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1、第九章基因工程和基因组学第九章基因工程和基因组学 遗传工程或基因工程遗传工程或基因工程，是将分子遗传学的理论与技术，是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生产生相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生产生物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。 本章介绍本章介绍遗传工程的基本原理和方法遗传工程的基本原理和方法，基因组学的，基因组学的发展及应用前景。发展及应用前景。 基因工程和基因组学优秀课件广义广义遗传工程包括遗传工程包括: :生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体
2、工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义狭义遗传工程是指遗传工程是指: :基因工程基因工程( (重组重组DNADNA技术技术) )。 一、基因工程概述一、基因工程概述: :第一节第一节 基因工程基因工程基因工程和基因组学优秀课件. .概念：概念：基因工程：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式在分子水平上，采取工程建设方式 按照按照预先设计的蓝图预先设计的蓝图 借助于实验室技术将某种生物的基借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去因或基因组转移到另一种生物中去 使使后者定向获得后者定向获得新遗传性状的一门技术。新遗传性状的一门技术。 基因
3、工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。巨大的变革。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。 基因工程和基因组学优秀课件2. 2. 发展：发展：19711971年，年，SmithSmith等人从细菌中分离出的一种等人从细菌中分离出的一种限制性酶限制性酶，酶切，酶切病毒病毒DNADNA分子，标志着分子，标志着DNADNA重组时代的开始。重组时代的开始。19721972年，年，BergBerg等用限制性酶
4、分别等用限制性酶分别酶切酶切猿猴病毒和猿猴病毒和TlTl噬菌体噬菌体DNADNA，将两种，将两种DNADNA分子用分子用连接酶连接酶连接起来连接起来 得到得到新的新的DNADNA分子。分子。19731973年，年， CohenCohen等进一步将等进一步将酶切后的酶切后的DNADNA分子与质粒分子与质粒DNADNA连接起来，并将连接起来，并将重组质粒重组质粒转转入入E. cloiE. cloi细胞中。细胞中。基因工程和基因组学优秀课件19821982年，年，美国食品卫生和医药管理局批准，用美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在基因工程在细菌中生产人的胰岛素细菌中生产人的胰岛素投放市场。投放
5、市场。19851985年，年，转基因植物转基因植物获得成功。获得成功。19941994年，年，延熟保鲜的延熟保鲜的转基因番茄转基因番茄商品生产。商品生产。19961996年，年，克隆羊克隆羊诞生。诞生。基因工程和基因组学优秀课件19961996年年全世界转基因植物种植面积为全世界转基因植物种植面积为170170万公顷，万公顷，19971997年年为为11001100万公顷，万公顷，19981998年年为为27802780万公顷，万公顷，19991999年年达到达到39903990万公顷，万公顷，20002000年年达到达到44204420万公顷，万公顷，20012001年年达到达到526052
6、60万公顷，万公顷，20022002年年达达到到50005000万公顷。万公顷。基因工程和基因组学优秀课件20012001年种植面积已超过年种植面积已超过100100万公顷的作物有：万公顷的作物有：大豆大豆（33303330万万hm2hm2，占全世界转基因作物的，占全世界转基因作物的63%63%，均为抗，均为抗除草剂大豆）、除草剂大豆）、玉米玉米（980980万万hm2 hm2 ，占，占19% 19% ）、）、棉花棉花（680680万万hm2 hm2 ，占，占13% 13% ）、）、油菜油菜（270270万万hm2 hm2 ，5% 5% ）；）；其它还有其它还有水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、
7、甘蓝、马水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等5050多种转基因作物多种转基因作物已实现商品化。已实现商品化。主要分布主要分布在美国（在美国（35703570万万hm2hm2）、阿根廷（）、阿根廷（11801180万万hm2hm2）、）、加拿大（加拿大（320320万万hm2hm2）和中国（）和中国（150150万万hm2hm2）等国。）等国。基因工程和基因组学优秀课件20012001年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率年全世界转基因作物占相应种植总面积的百分率基因工程和基因组学优秀课件 2001 2001年年我国我国的转
8、基因农作物和林木的转基因农作物和林木已达已达2222种种，其中，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模转基因棉花已经大规模商品化生产商品化生产。基因工程和基因组学优秀课件3 3内容：内容：从细胞和组织中从细胞和组织中分离分离DNADNA；限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切DNADNA分子，分子，制备制备DNADNA片段片段；将酶切将酶切DNADNA分子与载体分子与载体DNADNA连接连接构建能在宿主细胞内构建能在宿主细胞内自我复制的自我复制的重组重组DNA
9、DNA分子分子；把重组把重组DNADNA分子引入宿主受体细胞分子引入宿主受体细胞复制；复制；重组重组DNADNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞随宿主细胞的分裂而分配到子细胞建立无建立无性繁殖系性繁殖系(Clone)(Clone)或或发育成个体发育成个体；从细胞群体中从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系选出所需要的无性繁殖系并使外源基并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物基因产物、回、回收；收；或或筛选出获得定向的性状变异的筛选出获得定向的性状变异的个体个体。基因工程和基因组学优秀课件1. 1. 限制性内切酶限制性内切酶(restrictio
10、n enzyme)(restriction enzyme)： 一种水解一种水解DNADNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。这种酶这种酶能识别能识别双链双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链在这一段序列内将双链DNA分子切断。分子切断。 细菌细胞中存在细菌细胞中存在限制修饰系统限制修饰系统：限制：限制：降解外源降解外源DNADNA，防御异源遗传信息进入的手段。，防御异源遗传信息进入的手段。修饰：修饰：修饰外源修饰外源DNADNA片段后，保留在新细胞中。片段后，保留在新细胞中。二、限制性内切核酸酶二、限制性内切核酸
