明带有完整的完整的ORF和和1.5kb上游启动子序列的
56、克隆上游启动子序列的克隆pC8247能恢复分蘖性状（图能恢复分蘖性状（图1）。但是，）。但是，C-端截端截短的克隆短的克隆pC8247S不能恢复分蘖特性。不能恢复分蘖特性。总总 结结1、从性状的差异到基因，属于正向遗传学范畴；、从性状的差异到基因，属于正向遗传学范畴；2、亲本选择性状上存在显著差异的材料，获得性状分、亲本选择性状上存在显著差异的材料，获得性状分离的后代群体；离的后代群体；3、亲本选择籼稻、粳稻亚种，便于发展高密度的分子、亲本选择籼稻、粳稻亚种，便于发展高密度的分子标记；标记；4、通过寻找交换单株来确定紧密连锁的两侧分子标、通过寻找交换单株来确定紧密连锁的两侧分子标记；记；5、利
57、用基因组文库或、利用基因组文库或PCR的方法分离获得特殊功能的的方法分离获得特殊功能的基因。基因。存在的问题存在的问题图位克隆也有其自身的局限性，在某些情况下，就很难或者不能通过图位克隆技术来定位基因。在分析自然发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状是由不止一个的基因位点控制的。例如，在Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之间的杂交实验中，我们发现粉状霉菌抗性基因至少涉及三个遗传位点，它们是以附加的方式起作用的（I.Wilson， C. Schiff， 和 S. Somerville， 个人交流）。对这些抗性基因中的任何一个作精细定位都要求降低作
58、图群体的遗传复杂性，例如通过创造只有一个位点保持多态性的重组近交系。在拟南芥的株系之 间杂交时，很多种性状是由一个或多个遗传位点控制的，其中包括开花时间，种子大小，冬眠，生理节律，次生代谢以及表皮毛的密度（综述见Alonso-Blanco 和 Koornneef，2000）。无论何时，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定位的时候，第二位点修饰成分会干扰这些分析。表观（上位）遗传突变这个术语是描述一个基因在表达和功能上的可遗传改变，而不涉及DNA序列的改变（综述见Wolffe 和 Matzke,1999），已有文献很好地证明的是花发育基因SUPERMAN的后生clark kant等位基因（Ja
59、cobson 和 Meyerowitz，1997）。这些等位基因是可遗传的，但它们不稳定有一个小的回复率。它们在SUPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化现象，结果，有可能减少了SUPERMAN基因转录子的表达。它们中没有一个是和SUPERMAN的DNA序列改变联系在一起的；尽管如此，它们能被带有SUPERMAN基因的转基因所补充。目前，对于这种表观遗传突变是怎么产生的以及它们出现的频率知道的不多。关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。通常这种变化是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影响（Copenhaver等，1998）。但是，有证据表明有些染色体区域是例外的。例
60、如，对GURKE基因的图位克隆就非常困难，这个基因的定位接近于第一条染色体的着丝粒；在着丝粒附近重组是严格限制的，使得对它精细定位的努力非常无效。而且，在这个区域中重复DNA单元的广泛分布使我们辨认出散布的单拷贝序列，这些单拷贝序列能产生有疑问的遗传标记（R. Torres Ruiz，个人交流）。这个发现是经过对第二条染色体上的物理和遗传距离之间的比值的系统地分析之后确认的（Lin等，1999）。对这条染色体的几乎全序列，1%重组的遗传距离相当于100400 Kb的物理距离，平均是250 Kb。然而着丝粒区域是一个显著的例外，在这里1%重组的遗传距离相当于10002500 Kb。看来值得指出的
61、是在现存的物理图谱中，拟南芥的五个着丝粒是没有一个被完全覆盖的。最近对着丝粒区域的分析显示这些区域通常包含重复的DNA和几乎不含表达的基因（Copenhaver等，1999）。因此，由于接近着丝粒，应该没有拟南芥基因是不服从图位克隆策略的。除了着丝粒，第二条染色体上也有一个小片段上1%重组的遗传距离相当于1000 Kb甚至更多。根据推测，观察到的低重组率现象可能是由于被用于作图分析的株系的DNA序列的重排（Lin等，1999；Mayer等，1999）。第二和第四条染色体的DNA序列的比较显示有些基因片段是在这两条染色体之间被复制的（其中一个片段的大小是4.6 Mb），还有一个从线粒体基因组向第
62、二条染色体转移的DNA片段（Lin等，1999）。这些发现清楚地证明了拟南芥基因组的结构是可以不断改变的。因此，不同株系之间的遗传变异可能不仅仅是由点突变和DNA重排导致的，这就从根本上给图位克隆工程造成了严重的问题。举例来说，如果在两个株系之间发生倒转的一个大约500 Kb的序列被用于形成的一个作图群体，所有发生在这个倒转内的重组事件将产生不育的减数分裂产物。因此，不可能在这个倒转序列内对突变进行作图。到目前为止，发生在常见株系之间的这样的DNA重排还没有被报道过，确实应该是这样，因为它们很难被检测到。在一个作图实验中，它们的出现将很有可能被忽视直到最后一步。 反向遗传学反向遗传学策略策略
