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1、第九节第九节第九节第九节 基因工程药物的基因工程药物的基因工程药物的基因工程药物的质量控制质量控制质量控制质量控制 是利用活细胞作为表达系统，产是利用活细胞作为表达系统，产是利用活细胞作为表达系统，产是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结物的分子量较大，并有复杂的结物的分子量较大，并有复杂的结物的分子量较大，并有复杂的结构，还参与生理功能的调节，用构，还参与生理功能的调节，用构，还参与生理功能的调节，用构，还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可量极微，任何质和量的偏差都可量极微，任何质和量的偏差都可量极微，任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。贻误病情造成严
2、重危害。贻误病情造成严重危害。贻误病情造成严重危害。2021/6/72021/6/71 1 宿主细胞中表达的外源基因，宿主细胞中表达的外源基因，宿主细胞中表达的外源基因，宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程在转录翻译精制工艺放大过程在转录翻译精制工艺放大过程在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料中都可能发生变化，故从原料中都可能发生变化，故从原料中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控以及制备全过程都必须严格控以及制备全过程都必须严格控以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。制条件和鉴定质量。制条件和鉴定质量。制条件和鉴定质量。2021/6/720
3、21/6/72 2一、一、一、一、 原材料的质量控制原材料的质量控制原材料的质量控制原材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码原材料的质量控制是确保编码原材料的质量控制是确保编码原材料的质量控制是确保编码药品的药品的药品的药品的DNADNA序列的正确性，重组微序列的正确性，重组微序列的正确性，重组微序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而生物来自单一克隆，所用质粒纯而生物来自单一克隆，所用质粒纯而生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和稳定，以保证产品质量的安全性和稳定，以保证产品质量的安全性和稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。一致性。一致性。一致性。202
4、1/6/72021/6/73 3 根据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下 特性：特性：特性：特性： 明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证；2021/6/72021/6/74 4 应提供表达载体的名称、结构、遗应提供表达载体的名称、结构、遗应提供表达载体的名称、结构、
5、遗应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启传特性及各组成部分（如复制子、启传特性及各组成部分（如复制子、启传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位动子）的来源与功能，构建中所用位动子）的来源与功能，构建中所用位动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；点的酶切图谱，抗生素抗性标记物； 应提供宿主细胞的名称、来源、应提供宿主细胞的名称、来源、应提供宿主细胞的名称、来源、应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；传代历史、检定结果及其生物学特性；传
6、代历史、检定结果及其生物学特性；传代历史、检定结果及其生物学特性；2021/6/72021/6/75 5 须阐明载体引入宿主细胞的方法须阐明载体引入宿主细胞的方法须阐明载体引入宿主细胞的方法须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的及载体在宿主细胞与载体结合后的及载体在宿主细胞与载体结合后的及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；遗传稳定性；遗传稳定性；遗传稳定性； 提供插入基因与表达载体两侧端提供插入基因与表达载体两侧端提供插入基因与表达载体两侧端提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述控制区内的核苷酸序列，详细叙述控制区内的核苷酸序列，详细叙述控制区内的
7、核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿在生产过程中启动与控制基因在宿在生产过程中启动与控制基因在宿在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。主细胞中表达的方法及水平等。主细胞中表达的方法及水平等。主细胞中表达的方法及水平等。2021/6/72021/6/76 6二、培养过程的质量控制二、培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中，要求种子在工程菌的贮存中，要求种子在工程菌的贮存中，要求种子在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；克隆纯而稳定；克隆纯而稳定；克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所在培养过程中，要求工程菌所在培养过程中，要求工程菌所在培养过程中，要求工程菌
8、所含的质粒稳定，始终无突变；含的质粒稳定，始终无突变；含的质粒稳定，始终无突变；含的质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表在重复生产发酵中，工程菌表在重复生产发酵中，工程菌表在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；达稳定；达稳定；达稳定； 始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。2021/6/72021/6/77 7 生产基因工程产品应有种子生产基因工程产品应有种子生产基因工程产品应有种子生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致批系统，并证明种子批不含有致批系统，并证明种子批不含有致批系统，并证明种子批不含有致癌