11、酶基因工程和基因组学优秀课件限制性内切酶限制性内切酶EcoREcoR：识别序列：识别序列：回纹回纹对称序列对称序列(palindrome) (palindrome) ，不同生物的，不同生物的DNADNA具具 有相同识别序列。有相同识别序列。酶切方式：酶切方式：以交错以交错方式切断方式切断DNADNA双链，产生二个相同的双链，产生二个相同的单单链粘性末端。链粘性末端。重组过程：重组过程：两种片段在适宜两种片段在适宜条件下，可经碱酸二脂链，条件下，可经碱酸二脂链，连接成重组连接成重组DNADNA分子分子。基因工程和基因组学优秀课件限制性内切酶的命名：限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文
12、字母和数字表示；根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；. . HindHind来自来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae。. . EcoRI EcoRI 来自来自Escherichia coliEscherichia coli；基因工程和基因组学优秀课件限制性内切酶的类别：限制性内切酶的类别：第第类酶类酶: :每隔一段每隔一段DNADNA序列随机切割双链序列随机切割双链DNADNA分子，分子，没有序列特异性没有序列特异性, ,酶切位点不定酶切位点不定。 如如EcoB(EcoB(大肠杆菌大肠杆菌B B株株) )、EcoK(EcoK(大肠
13、杆菌大肠杆菌K K株株) )分子量较大分子量较大( (约约300000)300000)，作用时需，作用时需ATPATP、Mg+Mg+等辅助因子。等辅助因子。第第类酶类酶: :能识别一段特异的能识别一段特异的DNADNA序列，准确地酶切双序列，准确地酶切双链链DNADNA的特异序列。的特异序列。如如EcoRI(EcoRI(大肠杆菌大肠杆菌) )、Hind(Hind(嗜血杆菌嗜血杆菌) )，分子量较小，分子量较小( (约约20000-100000)20000-100000)，作用时需，作用时需MgMg2+2+存在。存在。基因工程和基因组学优秀课件第第类酶特点：类酶特点：(1) (1) 切割产生切割
14、产生平末端平末端(blunt ends)(blunt ends)如如Sma Sma ：基因工程和基因组学优秀课件(2) (2) 有的产生粘性末端有的产生粘性末端 从两个方向阅读而序列相同的序列。从两个方向阅读而序列相同的序列。识别特定碱基顺序识别特定碱基顺序，为回文对称序列为回文对称序列, ,又称反向重复序列：又称反向重复序列：如如EcoREcoR：基因工程和基因组学优秀课件基因工程和基因组学优秀课件载体载体：将将“目的目的”基因导入受体细胞的运载工具。基因导入受体细胞的运载工具。 DNA DNA片段与适合的载体片段与适合的载体DNADNA连接构成重组连接构成重组DNA DNA 在在载体载体D
15、NADNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制。行复制。 DNA DNA载体载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等。染色体等。三、载体（三、载体（vectorvector）：）：基因工程和基因组学优秀课件载体的条件：载体的条件：.具有复制原点，能具有复制原点，能自我复自我复 制制；.具具多克隆位点多克隆位点(multiple (multiple cloningsitecloningsite，MCS MCS 或或Polylinker region)Polylinker region)即有多即有
16、多种限制酶的切点；种限制酶的切点；.选择时的选择时的遗传标记遗传标记，如，如抗生素基因；抗生素基因；.易易从宿主细胞中从宿主细胞中回收回收。基因工程和基因组学优秀课件、细菌质粒：、细菌质粒： 质粒质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链能自我复制、易分离和导入的环状双链DNADNA分子。分子。 质粒具有质粒具有重组表型检测标记重组表型检测标记，检测是否携带外源，检测是否携带外源DNADNA片段。片段。在细胞内的复制程度：在细胞内的复制程度：严紧型：严紧型：一个细菌细胞内的质粒数量有一个细菌细胞内的质粒数量有1-2
17、1-2个；个； 松驰型：松驰型：每个细胞内有的每个细胞内有的20-6020-60个。个。基因工程和基因组学优秀课件如如pUCpUC1818质粒具有以下特点：质粒具有以下特点：. . 克隆位点的酶切位点多，克隆位点的酶切位点多，克隆方便；克隆方便；. . 具有具有a a互补的互补的显色表显色表型型，用于检测重组质粒的，用于检测重组质粒的选择标记。选择标记。. 分子量小分子量小，可接受较大外源片段；，可接受较大外源片段；. 拷贝数多拷贝数多，每个细胞中每个细胞中有有500个；个；基因工程和基因组学优秀课件噬菌体噬菌体DNADNA中间约中间约2/32/3的序列的序列为中间基因簇，位于两端的为中间基因
18、簇，位于两端的为为DNADNA左、右臂。左、右臂。中间基因中间基因簇簇可被外源可被外源DNADNA替代而不影替代而不影响浸染细菌的能力。响浸染细菌的能力。 能接受能接受15-23kb15-23kb外源外源DNADNA片段，可以作为片段，可以作为cDNAcDNA或或核核DNADNA克隆的载体。克隆的载体。、噬菌体噬菌体( (温和型温和型) )：基因组全长基因组全长49kb49kb。基因工程和基因组学优秀课件优点：优点：2.2.不易引起生物危害，不易引起生物危害，有助于有助于“目的目的”基因进入基因进入细胞并增殖细胞并增殖；1.1.携带携带大片段大片段外源外源DNADNA分子，可占用总量的分子，可
19、占用总量的25%25%时仍时仍不失活。不失活。基因工程和基因组学优秀课件、柯斯质粒、柯斯质粒(cosmid)(cosmid)：部分部分噬菌体噬菌体DNA DNA + + 部分细菌部分细菌质粒质粒DNADNA序列组建序列组建 柯斯质粒柯斯质粒。带有噬菌体带有噬菌体coscos序列和细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。序列和细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。这种质粒分子量较小，但这种质粒分子量较小，但可接受可接受长达长达50kb50kb的外源的外源DNADNA片段，在克隆片段，在克隆真核真核生生物基因中十分有用。物基因中十分有用。一个长片段一个长片段DNADNA可能具有可能具有真核生物基因的编码序列
20、真核生物基因的编码序列及其它调控序列。及其它调控序列。基因工程和基因组学优秀课件指能在指能在两种不同两种不同的生物中复制的载体。的生物中复制的载体。 如能在如能在原核原核生物（如生物（如E. coliE. coli）、）、真核真核细胞（如酵母）细胞（如酵母）中复制的载体。中复制的载体。 穿梭载体需穿梭载体需同时具有同时具有细菌质粒的细菌质粒的复制原点复制原点、真核生物、真核生物自主复制序列自主复制序列(Auto-nomously replicating sequence, (Auto-nomously replicating sequence, ARS)ARS)以及两者的选择标记。以及两者的选
21、择标记。、穿梭载体（、穿梭载体（shuttle vectorsshuttle vectors）：）：穿梭载体穿梭载体在细菌在细菌中用于克隆、扩增基因，中用于克隆、扩增基因，在酵母菌中在酵母菌中用用于基因表达分析。于基因表达分析。基因工程和基因组学优秀课件 酵母菌的酵母菌的YEp YEp 系列载体系列载体(yeast episomaplasmid) (yeast episomaplasmid) YIpYIp和和YRpYRp系列载体系列载体均是穿均是穿梭载体。梭载体。YEp24具有具有Amp及及Tc二二个抗生素抗性基因，可个抗生素抗性基因，可将外源将外源DNA片段插在抗片段插在抗生素基因中，通过生
22、素基因中，通过插入插入失活失活,选择阳性克隆选择阳性克隆。 基因工程和基因组学优秀课件、细菌人工染色体、细菌人工染色体( (Bacterial artificial chromosomeBacterial artificial chromosome，BACBAC) )BACBAC载体载体可以可以携带大于携带大于50kb50kb的外源的外源DNADNA片段片段。特点：特点：带有外源带有外源DNADNA的的BACBAC载体载体在细胞中是单拷贝的；在细胞中是单拷贝的；载体本身分子量很小载体本身分子量很小(7.4kb)(7.4kb)；选择标记：选择标记：氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因； 多克隆位点。多