63、Reverse Genetics Strategyeverse Genetics Strategy基因型基因型 表现型表现型Genotype Phenotype反向遗传学策略反向遗传学策略 已知序列已知序列 预测蛋白预测蛋白 基因突变基因突变 异体表达异体表达 表达抑制表达抑制 表现型变化表现型变化 基因功能基因功能技术路线反向遗传学策略反向遗传学策略 基因组测序基因组测序 拟南芥、水稻拟南芥、水稻 cDNA文库文库 差示法差示法 PCR法法 探针法探针法 ESTs法法 其它分子标记法其它分子标记法已已知知序序列列来来源源反向遗传学策略反向遗传学策略 已已知知序序列列来来源源基因组测序基因组测
64、序DNAsegmentsGenome DNAvectorshostReproductionclonesequencingYAC-based physical map of rice chromosome 1 已已知知序序列列来来源源反向遗传学策略反向遗传学策略 基因组测序基因组测序反向遗传学策略反向遗传学策略 cDNA文库种类不同器官不同发育阶段不同环境条件已已知知序序列列来来源源cDNA library反向遗传学策略反向遗传学策略 根据基因序列，预测蛋白根据基因序列，预测蛋白质的结构，再根据蛋白质的质的结构，再根据蛋白质的保守序列，预测其功能。保守序列，预测其功能。蛋蛋白白产产物物预预测测反
65、向遗传学策略反向遗传学策略 蛋蛋白白产产物物预预测测反向遗传学反向遗传学策略策略 克隆基因、克隆基因、DNA序列序列突变诱导突变诱导突变体突变体表现型变化表现型变化基基因因突突变变技技术术路路线线反向遗传学策略反向遗传学策略 基基因因突突变变定向突变定向突变 site directed mutation随机突变随机突变random mutationSite directed mutation反向遗传学策略反向遗传学策略 基基因因突突变变Site directed mutation反向遗传学策略反向遗传学策略 基基因因突突变变Site directed mutation反向遗传学策略反向遗传学策
66、略 基基因因突突变变TILLING(Targeted Induced Local Lesions in Genome)Karthikeyan Narayanan! Introduction !TILLING was developed by M.McCullum etal., in 2000.Used for detecting induced mutations in genomeUses Chemical Mutagens like EMS.Doesnt require Agrobacterium mediated transformation protocols.Identifies t
67、he type of mutation occurred.It is used for detecting loss of function mutants.What is TILLING ?TILLING is a general reverse genetic method that combines chemical mutagenesis with PCR based screening to identify point mutations in regions of interest. (McCallum et.al, 2000)How is it done?Tilling is
68、done in 7 stepsEMS mutagenesisDNA Preparation and pooling of individualsPCR amplification of a region of interestDenaturation and annealing forms HeteroduplexesDetection of Heteroduplexes as extra peak or band (DHPLC or Acrylamide gel)Identification of the mutant individual Sequencing of Mutant PCR product.DHPLC Denaturing PolyAcrylamide Gel ElectrophoresisAdvantages It yields a traditional allelic series of point mutations.Very essential for phenotypic analysis of sub lethal alleles.Since it uses Chemical mutagenesis virtually all genes can be targeted by screening few individuals.