9、因子，无细菌、病毒、真菌和癌因子，无细菌、病毒、真菌和癌因子，无细菌、病毒、真菌和癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批支原体等污染，并由原始种子批支原体等污染，并由原始种子批支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。建立生产用工作细胞库。建立生产用工作细胞库。建立生产用工作细胞库。2021/6/72021/6/78 8 原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因DNADNADNADNA序列，详细叙述种子批来源、序列，详细叙述种子批来源、序列，详细叙述种子批来源、序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保
10、存方式、保存及预计使用期，保存方式、保存及预计使用期，保存方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳与复苏时宿主载体表达系统的稳与复苏时宿主载体表达系统的稳与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。定性。定性。定性。2021/6/72021/6/79 9 对生产种子，应详细叙述细对生产种子，应详细叙述细对生产种子，应详细叙述细对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，胞生长与产品生成的方法和材料，胞生长与产品生成的方法和材料，胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生并控制微生物污染；提供培养生并控制微生物污染；提供培养生并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产
11、量恒定性数据，依据产浓度与产量恒定性数据，依据产浓度与产量恒定性数据，依据产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞宿主细胞宿主细胞宿主细胞- - - -载体系统稳定性，确定载体系统稳定性，确定载体系统稳定性，确定载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；最高允许传种代数；最高允许传种代数；最高允许传种代数；2021/6/72021/6/71010 在培养过程中，应测定被表在培养过程中，应测定被表在培养过程中，应测定被表在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞达基因分子的完整性及宿主细胞达基因分子的完整性及宿主细胞达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿长期培养后的基因型特征
12、；依宿长期培养后的基因型特征；依宿长期培养后的基因型特征；依宿主细胞主细胞主细胞主细胞- - - -载体稳定性与产品恒定载体稳定性与产品恒定载体稳定性与产品恒定载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期性，规定持续培养时间，并定期性，规定持续培养时间，并定期性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。评价细胞系统和产品。评价细胞系统和产品。评价细胞系统和产品。2021/6/72021/6/71111 培养周期结束时，应监测培养周期结束时，应监测培养周期结束时，应监测培养周期结束时，应监测宿主细胞宿主细胞宿主细胞宿主细胞- - - -载体系统的特性，载体系统的特性，载体系统的特性，载体
13、系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表如质粒拷贝数、宿主细胞中表如质粒拷贝数、宿主细胞中表如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因达载体存留程度，含插入基因达载体存留程度，含插入基因达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。载体的酶切图谱等。载体的酶切图谱等。载体的酶切图谱等。 2021/6/72021/6/71212三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生产品要有足够的生理和生产品要有足够的生理和生产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分物学试验数据，确证提纯物分物学试验数据，确证提
14、纯物分物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白子批间保持一致性；外源蛋白子批间保持一致性；外源蛋白子批间保持一致性；外源蛋白质、质、质、质、DNADNA与热源质控制在规定与热源质控制在规定与热源质控制在规定与热源质控制在规定限度以下。限度以下。限度以下。限度以下。2021/6/72021/6/71313 在精制过程中能清除宿主在精制过程中能清除宿主在精制过程中能清除宿主在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引、培养基成分及精制工序本身引、培养基成分及精制工序本身
15、引、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。入的化学物质，并有检测方法。入的化学物质，并有检测方法。入的化学物质，并有检测方法。2021/6/72021/6/71414四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要基因工程药物的质量控制主要基因工程药物的质量控制主要基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求包括以下几项要求包括以下几项要求包括以下几项要求: :产品的鉴别、纯产品的鉴别、纯产品的鉴别、纯产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致度、活性、安全性、稳定性和一致度、活性、安全性、稳定性和一致度、活性