23、克隆位点。F F因子经基因工程改造成因子经基因工程改造成BACBAC载体，可用于克载体，可用于克隆隆100kb100kb以上的以上的DNADNA片段。片段。基因工程和基因组学优秀课件、酵母人工染色体、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome(yeast artificial chromosome，YAC)YAC)：YACYAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可可接受接受100-1000kb100-1000kb的外源的外
24、源DNADNA片段。片段。YACYAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；并促进了并促进了人类人工染色体人类人工染色体(human artificial chromosome(human artificial chromosome，HACHAC) )的研究。的研究。1996年完成了酵母菌全基因组序列的测定基因工程和基因组学优秀课件、TiTi质粒及其衍生载体：质粒及其衍生载体： 适合于适合于植物植物的载体系统的载体系统将重组将重组DNADNA运载到植物细运载到植物细胞并使目的基因表达。胞并使目的基因表达。TiTi质粒质粒是一种细菌质粒，它自
25、然存在于是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌土壤农杆菌( (革革兰氏阴菌兰氏阴菌)()(Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens) )细胞中细胞中可可诱导植物产生瘤细胞诱导植物产生瘤细胞(tumor-Inducing, (tumor-Inducing, TiTi) ) 冠瘿瘤冠瘿瘤(grown galltumors)(grown galltumors)。基因工程和基因组学优秀课件TiTi质粒一部分质粒一部分DNADNA叫叫转移转移DNADNA (transfer DNA(transfer DNA，T-DNAT-DNA) )，当农，当
26、农杆菌感染植物时，杆菌感染植物时，T-DNAT-DNA便转移便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱并能合成冠瘿碱(opine)(opine)，作为，作为农杆菌的碳源和氮源。农杆菌的碳源和氮源。农杆菌感染产生农杆菌感染产生冠缨瘤冠缨瘤基因工程和基因组学优秀课件 一般而言，一般而言， 一个基因一个基因 是编码一条多肽链的一是编码一条多肽链的一个个DNADNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。片段，包括启动子、终止子及内含子等。 在在DNADNA重组技术出现之前重组技术出现之前，由于，由于DNADNA分子量大而结构分子量大而结构单一，单一，DNADNA是细胞
27、中最难分析的大分子。是细胞中最难分析的大分子。 DNA DNA重组技术发展成功重组技术发展成功之后之后，DNADNA已成为细胞中最易已成为细胞中最易操作分析的大分子。操作分析的大分子。四、基因的分离与鉴定：四、基因的分离与鉴定： 利用这一技术，可从一个含有利用这一技术，可从一个含有1010万个基因的大基因万个基因的大基因组中，组中，准确地分离出准确地分离出特异的特异的单个目的基因单个目的基因。 基因工程和基因组学优秀课件1.1.体外通过体外通过限制性内切酶限制性内切酶的修剪和的修剪和DNADNA连接酶连接酶的连接；的连接；2.2.目标目标DNADNA分子分子 + + 载体载体DNADNA，共价
28、连接；，共价连接；3.3.获得获得重组重组DNADNA分子分子。DNADNA的体外重组：的体外重组：分离与鉴定基因是分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。重组中的关键步骤之一。 分离的基因可用于分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达分析基因序列、结构与表达，又可为基因工程又可为基因工程提供目的基因提供目的基因。基因工程和基因组学优秀课件、从基因库中分离基因：、从基因库中分离基因：1.1.构建构建基因库（基因库（librarylibrary）基因库基因库是一组是一组DNADNA和和cDNAcDNA序列克隆的集合体。序列克隆的集合体。根据克隆核酸序列、来源，根据克隆核酸序列、来源，基因库可
29、分为基因库可分为：核基因库核基因库、染色体库染色体库、cDNAcDNA库库、线粒体库线粒体库等。等。基因工程和基因组学优秀课件. . 核基因库：核基因库：核基因库核基因库(genomic library)(genomic library)：将将某生物全部基因组某生物全部基因组DNA DNA 酶酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。基因组序列。构建文库可采用不同的载体：构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。噬菌体或噬菌体或 ( (柯
30、斯质粒柯斯质粒) )载体：载体：重组重组DNADNA包装进噬菌体，包装进噬菌体，感染细菌，感染细菌， 收集噬菌斑。收集噬菌斑。BAC(BAC(细菌人工染色体细菌人工染色体) )或或YAC(YAC(酵母人工染色体酵母人工染色体) )载体：载体：重组重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库因库。 基因工程和基因组学优秀课件. . 染色体基因库：染色体基因库： 将基因组的将基因组的一部分如一条染色体一部分如一条染色体用来构建基因库用来构建基因库可可选择选择特异基因以及分析染色体结构和组织。特异基因以及分析染色体结构和组织。果蝇的多线
31、染色体中果蝇的多线染色体中，对染色体进行对染色体进行微切割，微切割，构建染色构建染色体区段基因文库。如对体区段基因文库。如对X X染色体上多线染色体带的分析。染色体上多线染色体带的分析。基因工程和基因组学优秀课件 人类基因组项目研究中，人类基因组项目研究中，利用利用流动细胞分离流动细胞分离(flow (flow cytometry)cytometry)技术将人类染色体分开，用于技术将人类染色体分开，用于构建单个染色体基构建单个染色体基因库，因库，大大加速了人类基因组作图和分析。大大加速了人类基因组作图和分析。流式细胞分离原理流式细胞分离原理分离后的染色体进行涂色验证分离后的染色体进行涂色验证基
32、因工程和基因组学优秀课件酵母菌：酵母菌：利用改良的利用改良的脉冲电泳方法脉冲电泳方法(pulsed field gel electro -(pulsed field gel electro -phoresis ,PFGE) phoresis ,PFGE) ，将酵母菌，将酵母菌1616根染色体根染色体据其分子量大小据其分子量大小分开分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。基因工程和基因组学优秀课件. . cDNAcDNA库：库：以以mRNAmRNA为模板为模板经反转经反转录酶合成互补录酶合成互补DNADNA构建构建基因库。基因库。真核生物真
33、核生物mRNAmRNA的的55端端具有一段多聚具有一段多聚A A尾端序尾端序列列得到的双链得到的双链DNADNA分分子经两端补齐后子经两端补齐后以带以带有限制性酶切点的人工有限制性酶切点的人工接头连接接头连接酶切后与载酶切后与载体体( (通常是噬菌体通常是噬菌体) )连接连接制备制备cDNAcDNA库。库。基因工程和基因组学优秀课件cDNAcDNA库与核库与核DNADNA库不同：库不同：cDNAcDNA库仅具有细胞或组织内库仅具有细胞或组织内表达表达基因的基因的mRNAmRNA序序列列仅包括基因组的仅包括基因组的部分基因序列。部分基因序列。 cDNA库对于库对于研究基因的表达模式、分离某一特定
