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1、实验二实验二 ERIC-PCR指纹图谱技术指纹图谱技术 在分子在分子生态学中的应用生态学中的应用2021/6/41实 验 目 的明确明确ERIC-PCR技术用于分析微生物群技术用于分析微生物群落结构的原理。落结构的原理。 掌握掌握ERIC-PCR的操作方法。的操作方法。 2021/6/42ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-PCRHulton,1991首次在肠道细菌基因组中发现ERIC序列Versalovic,1991发明ERIC-PCR，对细菌的基因组DNA进行指纹图分析Gillings,1997bERIC-PCR可以
2、从植物、动物、真菌等的基因组DNA中扩增出稳定的、多态性丰富的图谱。Gillings,1997aERIC-PCR不只针对ERIC序列，实际上是一种“长引物随机PCR (LP-RAPD)”Di Giovanni,1999用ERIC-PCR分析混合菌群的组成高平平高平平,2003Wei,2004将ERIC-PCR方法引入复杂环境微生物群落的研究2021/6/43ERIC-PCR是一种长引物随机是一种长引物随机PCR技术技术普通RAPDLP-RAPD引物常为8-10bp的单个引物单个或一对长度大于16bp的引物退火温度低于40退火温度高于52图谱稳定、重复性高，对底物图谱稳定、重复性高，对底物的序列
3、差异敏感性高，产生的的序列差异敏感性高，产生的图谱多态性丰富图谱多态性丰富2021/6/44PCR反应的一般原理u PCR: 聚合酶链式反应，即通过引物延伸核酸的某聚合酶链式反应，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向个区域而进行的重复双向DNA合成。合成。u基本要素：基本要素：DNA模板模板一对寡聚一对寡聚DNA引物（启动引物（启动DNA扩增）扩增）Taq DNA聚合酶（催化聚合酶（催化DNA合成）合成） 缓冲液（提供缓冲液（提供DNA合成所需合成所需pH、离子强度等环境）、离子强度等环境） dNTP（DNA合成的原料）合成的原料） PCR原理2021/6/45ERIC-PCR程序95
4、, 7min94, 1min (变性) 52, 1min (退火) 30 cycles 68, 8min (延伸)65, 16min 2021/6/46实 验 材 料1. 试剂试剂l l 无菌水无菌水l 25 mmol/L MgCl2溶液溶液l 10扩增缓冲液扩增缓冲液: 含含500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (PH9.0), 1% TritionX-100l 2.5 mmol/L dNTP混合液混合液l 20pmol/l 引物引物E1l 20pmol/l 引物引物E2l 5 U/l Taq DNA聚合酶聚合酶l DNA模板（模板（40-80ng环境样品总环境样品总DNA
5、）2021/6/472. 仪器设备仪器设备2021/6/48实 验 步 骤1.制备PCR mixture (25l system)2. 无菌水 13 l 3. 10 buffer 2.5l 4. 25 mmol/l MgCl2溶液 2.0l 5. 2.5 mmol/L dNTP混合液 2.0l 6. 20pmol/L 引物E1 0.5l 7. 20pmol/L 引物E2 0.5l 2.加入模板DNA（40ng） 4.0l 20.5 ll 24.5 ll NC 样品 PC2021/6/493.3.放入放入PCRPCR扩增仪，扩增仪，9595变性变性7min7min 4.4.取出取出PCRPCR小
6、管，迅速加入小管，迅速加入0.5l 0.5l TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶，混匀，混匀，简短离心。（后加酶可保证模板变性完全且不损坏简短离心。（后加酶可保证模板变性完全且不损坏TaqTaq DNADNA聚合酶的活性）聚合酶的活性） 5. 5. 放入放入PCRPCR扩增仪扩增仪 ，按以下程序进行扩增：，按以下程序进行扩增： 94 1 min 94 1 min，52 1 min, 65 8 min52 1 min, 65 8 min，共，共3030个循环；个循环； 65 65延伸延伸16min16min，1 1个循环。个循环。2021/6/4106.6.程序结束（约程序结束（约6.5h
7、),6.5h),取出取出PCRPCR小管小管 7.7.吸取吸取2l2l扩增产物用浓度仪测定浓度扩增产物用浓度仪测定浓度8.8. 400ng PCR产物电泳产物电泳9. 凝胶成像，保存图谱凝胶成像，保存图谱2021/6/411 Mr NC S PC结果：2021/6/412注 意 事 项避免污染PCRPCR体系中所有试剂必须保证无其它杂菌体系中所有试剂必须保证无其它杂菌DNADNA的污染。的污染。制备制备PCRPCR混合物的操作应在超净台上进行。混合物的操作应在超净台上进行。打开打开PCRPCR扩增小管时切勿用手指接触管盖内侧。扩增小管时切勿用手指接触管盖内侧。用移液器吸取试剂时要轻吸轻放。用移液器吸取试剂时要轻吸轻放。定量模板模板DNADNA的量一致的量一致 电泳泳时PCRPCR产物产物上上样量一致量一致 2021/6/413部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！