16、、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、性。它需要利用生物化学、免疫学、性。它需要利用生物化学、免疫学、性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物微生物学、细胞生物学和分子生物微生物学、细胞生物学和分子生物微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的学等多学科的理论与技术所建立的学等多学科的理论与技术所建立的学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。鉴定方法。鉴定方法。鉴定方法。2021/6/72021/6/71515产品的鉴别产品的鉴别 常用的鉴定方法常用的鉴定方法常用的鉴定方法常用的鉴定方法: : 电泳方法电泳方法电泳方法电泳方法: SDS-
17、PAGE: SDS-PAGE、等电聚焦、等电聚焦、等电聚焦、等电聚焦、免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法: : 放射免疫放射免疫放射免疫放射免疫(RIA)(RIA)、酶联、酶联、酶联、酶联免疫免疫免疫免疫(ELISA)(ELISA) 受体结合试验受体结合试验受体结合试验受体结合试验 高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)(HPLC)、肽图分析法、肽图分析法、肽图分析法、肽图分析法、末端序列分末端序列分末端序列分末端序列分 析、圆二色谱、核磁析、圆二色谱、核磁析、圆二色谱、核磁析、圆二色谱、核磁共振共振共振共振2021/6/72021
18、/6/71616 肽图分析肽图分析肽图分析肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解肽图分析是用酶法或化学法降解肽图分析是用酶法或化学法降解肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质目的蛋白质目的蛋白质目的蛋白质, ,对生成的肽段进行分离分对生成的肽段进行分离分对生成的肽段进行分离分对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效析。它是检测蛋白质一级结构最有效析。它是检测蛋白质一级结构最有效析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工的方法，该技术灵敏高效是对基因工的方法，该技术灵敏高效是对基因工的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行程药物的分子结
19、构和遗传稳定性进行程药物的分子结构和遗传稳定性进行程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用评价和验证的首选方法。常用评价和验证的首选方法。常用评价和验证的首选方法。常用HPLCHPLC、毛细管电泳。毛细管电泳。毛细管电泳。毛细管电泳。2021/6/72021/6/71717 氨基酸成分分析氨基酸成分分析氨基酸成分分析氨基酸成分分析 50 50个氨基酸较理想个氨基酸较理想个氨基酸较理想个氨基酸较理想 部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析 N N端端端端1515个氨基酸可作为重个氨基酸可作为重个氨基酸可作为重个氨基酸可作为重 组蛋白质和多肽的重
20、要鉴组蛋白质和多肽的重要鉴组蛋白质和多肽的重要鉴组蛋白质和多肽的重要鉴 定指标。定指标。定指标。定指标。2021/6/72021/6/71818 重组蛋白质浓度测定和相对分重组蛋白质浓度测定和相对分重组蛋白质浓度测定和相对分重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定子量的测定子量的测定子量的测定 蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有: : : :福林福林福林福林- - - -酚酚酚酚法、双缩脲法法、双缩脲法法、双缩脲法法、双缩脲法 蛋白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定: :凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤法、法、
21、法、法、SD-SPAGESD-SPAGE法法法法2021/6/72021/6/71919 蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析 测定方法有测定方法有测定方法有测定方法有: : : : 对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等 5 5 5 5，5-5-5-5-二硫基双二硫基双二硫基双二硫基双-2-2-2-2-硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法2021/6/72021/6/72020 纯度分析纯度分析纯度分析纯度分析 蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定 SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE SD
22、S-PAGE、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种HPLCHPLCHPLCHPLC、 毛毛毛毛细管电泳细管电泳细管电泳细管电泳 杂质杂质杂质杂质 蛋白类杂质蛋白类杂质蛋白类杂质蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白 采采采采用免疫分析的方法用免疫分析的方法用免疫分析的方法用免疫分析的方法 非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质 2021/6/72021/6/72121非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质主要有非蛋白类杂质主要有非蛋白类杂质主要有非蛋白类杂质主要有: : : :病毒、细菌等微生物、热