34、研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的基因是十分有用的。 通常是将通常是将cDNA库与核基因库配合使用库与核基因库配合使用，以便既，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。基因工程和基因组学优秀课件2. 2. 筛选基因库：筛选基因库： 根据待选基因相关信息根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件确定筛选方法和条件从基因库中筛选、分离基因。从基因库中筛选、分离基因。多数方法多数方法是利用一段核苷酸序列是利用一段核苷酸序列(DNA(DNA、cDNAcDNA或寡聚核或寡聚核苷酸苷酸) )或抗体或抗体作探针作探针(Probe)(Pro
35、be)，用放射性同位素或非放，用放射性同位素或非放射性同位素射性同位素标记探针标记探针 筛选筛选基因库。基因库。基因工程和基因组学优秀课件筛库过程：筛库过程： 将转化或转染后菌落将转化或转染后菌落印影在滤膜上印影在滤膜上用碱裂解、用碱裂解、中和后洗涤烘干中和后洗涤烘干再用目再用目的基因的放射性的基因的放射性DNADNA或或mRNAmRNA作探针进行杂交放射作探针进行杂交放射性自显影性自显影凡凡黑点菌落即黑点菌落即为阳性克隆。为阳性克隆。基因工程和基因组学优秀课件. . 限制性酶图谱：限制性酶图谱：构建构建阳性克隆阳性克隆的限制性酶图谱的限制性酶图谱 根据同源性分析，根据同源性分析，可了解阳性克
36、隆片段的可了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置酶切位点及相对位置 用于用于进一步进一步亚克隆或亚克隆或同已知的其它同已知的其它序列比较序列比较。3. 3. 阳性克隆的分析与鉴定：阳性克隆的分析与鉴定：从基因库中筛选出的阳性克隆从基因库中筛选出的阳性克隆 分析、鉴定分析、鉴定 得到得到目的基因。目的基因。基因工程和基因组学优秀课件图示：图示：一个一个15kb DNA15kb DNA片段的片段的限制性酶图谱构建方法限制性酶图谱构建方法。 将阳性克隆将阳性克隆DNADNA分装分装3 3个管个管中中酶切酶切DNADNA琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳泳 溴化乙锭染色溴化乙锭染色紫外灯紫外灯下见到下见到DNA
37、DNA带。带。 从凝胶电泳结果分析：从凝胶电泳结果分析：模式模式就是这个就是这个15kb DNA15kb DNA片片段用上述两种酶酶切后的段用上述两种酶酶切后的限限制性酶图谱制性酶图谱。 基因工程和基因组学优秀课件 用类似的方法，将不同用类似的方法，将不同DNADNA用限制性酶消化，根用限制性酶消化，根据其据其产生的多型性产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性即限制性酶片段长度的多型性来分析来分析DNADNA水平的变异程度，水平的变异程度，以以RFLPRFLP作为分子标记作为分子标记进行基因组图谱分析。进行基因组图谱分析。基因工程和基因组学优秀课件. . 核酸分子杂交：核酸分子杂交：Sout
38、hernSouthern杂交分析：杂交分析：由英国的由英国的SouthernSouthern发明发明(1975) (1975) ，一种，一种将将琼脂糖中的琼脂糖中的DNADNA转移到转移到尼龙膜尼龙膜进行进行DNADNA分子杂交分子杂交分析的方法。分析的方法。筛选基因库得到筛选基因库得到阳性克隆阳性克隆后后将限制性酶酶切与将限制性酶酶切与SouthernSouthern杂杂交结合交结合绘制限制性酶图谱。绘制限制性酶图谱。基因工程和基因组学优秀课件NorthernNorthern杂交分析：杂交分析：与与SorthernSorthern杂交相同的原理和程序。杂交相同的原理和程序。用于分析克隆的基因
39、在某一细胞或组织的转录水平，用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检检测测mRNAmRNA的存在的存在。Western 杂交分析：杂交分析：用于用于蛋白质蛋白质的分析的分析。基因工程和基因组学优秀课件. . 核酸序列测定核酸序列测定克隆后的克隆后的DNADNA片段进行核酸序列测定片段进行核酸序列测定后后确定该确定该DNADNA片段序列的正确性。片段序列的正确性。 一般采用一般采用Sanger(1977)Sanger(1977)发明的发明的双脱氧核糖核酸终止法双脱氧核糖核酸终止法测定核酸测定核酸序列。序列。基因工程和基因组学优秀课件在在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记
40、：双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：基因工程和基因组学优秀课件. . 核酸序列分析：核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。机软件或生物学实验进一步分析。（1 1）同源性比较同源性比较 将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同比较基因间的同源性源性，将序列发送到将序列发送到BlastBlast等等DNA DataDNA Data数据库进行比较。数据库进行比较。核酸序列分析方法：核酸序列分析方法： 对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能对于那些
41、同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。还要进行基因功能性研究。 一个一个ORFORF是一条能编码一条多肽链的是一条能编码一条多肽链的DNADNA序列，具有翻译序列，具有翻译起始信号和终止信号等。起始信号和终止信号等。（2）分析核酸序列的）分析核酸序列的阅读框架阅读框架基因工程和基因组学优秀课件PCRPCR反应三个步聚反应三个步聚( (一个循环一个循环) )：1. 1. 变性变性：94-9594-95使模板使模板DNADNA双链变成单链；双链变成单链；2. 2. 复性复性：50-7050-70下，引物分别与互补的下，引物分别与互补的DNADNA单链互补配对；单链互补配对；3
42、. 3. 延伸延伸：在引物的引导和在引物的引导和TaqTaq酶作用下，于酶作用下，于72 72 下合成模板下合成模板DNADNA的互补链。的互补链。PCRPCR反应通常有反应通常有25-3525-35个循环个循环，一般可，一般可扩扩增增5kb5kb左右的片段。左右的片段。由该技术衍生出一些新的技术，如由该技术衍生出一些新的技术，如RAPDRAPD和和AFLPAFLP等技术。等技术。、PCRPCR扩增基因：扩增基因：聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase (polymerase chainReactionchainReaction，PCR)PCR)可以体外快速扩增可以体外快速扩增DN
43、ADNA。美国。美国Mullis(1986)Mullis(1986)发明，发明，是现代生是现代生物学发展史上的一个物学发展史上的一个里程碑里程碑。基因工程和基因组学优秀课件、人工合成基因：、人工合成基因：根据已知的基因或氨基酸序列，根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法将化学合成寡核苷酸的方法与与酶促合成酶促合成DNADNA的方法结合的方法结合起来起来可很快地人工合成基因。可很快地人工合成基因。如如SOE-PCRSOE-PCR技术技术可扩增出可扩增出完整的基因序列。完整的基因序列。1. 1. 化学合成的寡聚核苷酸化学合成的寡聚核苷酸(80-100(80-100个个核苷酸核苷酸)
44、)通过通过SOESOE将单链部分补齐；将单链部分补齐；2. 2. PCRPCR扩增扩增DNADNA片段；片段；3. DNA3. DNA变性；变性；4. 4. 两个单链部分经两个单链部分经SOESOE补齐补齐双链；双链；5. PCR5. PCR扩增扩增DNADNA，利用多级，利用多级SOE-PCR SOE-PCR 扩增出完整的基因。扩增出完整的基因。基因工程和基因组学优秀课件目前，目前，基因工程研究发展迅速基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。，已取得一系列重大突破。基因工程技术已基因工程技术已广泛用于广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大
45、的财富。法学等领域，为人类创造了巨大的财富。五、基因工程的应用：五、基因工程的应用：具有生长激素具有生长激素的转基因鼠的转基因鼠基因工程和基因组学优秀课件转基因的方法和技术转基因的方法和技术 ：基因工程和基因组学优秀课件、基因工程工业：、基因工程工业： 最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌在细菌中表达人的胰岛素中表达人的胰岛素(1982)(1982)。 胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。 现已在细菌中
46、生产现已在细菌中生产1010多种多种医药产品医药产品，如表皮生长如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝类工程疫苗因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝类工程疫苗等。等。基因工程和基因组学优秀课件 有些有些真核细胞真核细胞的蛋白质需要的蛋白质需要糖基糖基化等修饰加工化等修饰加工以后才具有活性，而细以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统真核生物细胞更适合于表达真核生真核生物细胞更适合于表达真核生物蛋白质基因。物蛋白质基因。 目前，目前，酵母菌酵母菌、植物悬浮细胞植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞植株和动物培养细胞成功地均应用于成功地均应用于表达表达
47、外源蛋白。外源蛋白。基因工程应用大肠杆菌基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素生产人类生长激素基因工程和基因组学优秀课件、植物基因工程：、植物基因工程：植物基因转化植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。 许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。应用最多的为术也得到不断发展和完善。应用最多的为农杆菌转化法农杆菌转化法和和基因枪转化法基因枪转化法。抗虫稻抗虫稻对照对照基因工程和基因组学优秀课件1. 1. 根癌
48、农杆菌转化技术：根癌农杆菌转化技术： 根癌农杆菌根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的介导的植物转化是应用得最早而广泛的植物转化方法（双子叶植物、单子叶植物）。植物转化方法（双子叶植物、单子叶植物）。过程：过程：将目的基因与启动子（花椰菜病毒将目的基因与启动子（花椰菜病毒35S35S）及终止子）及终止子组成嵌合组成嵌合DNADNA分子分子插入到插入到TiTi衍生质粒衍生质粒RBRB与与LBLB内构成内构成重组重组质粒质粒 再转化到再转化到农杆菌农杆菌细胞细胞 将重组农杆菌去将重组农杆菌去感染感染植物植物细胞细胞 使质粒的部分使质粒的部分DNADNA包括目的基因，整合到植物染色包括目的基因
49、，整合到植物染色体，实现体，实现遗传转化。遗传转化。 利用从利用从抗草甘磷抗草甘磷(glyphosate) (glyphosate) E. coliE. coli中分离克隆的中分离克隆的EPSPEPSP合成酶基因，合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物已培育出高抗除草剂转基因植物。基因工程和基因组学优秀课件 基因枪介导的植物转化是通过高压气体为动力，基因枪介导的植物转化是通过高压气体为动力，高速高速发射包裹有重组发射包裹有重组DNADNA的的金属颗粒金属颗粒将目的基因直接将目的基因直接导入植物细胞，并整合到染色体上的方法。导入植物细胞，并整合到染色体上的方法。2. 2. 基因枪转化技术：基因
50、枪转化技术： 转化的载体多数是以转化的载体多数是以pUCpUC系列质粒系列质粒为基础构建的。为基础构建的。它们通常具有它们通常具有细菌复制原点细菌复制原点及及抗性选择标记，抗性选择标记，具有可在具有可在植物中表达的启动子终止子及调控序列，以及植物抗性植物中表达的启动子终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记选择标记( (如除草剂、潮霉素等抗性如除草剂、潮霉素等抗性) )。基因工程和基因组学优秀课件几种基因枪类型的几种基因枪类型的共同特点：共同特点：是用一种是用一种动力系统动力系统将金属微将金属微粒和包被粒和包被DNADNA导入受体细胞或组织进行转化。导入受体细胞或组织进行转化。1. 1. 位于高
51、压气体桶底部位于高压气体桶底部的的爆破片爆破片；2. 2. 载有重组载有重组DNADNA和金属微和金属微粒的粒的大载体大载体；3. 3. 阻挡板阻挡板； 4. 4. 包裹有重组包裹有重组DNADNA的的金属微粒金属微粒；5. 5. 被轰击被轰击样品样品。基因工程和基因组学优秀课件、转基因动物、转基因动物: :与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。转基因动物：转基因动物：目的基因目的基因+ +载体载体重组重组DNADNA微量注射法微量注射法将重组将重组DNADNA导入受体合子细胞核中导入受体合子细胞核中遗传转化。遗传转化。如：如：利用转基因羊，大量表
52、达人类的利用转基因羊，大量表达人类的抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶。可分泌人类生长可分泌人类生长因子因子的转基因羊的转基因羊“Polly”Polly”( (下图下图) )。(Wilmut(Wilmut等，等，Nature Nature 385, 1997)385, 1997)基因工程和基因组学优秀课件受精卵细胞注射法受精卵细胞注射法转基因牛：受精卵注射法转基因牛：受精卵注射法基因工程和基因组学优秀课件人类生长激素人类生长激素转基因猪转基因猪同胞鼠对照同胞鼠对照转移有人类生长激转移有人类生长激素转基因鼠素转基因鼠基因工程和基因组学优秀课件、遗传疾病诊断：、遗传疾病诊断： 利用重组利用重组DNADNA技术进
53、行遗传疾病诊断，技术进行遗传疾病诊断，是直接从是直接从DNADNA即基因水平进行诊断即基因水平进行诊断准确度高，速度快。准确度高，速度快。进行进行产前诊断产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。，分析胎儿是否有遗传疾病。如：镰刀性贫血病的诊断如：镰刀性贫血病的诊断基因工程和基因组学优秀课件、基因治疗：、基因治疗： 利用基因工程技术，将利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到有遗特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中传缺陷患者的基因组中治疗遗传疾病，通常叫做治疗遗传疾病，通常叫做基因基因治疗治疗(gene therapy)(gene therapy)。方法：方法：利用利用减毒的病毒减毒的病毒DN
54、ADNA作载体作载体(retro virus DNA(retro virus DNA) )构建重组构建重组DNADNA分子分子用病毒包装物包装后形成的减毒病用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞毒感染患者的细胞将正常基因整合到染色体上。将正常基因整合到染色体上。基因工程和基因组学优秀课件例如，例如，用用漠洛尼氏鼠漠洛尼氏鼠白血病病毒白血病病毒(MLV)(MLV)改造而成的改造而成的retro retro virusvirus载体，已用于治疗严重载体，已用于治疗严重综合免疫缺陷综合免疫缺陷(SCID)(SCID)。SCIDSCID是由于是由于腺苷脱氢酶基因腺苷脱氢酶基因(adenosin