23、原、病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及DNADNADNADNA。2021/6/72021/6/72222常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物 检检检检检检 测测测测测测 方方方方方方 法法法法法法内毒素内毒素内毒素内毒素内毒素内毒素 鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋
24、白宿主细胞蛋白 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、CECECECECECE其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、 HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC、CECECECECECE残余残余残余残余残余残余DNA DNADNA DNADNA DNADNA DNADN
25、A DNADNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异 肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、 IEF IEF IEF IEF IEF IEF、 CE CE CE CE CE CE甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸 肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、 IEF IEF IEF IEF IEF IEF、 CE CE
26、 CE CE CE CE蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化 肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、 质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE、IEFIEFIEFIEFIEFIEF、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、 CE CE
27、 CE CE CE CE、质谱、质谱、质谱、质谱、质谱、质谱、 凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤2021/6/72021/6/72323杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物 检检检检检检 测测测测测测 方方方方方方 法法法法法法单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析
28、、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质 谱、谱、谱、谱、谱、谱、CECECECECECE微生物微生物微生物微生物微生物微生物 微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查支原体支原体支原体支原体支原体支原体 微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查病毒病毒病毒病毒病毒病毒 微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查微生物学检查2021/6/72021/6/72424生物学活性测定生物学活性测定生物学活性测定生物学活性测定 需通过动物体内试验和通过细胞培养需通过动物体
29、内试验和通过细胞培养需通过动物体内试验和通过细胞培养需通过动物体内试验和通过细胞培养 进行体外效价测定。进行体外效价测定。进行体外效价测定。进行体外效价测定。稳定性考查稳定性考查稳定性考查稳定性考查 是药品有效性安全性的重要指标，是药是药品有效性安全性的重要指标，是药是药品有效性安全性的重要指标，是药是药品有效性安全性的重要指标，是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。品贮藏条件和使用期限的主要依据。品贮藏条件和使用期限的主要依据。品贮藏条件和使用期限的主要依据。产品一致性的保证产品一致性的保证产品一致性的保证产品一致性的保证2021/6/72021/6/72525五、产品的保存五、产品的保存五、
30、产品的保存五、产品的保存液态保存液态保存液态保存液态保存低温保存低温保存低温保存低温保存在稳定的下保存在稳定的下保存在稳定的下保存在稳定的下保存高浓度保存高浓度保存高浓度保存高浓度保存加保护剂保存加保护剂保存加保护剂保存加保护剂保存固态保存固态保存固态保存固态保存2021/6/72021/6/72626第十节基因工程药物制造实例第十节基因工程药物制造实例干扰素（干扰素（interferoninterferon，IFNIFN）是人体细胞分泌的一种）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。
31、根据分子结构和抗原性是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为的差异分为、等等4 4个类型。个类型。型干扰素在分型干扰素在分为为1b 2a 2b1b 2a 2b等亚型。等亚型。 一、基因工程菌的组建一、基因工程菌的组建 诱生的白细胞诱生的白细胞 提取全提取全RNA RNA 通过寡通过寡dT-dT-纤维素柱纤维素柱 蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度 获得寡获得寡A A的的mRNA mRNA 离心提取离心提取12s12s 的的 mRNA mRNA 逆转录成逆转录成cDNA cDNA 双链双链cDNAcDNA接上接上dTdT或或dGdG尾尾 pBR322 pBR322质粒质粒 pBR322
32、 pBR322质粒加上质粒加上dAdA或或dCdC2021/6/72021/6/72727第十节基因工程药物制造第十节基因工程药物制造第十节基因工程药物制造第十节基因工程药物制造实例实例实例实例 干扰素（干扰素（干扰素（干扰素（interferoninterferoninterferoninterferon，IFNIFNIFNIFN）是人体细）是人体细）是人体细）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是的