55、e deaminase(adenosine deaminase，ADA)ADA)突变突变引起的，患者无任何免疫功能。引起的，患者无任何免疫功能。方法：方法：将将ADAADA基因导入到基因导入到MLV retrovirus MLV retrovirus 载体中载体中取代取代该病毒该病毒DNADNA中的中的三个基因结构三个基因结构(gag(gag、polpol、env)env)将重组将重组后的病毒去感染后的病毒去感染T T细胞，使细胞，使ADAADA基因整合到基因整合到T T细胞的染色细胞的染色体中体中实现基因治疗的目的。实现基因治疗的目的。基因工程和基因组学优秀课件20002000年法国年法国F
56、ischerFischer用该方用该方法治愈患有法治愈患有SCIDSCID遗传病的两遗传病的两个婴儿个婴儿(8(8个月和个月和1111个月个月) ) 。这一工作被认为是这一工作被认为是2020世纪人世纪人类基因治疗上的重大突破。类基因治疗上的重大突破。基因工程和基因组学优秀课件、DNADNA芯片芯片(DNA chips) (DNA chips) ：核酸分子杂交的原理和方法核酸分子杂交的原理和方法+ +半导体技术结合半导体技术结合发展形成的发展形成的一门新技术。这一技术可使许多分子杂交反应同时进行。一门新技术。这一技术可使许多分子杂交反应同时进行。DNADNA芯片技术：芯片技术：在面积不大在面积
57、不大( (如如2cm2cm) )的基片表面分成不同小格的基片表面分成不同小格有序地有序地点阵排列于一定位置可寻址的核苷酸分子点阵排列于一定位置可寻址的核苷酸分子将将待分析核苷待分析核苷酸酸分子标记分子标记( (如用荧光如用荧光) )，变性成单链与芯片上序列相同的变性成单链与芯片上序列相同的核苷酸分子杂交核苷酸分子杂交与芯片上序列不同的核酸分子被洗掉与芯片上序列不同的核酸分子被洗掉利用高精度的激光扫描仪记录分子已杂交的荧光信号利用高精度的激光扫描仪记录分子已杂交的荧光信号计计算机软件分析。算机软件分析。基因工程和基因组学优秀课件DNADNA芯片的芯片的基片：基片：玻璃、硅片或尼龙等。玻璃、硅片或
58、尼龙等。应用领域：应用领域：基因多态性检测基因多态性检测（如单核苷酸多态性筛选（如单核苷酸多态性筛选single single nucleotidePolymorphisms nucleotidePolymorphisms ，SNPs) SNPs) ；基因表达分析基因表达分析（不同细胞和不同组织的（不同细胞和不同组织的RNARNA群体比较）；群体比较）； 克隆选择及文库筛选克隆选择及文库筛选（如（如cDNAcDNA文库）；文库）；基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等。基因工程和基因组学优秀课件第二节基因组学第二节基因组学基因工程和基因组学优秀课件基因组学基因组学
59、(genomics ) (genomics ) ：遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要主要研究生物体内基因组的分子特征研究生物体内基因组的分子特征。研究对象：研究对象： 以以整个基因组整个基因组为研究单位，而为研究单位，而不以单个基因不以单个基因为单位作为为单位作为研究对象。研究对象。研究目标研究目标：认识认识基因组的结构、功能和进化；基因组的结构、功能和进化； 阐明阐明整个基因组所包含的遗传信息和相互关系；整个基因组所包含的遗传信息和相互关系； 充分充分利用利用有效资源，预防和治疗人类疾病。有效资源，预防和治疗人类疾病。基因工程和基因组
60、学优秀课件重要组成部分：重要组成部分：基因组计划基因组计划(genome project)(genome project)大体上可分为：大体上可分为： 构建构建基因组的基因组的遗传图谱遗传图谱； 构建构建基因组的基因组的物理图谱物理图谱； 测定测定基因组基因组DNADNA的的全部序列全部序列； 绘制绘制基因组的基因组的转录本图谱转录本图谱； 分析分析基因组的基因组的功能功能。基因工程和基因组学优秀课件基因组计划研究开始于基因组计划研究开始于19901990年年。 美国美国启动被誉为启动被誉为“人体阿波罗计划人体阿波罗计划”的的“人类基人类基因组计划因组计划”，投资，投资3030亿美元，历时亿美
61、元，历时1515年年测定测定人类基人类基因组的因组的3030亿个核苷酸对亿个核苷酸对的排列次序的排列次序构建构建高分辨率的高分辨率的人类基因组遗传图谱和物理图谱人类基因组遗传图谱和物理图谱发展发展生物信息学。生物信息学。 在美国提出人类基因组计划后，在美国提出人类基因组计划后，日本日本和和中国中国分别分别于于19911991年和年和19921992年启动了年启动了“水稻基因组计划水稻基因组计划”。基因工程和基因组学优秀课件 由于以人类为对象的研究实际上受到诸多限制，由于以人类为对象的研究实际上受到诸多限制，也受也受伦理学伦理学的约束，所以人类基因组计划还将对有关的约束，所以人类基因组计划还将对
62、有关的模式生物，如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟的模式生物，如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥等进行相应的研究，为南芥等进行相应的研究，为研究人类基因组研究人类基因组的战略提的战略提供重要的供重要的依据。依据。基因工程和基因组学优秀课件20022002年年4 4月月5 5日日ScienceScience以以1414页的篇幅刊登和宣布中国科学家独立页的篇幅刊登和宣布中国科学家独立绘制完成水稻基因组草图序列（绘制完成水稻基因组草图序列（总数：总数：4.64.6亿亿），是继人类基因组工），是继人类基因组工作草图（作草图（20012001年春年春）之后完成测定的最大基因组。）之后完成测定的最大基
63、因组。（20012001年年1212月月1414日日美、英等国科学家宣布绘制出拟南芥基因组的完整图谱）美、英等国科学家宣布绘制出拟南芥基因组的完整图谱）材料：材料：籼稻。籼稻。完成单位：完成单位：华大基因研究中心，中科院遗传与发育生物学研究所等华大基因研究中心，中科院遗传与发育生物学研究所等1212个单位，个单位，20012001年年7 7月启动。月启动。水平：水平：水稻基因组中的总基因数约为水稻基因组中的总基因数约为46022556154602255615个（个（接近人类基因数接近人类基因数的两倍的两倍），），工作框架图序列已覆盖水稻工作框架图序列已覆盖水稻整个基因组整个基因组9292以上的
64、基因以上的基因。方法：方法：“鸟枪射击法鸟枪射击法”，利用国产曙光，利用国产曙光20002000、曙光、曙光30003000超级计算机超级计算机(1000(1000亿次亿次/ /秒秒) )对随机对随机DNADNA碎片进行排序和组装，确定其在基因组的正确位置。碎片进行排序和组装，确定其在基因组的正确位置。计划：计划：功能基因分析和蛋白质研究。功能基因分析和蛋白质研究。基因工程和基因组学优秀课件20022002年年1111月月2121日日NatureNature宣布中国科学家独立绘制完成宣布中国科学家独立绘制完成粳稻基因粳稻基因组第四号染色体组第四号染色体精确测序图精确测序图，使我国对国际水稻基因
65、组测序计划贡，使我国对国际水稻基因组测序计划贡献率达到献率达到10%10%。材料：材料：粳稻粳稻“日本晴日本晴”。完成单位：完成单位：中科院国家基因研究中心等中科院国家基因研究中心等4 4家单位。家单位。整个国际水稻基因组计划始于整个国际水稻基因组计划始于19981998年年，日本、美国、中国、法国，日本、美国、中国、法国等国家和地区参加。等国家和地区参加。水平：水平：第四号染色体中的第四号染色体中的总碱基数目为总碱基数目为0.350.35亿碱基对亿碱基对，覆盖了该染覆盖了该染色体全长序列色体全长序列9898的区域，只剩下的区域，只剩下7 7个小空洞，测序碱基序列的精确个小空洞，测序碱基序列的
66、精确度达到度达到99.99%99.99%。完整测定的。完整测定的着丝粒序列着丝粒序列在高等生物中属于首次。在高等生物中属于首次。计划：计划：对预测鉴定的对预测鉴定的46584658个个基因作进一步分析、着丝粒功能等研究。基因作进一步分析、着丝粒功能等研究。基因工程和基因组学优秀课件一、基因组图谱的构建一、基因组图谱的构建基因工程和基因组学优秀课件解决方法：解决方法：大规模序列测定前，构建大规模序列测定前，构建基因组图谱基因组图谱可作为序可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便锚定测知的核酸序列列测定中制定测序方案的依据，以便锚定测知的核酸序列在染色体上的位置。在染色体上的位置。基因组中核苷酸顺
67、序的测定方法：基因组中核苷酸顺序的测定方法：小基因组小基因组物种常用物种常用鸟枪法测序法鸟枪法测序法。大基因组测序存在两个问题：大基因组测序存在两个问题：片段数片段数(n)(n)庞大，庞大，片段间连接和装片段间连接和装配非常复杂；配非常复杂；基因组中相同或相似的重复序列基因组中相同或相似的重复序列在连接和装配时在连接和装配时容易出错。容易出错。基因工程和基因组学优秀课件测序方法：测序方法：克隆连续序列法克隆连续序列法(clone (clone contigcontig) )：将基因组将基因组DNADNA切割长度切割长度为为0.1Mb-1Mb0.1Mb-1Mb的大片段的大片段克隆到克隆到YACY
68、AC或或BACBAC载体上载体上分别测定分别测定单个克隆的序列单个克隆的序列再装配连接成连续的再装配连接成连续的DNADNA分子。分子。定向鸟枪射击法定向鸟枪射击法(directed shotgun)(directed shotgun)：以基因组图谱中以基因组图谱中标记为依据标记为依据测序装配和构建不同测序装配和构建不同DNADNA片段的序列。片段的序列。基因组图谱根据构建的途径，可分为两种：基因组图谱根据构建的途径，可分为两种：遗传图谱：遗传图谱：根据根据遗传性状遗传性状( (如已知基因位点、功能未知的如已知基因位点、功能未知的DNADNA标记、可鉴别的表型性状标记、可鉴别的表型性状) )的
69、的分离比例分离比例将其定位在基因将其定位在基因组中，构建相应的连锁图谱。组中，构建相应的连锁图谱。物理图谱：物理图谱：将将各种标记各种标记直接定位直接定位在基因库中的某一点上。在基因库中的某一点上。 基因工程和基因组学优秀课件、遗传图谱的构建：、遗传图谱的构建：1.1.图谱标记：图谱标记：可用基因和可用基因和DNADNA作为作为可鉴别的标记可鉴别的标记(mark)(mark)。缺点：缺点：基因数目有限、所构建的遗传图谱不详细、标记间基因数目有限、所构建的遗传图谱不详细、标记间的遗传距离较大。的遗传距离较大。. DNA. DNA标记：标记：每种生物每种生物DNADNA具有稳定性，具有稳定性，DN
70、ADNA本身可作为构建遗传本身可作为构建遗传图谱的标记，主要有以下图谱的标记，主要有以下3 3种类型：种类型：. . 限制性内切酶多型性限制性内切酶多型性: :. 简单序列长度多型性简单序列长度多型性. 单核苷酸多型性单核苷酸多型性. . 基因标记基因标记：基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记，态、生化等表型性状作标记， 基因工程和基因组学优秀课件2 2、遗传图谱的构建：、遗传图谱的构建：. . 人类基因组遗传图谱的构建：人类基因组遗传图谱的构建：家系分析法：家系分析法：分析分析8 8个家系个家系134134个个成
71、员成员(186(186个减数分裂个减数分裂) ) 根据根据52645264个个STR(STR(简单重复序列简单重复序列) )标记标记绘制而成（对于绘制而成（对于X X染色体，另外染色体，另外利用利用1212家系的家系的170170个成员分析个成员分析(105(105个减数分裂个减数分裂) )）将将52645264个个标记定位在标记定位在23352335个位点个位点构建的构建的人类基因组遗传图谱密度为人类基因组遗传图谱密度为每个每个标记标记599 Kb599 Kb。基因工程和基因组学优秀课件. . 植物基因组遗传图谱的构建：植物基因组遗传图谱的构建：. . 选择亲本：选择亲本：要求亲缘关系远，遗
72、传差异性大，亲本间分子标记具要求亲缘关系远，遗传差异性大，亲本间分子标记具有多态性。有多态性。 . . 产生构图群体：产生构图群体：配制杂交组合，配制杂交组合，建立分离群体：建立分离群体：利用回交或三交利用回交或三交( (复交复交) )产生的后代群体。产生的后代群体。单交组合产生的单交组合产生的F2F2；衍生的衍生的F3F3、F4F4家系；家系；由连续多代自交或姊妹交产生的由连续多代自交或姊妹交产生的重组近交系重组近交系( (recombinantinbredrecombinantinbred LinesLines，RILRIL) )；. .通过单倍体加倍而成的双倍体通过单倍体加倍而成的双倍体
73、(doubled haploids(doubled haploids，DHDH) )；. .基因工程和基因组学优秀课件. . 遗传标记的染色体定位：遗传标记的染色体定位：有有单体单体、三体三体、代换系代换系与与附加系附加系分析等方法，分析等方法，依据染色依据染色体剂量的差异体剂量的差异将遗传标记定位在特定染色体上。即当将遗传标记定位在特定染色体上。即当供体材料总供体材料总DNADNA等量时，等量时，DNADNA杂交带的信号强弱与该标记杂交带的信号强弱与该标记位于的染色体剂量成正比。位于的染色体剂量成正比。. . 标记间的连锁分析：标记间的连锁分析：通过分析分离群体内双亲间有通过分析分离群体内双
74、亲间有多态性的遗传标记间的连多态性的遗传标记间的连锁交换情况和趋于协同分离锁交换情况和趋于协同分离的程度的程度即可确定标记间的即可确定标记间的连锁关系和遗传距离。连锁关系和遗传距离。基因工程和基因组学优秀课件( (二二) )、物理图谱的构建：、物理图谱的构建：1. 1. 构建物理图谱的原因：构建物理图谱的原因：. . 遗传图谱的分辩率有限：遗传图谱的分辩率有限：. . 遗传图谱的精确性不高：遗传图谱的精确性不高：基因工程和基因组学优秀课件2. 2. 构建物理图谱的三条途径：构建物理图谱的三条途径：. 限制性酶图谱：限制性酶图谱：利用限制性内切酶绘制图谱，对于利用限制性内切酶绘制图谱，对于DNA
75、DNA分子长度分子长度50Kb50Kb50Kb的的DNADNA分子，可选用稀有切点内切酶酶分子，可选用稀有切点内切酶酶切切DNADNA。. . 荧光原位杂交荧光原位杂交是另一物理图谱构建方法是另一物理图谱构建方法通过荧光标记的探针与通过荧光标记的探针与DNADNA分子杂分子杂交，使染色体上的交，使染色体上的杂交信号（杂交信号（位置就是探针位置就是探针DNADNA在染色体上的在染色体上的图谱位点图谱位点）在显微镜下可直接观察）在显微镜下可直接观察。.序列标签位点：序列标签位点：利用某一利用某一已知序列为标签的位点已知序列为标签的位点(sequence tagged sites(sequence
76、tagged sites，STSSTS) )作探针，与基因组作探针，与基因组DNADNA杂交，绘制物理图谱。杂交，绘制物理图谱。基因工程和基因组学优秀课件3. 3. 人类基因组物理图谱人类基因组物理图谱: : 人类基因组序列开始测定时，已有人类基因组序列开始测定时，已有4545万个万个ESTEST，其中，其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到4962549625个，各个，各代表一个基因。再从中筛选出代表一个基因。再从中筛选出3 3万个万个ESTEST、二个、二个辐射杂交系辐射杂交系库库（分别有（分别有8383和和9393个细胞株）、一个有个细胞株）、一
77、个有3200032000个克隆的个克隆的YACYAC文库用于构建图谱文库用于构建图谱。结果构建的物理图谱的密度为结果构建的物理图谱的密度为每个标记每个标记183kb183kb，ESTEST分布结分布结果表明基因在染色体上的排列是不均匀的。果表明基因在染色体上的排列是不均匀的。将上述将上述遗传图谱遗传图谱及其它及其它物理图谱物理图谱整合整合构成更加完整的人类构成更加完整的人类其因组图谱，其因组图谱，作为基因组序列测定的框架和分析的依据。作为基因组序列测定的框架和分析的依据。基因工程和基因组学优秀课件二、基因组图谱的应用：二、基因组图谱的应用： 基因组图谱中除了构建遗传图谱和物理图谱外，还基因组图