33、抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据人体防御系统的重要组成部分。根据人体防御系统的重要组成部分。根据人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为分子结构和抗原性的差异分为分子结构和抗原性的差异分为分子结构和抗原性的差异分为、等等等等4 4 4 4个类型。个类型。个类型。个类型。型干扰素在分为型干扰素在分为型干扰素在分为型干扰素在分为1b 2a 2b1b 2a 2b1b 2a 2b1b 2a 2b等亚型。等亚型。等亚型。等亚型。2021/6/72021/6/72828一、基因工程菌的组建诱生的白细胞诱生的白细胞诱生的白细胞诱生的白细胞 提取全提取全提取全提
34、取全RNA RNA RNA RNA 通过寡通过寡通过寡通过寡dT-dT-dT-dT-纤维素柱纤维素柱纤维素柱纤维素柱 蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度 获得寡获得寡获得寡获得寡A A A A的的的的mRNA mRNA mRNA mRNA 离心提取离心提取离心提取离心提取12s12s12s12s 的的的的 mRNA mRNA mRNA mRNA 逆转录成逆转录成逆转录成逆转录成cDNA cDNA cDNA cDNA 双链双链双链双链cDNAcDNAcDNAcDNA接上接上接上接上dTdTdTdT或或或或dGdGdGdG尾尾尾尾 pBR322 pBR322 pBR322 pBR32
35、2质粒质粒质粒质粒 pBR322 pBR322 pBR322 pBR322质粒加上质粒加上质粒加上质粒加上dAdAdAdA或或或或dCdCdCdC2021/6/72021/6/72929 退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌 扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒扩增杂交质粒 筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选用杂交翻译法
36、挑选用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆青霉素敏感细菌克隆 含干扰素含干扰素含干扰素含干扰素含干扰素含干扰素cDNAcDNAcDNA克隆克隆克隆克隆克隆克隆 将干扰素将干扰素将干扰素将干扰素将干扰素将干扰素cDNAcDNAcDNA克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体克隆入表达载体 在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌在大肠杆菌 中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达中进行高效表达2021/6/72021/6/73
37、030二、基因工程干扰素的制备二、基因工程干扰素的制备二、基因工程干扰素的制备二、基因工程干扰素的制备启开种子启开种子启开种子启开种子启开种子启开种子 制备种子液制备种子液制备种子液制备种子液制备种子液制备种子液 发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养 粗提粗提粗提粗提粗提粗提精提精提精提精提精提精提 半成品制备半成品制备半成品制备半成品制备半成品制备半成品制备 半成品检定半成品检定半成品检定半成品检定半成品检定半成品检定 分装分装分装分装分装分装冻干冻干冻干冻干冻干冻干 成品检定成品检定成品检定成品检定成品检定成品检定 成品包装成品包装成品包装成品包装成品包装成品包装2021/6/
38、72021/6/731312b2b2b2b干扰素生产过程干扰素生产过程干扰素生产过程干扰素生产过程1.1.1.1.发酵发酵发酵发酵 工程菌：工程菌：工程菌：工程菌：SW-IFN-2b/E.SW-IFN-2b/E.SW-IFN-2b/E.SW-IFN-2b/E.colicolicolicoli DH5 DH5 DH5 DH5，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含基因。培养基含基因。培养基含基因。培养基含1%1%1%1%蛋白冻蛋白冻蛋白冻蛋白冻0.5%0.5%0.5%0.5%酵母提酵母提酵母提酵
39、母提取物取物取物取物0.5%NACl0.5%NACl0.5%NACl0.5%NACl。摇床培养。摇床培养。摇床培养。摇床培养30 C30 C30 C30 C，10h10h10h10h，发酵种子。发酵种子。发酵种子。发酵种子。15L15L15L15L发酵罐培养，发酵罐培养，发酵罐培养，发酵罐培养， 30 C 30 C 30 C 30 C，8h8h8h8h。然后。然后。然后。然后42 C42 C42 C42 C，3h3h3h3h。离心去上清。离心去上清。离心去上清。离心去上清。ooo2021/6/72021/6/73232 2.2.2.2.产品的提取与纯化产品的提取与纯化产品的提取与纯化产品的提取
40、与纯化 湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓 缩，缩，缩，缩，Sephadex G50 Sephadex G50 Sephadex G50 Sephadex G50 分离。分离。分离。分离。 经经经经SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE检查。检查。检查。检查。 在经在经在经在经DE-52DE-52DE-52DE-52柱纯化柱纯化柱纯化柱纯化。2021/6/72021/6/73333三、质量控制标和要求三、质量控制标和要求三、质量控制标和要求三、质量控制标和要求半成品检定半成品检定半成
41、品检定半成品检定干扰素效价测定干扰素效价测定干扰素效价测定干扰素效价测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定蛋白质含量测定比活性比活性比活性比活性纯度测定纯度测定纯度测定纯度测定相对分子量测定相对分子量测定相对分子量测定相对分子量测定2021/6/72021/6/73434残余外源性残余外源性DNA含量测定含量测定残余血清残余血清igG含量测定含量测定残余抗生素活性测定残余抗生素活性测定紫外光谱扫描紫外光谱扫描肽图测定肽图测定等电点测定等电点测定除菌半成品干扰素效价测定、无菌试除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。验、热原试验。2021/6/72021/6/73535成品检定成品检定成品检定成品检定物理性状物理性状鉴别试验鉴别试验水分测定水分测定无菌试验无菌试验热原试验热原试验干扰素效价测定干扰素效价测定安全试验安全试验2021/6/72021/6/73636部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！