78、谱中除了构建遗传图谱和物理图谱外，还可进一步可进一步根据标记类型根据标记类型细分为不同的称谓。细分为不同的称谓。如如RFLPRFLP图谱、图谱、RAPDRAPD图谱、图谱、AFLPAFLP图谱等，目前已在拟南芥、图谱等，目前已在拟南芥、番茄、水稻等番茄、水稻等3030多种植物中构建了基因图谱多种植物中构建了基因图谱。基因图谱的构建除了进行测序之外，还有许多的用途。基因图谱的构建除了进行测序之外，还有许多的用途。基因工程和基因组学优秀课件1. 1. 基因定位：基因定位： 借助基因组图谱，可使基借助基因组图谱，可使基因定位在精度、深度、广度等因定位在精度、深度、广度等方面有极大的提高。已陆续在方面
79、有极大的提高。已陆续在各种农作物上定位了许多重要各种农作物上定位了许多重要农艺性状农艺性状和和经济性状经济性状的基因，的基因，在复杂在复杂数量性状位点数量性状位点(quantitative trait loci(quantitative trait loci，QTL) QTL) 定位分析方面，也取得了定位分析方面，也取得了很大进展。很大进展。基因工程和基因组学优秀课件2. 2. 基因组比较分析：基因组比较分析： 已经在已经在禾本科禾本科玉米、水稻、高梁、大麦、小麦和黑麦，玉米、水稻、高梁、大麦、小麦和黑麦，茄科的蕃茄、胡椒、马铃薯，茄科的蕃茄、胡椒、马铃薯，十字花科十字花科拟南芥、甘蓝、花拟南
80、芥、甘蓝、花椰菜、油菜等做了遗传图谱比较分析，从分子水平了解物椰菜、油菜等做了遗传图谱比较分析，从分子水平了解物种间同源性，研究种间同源性，研究基因组的进化基因组的进化和和染色体的演变染色体的演变。3. 3. 标记辅助选择标记辅助选择(marker-assisted selection MAS)(marker-assisted selection MAS)： 饱和基因组图谱可用来确定与任何一个目的基因饱和基因组图谱可用来确定与任何一个目的基因紧密连紧密连锁的分子标记锁的分子标记根据图谱间接选择目的基因，根据图谱间接选择目的基因，可降低连锁累可降低连锁累赘，加速目的基因的转移与利用，提高回交育种
81、的效率。赘，加速目的基因的转移与利用，提高回交育种的效率。基因工程和基因组学优秀课件4. 4. 基因的克隆与分离：基因的克隆与分离： 根据饱和的基因组图谱，可以找到根据饱和的基因组图谱，可以找到一个与目的基因一个与目的基因紧密连锁的分子标记紧密连锁的分子标记，作为，作为染色体步行染色体步行(chromosome (chromosome walking)walking)起始点起始点进行基因的克隆和分离，此法亦称图进行基因的克隆和分离，此法亦称图位克隆法位克隆法(map-based cloning)(map-based cloning)，为基因产物未知的基因，为基因产物未知的基因克隆提供了捷径。克
82、隆提供了捷径。基因工程和基因组学优秀课件 是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上上进一步研究全基因组的进一步研究全基因组的基因功能基因功能、基因之间、基因之间相互关相互关系系和和调控机制调控机制为主要内容的学科。为主要内容的学科。 目前人类基因组计划已测定了人类基因组序列中目前人类基因组计划已测定了人类基因组序列中85%85%以上的核苷酸序列，将计划完成以上的核苷酸序列，将计划完成全序列测定全序列测定的时间从的时间从20052005年提前到年提前到20032003年。年。20012001年年4 4月月2626日，公布了人类基因序列日，公布了人
83、类基因序列框架草图。框架草图。三、后基因组学三、后基因组学(post-genomics ) (post-genomics ) ：基因工程和基因组学优秀课件自从自从19961996年酵母菌基因组全序列测定年酵母菌基因组全序列测定以来，全世界已有以来，全世界已有10001000多个实验室、多个实验室、50005000多名科学家从事酵母菌后基因组多名科学家从事酵母菌后基因组学的研究，共发表论文学的研究，共发表论文70007000多篇，鉴定多篇，鉴定10601060个新基因的个新基因的功能，但仍然还有约功能，但仍然还有约16001600个阅读框架的功能不清楚。个阅读框架的功能不清楚。后基因组学主要技术
84、：后基因组学主要技术： DNADNA微列阵技术；微列阵技术；蛋白质组学；蛋白质组学；酵母菌双杂交系统；酵母菌双杂交系统；生物信息学等技术。生物信息学等技术。基因工程和基因组学优秀课件1. DNA1. DNA微列阵微列阵(DNA microarrays) (DNA microarrays) ：是利用是利用DNADNA芯片技术芯片技术同时进行大量分子杂交，分析比较同时进行大量分子杂交，分析比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从核酸核酸水平水平分析基因表达模式。分析基因表达模式。基因工程和基因组学优秀课件2. 2. 蛋白质组学蛋白质组学(pr
85、oteomics ) (proteomics ) ： 是是从蛋白质水平来研究基因组的基因表达从蛋白质水平来研究基因组的基因表达分析基因组的蛋白质类型、数量、空间结构变异分析基因组的蛋白质类型、数量、空间结构变异以及相互作用的机制。以及相互作用的机制。蛋白质组学比基因组学更为复杂蛋白质组学比基因组学更为复杂. .基因工程和基因组学优秀课件真核生物的基因表达受转录因子控制，转录因子需与启真核生物的基因表达受转录因子控制，转录因子需与启动子区域的动子区域的DNADNA结合结合并激活并激活RNARNA聚合酶转录。聚合酶转录。 转录因子具有转录因子具有DNADNA结合结合及及激活转录激活转录两功能两功能
86、，分别由不同，分别由不同区域完成，而且将这两部分区域完成，而且将这两部分分割成两个片段分割成两个片段后仍由互作后仍由互作能装配成一个完全有功能的转录因子。能装配成一个完全有功能的转录因子。基于这一特点，设计出酵母双杂交系统。基于这一特点，设计出酵母双杂交系统。 是利用酵母菌同一个细胞中共同表达不同蛋白质，以是利用酵母菌同一个细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间互作鉴定蛋白质之间互作的一种分析方法。的一种分析方法。3. 3. 酵母菌双杂交系统酵母菌双杂交系统(two hybrid-systems) (two hybrid-systems) ：基因工程和基因组学优秀课件4. 4. 生物信息学
87、生物信息学(bioinformatics ) (bioinformatics ) ： 是一种用是一种用计算机计算机贮存原始资料，分析生物信息，将贮存原始资料，分析生物信息，将DNADNA芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学信息的学科。信息的学科。 生物信息学是生物信息学是现代生物技术与计算机科学的结合现代生物技术与计算机科学的结合，收集、加工和分析生物资料和信息。收集、加工和分析生物资料和信息。基因工程和基因组学优秀课件生物信息学生物信息学是在未来生命科学中起关键作用的学科之一。是在未来生命科学中起关键作用的学科之一。应用生物信息学应用生
88、物信息学可以将来不同的基因组理论和应用综合并标可以将来不同的基因组理论和应用综合并标准化，利用大量的生物信息资料来准化，利用大量的生物信息资料来了解了解遗传网络系统遗传网络系统、信号信号传递传递及及相互关系相互关系，计算机还可进行一些，计算机还可进行一些生物模拟生物模拟研究。研究。利用生物信息学能够利用生物信息学能够分析分析从微生物、植物以及人类基因组从微生物、植物以及人类基因组序列测定产生的大量资料序列测定产生的大量资料阐明阐明遗传信息。遗传信息。基因工程和基因组学优秀课件1.1.遗传工程：遗传工程：细胞工程中核移植与体细胞克隆技术。细胞工程中核移植与体细胞克隆技术。本章小结本章小结载体条件与限制性内切酶；载体条件与限制性内切酶；目的基因获取与体外重组；目的基因获取与体外重组；转基因技术及其应用；转基因技术及其应用；2.2.基因组学：基因组学：后基因组学：后基因组学：DNADNA芯片技术、蛋白质组学、生物信息学等。芯片技术、蛋白质组学、生物信息学等。基因图谱构建：基因图谱构建：遗传图谱和物理图谱的构建；遗传图谱和物理图谱的构建；基因图谱应用：基因图谱应用：基因定位、比较基因组学、基因定位、比较基因组学、MASMAS、基因克隆；、基因克隆；基因工程和基因组学优秀课件
