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1、1色谱色谱-质谱联用的原理及应用质谱联用的原理及应用2学习目的学习目的u掌握质谱的基本组成、工作原理u掌握常用的质谱术语、常用离子源工作原理u掌握液质联用的定性、定量方法u熟悉液质联用条件优化u了解液质联用的应用3质谱原理简介质谱原理简介 质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。条状
2、图就是我们常见的质谱图。 4简介简介色色谱谱质质谱谱的的在在线线联联用用将将色色谱谱的的分分离离能能力力与与质质谱谱的的定定性性功功能能结结合合起起来来，实实现现对对复复杂杂混混合合物物更更准准确确的的定定量量和和定定性性分分析析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)(GC-MS)和液相色谱和液相色谱质谱联用质谱联用(LC-MS)(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。不同性质的化合物。5液质联用与
3、气质联用的区别液质联用与气质联用的区别: :气质联用仪气质联用仪(GC-MS)(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用液质联用(LC-MS)(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、化合物
4、的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。只能自己建库或自己解析谱图。6NeutralNeutral10101 110102 210103 310104 410105 5Molecular WeightMolecular WeightIonicIonicAnalyte PolarityIonSprayAPCIGC/MS7现代有机和生物质谱进展现代有机和生物质谱进展初期：初期：质谱法通常只能测定分子量质谱法通常只能测定分子量500Da以下的小分子化合以下的小分子化合物
5、。物。20世纪世纪70年代：年代：场解吸（场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子）离子化技术，能够测定分子量高达量高达15002000Da的非挥发性化合物，但重复性差。的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪世纪80年代：年代：快原子质谱法（快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子），能够分析分子量达数千的多肽。量达数千的多肽。电喷雾离子化质谱法（电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（化质谱法（MALDI-MS）蛋白）蛋白-生命科学生命科学8常见术语常见术语9 910常见术语常见术语质荷比质荷比: 离子质量离子质量(以相对原子量单位计以相对原
6、子量单位计)与它所带电荷与它所带电荷(以电子以电子电量为单位计电量为单位计)的比值的比值,写作写作m/Z.峰峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.离子丰度离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度检测器检测到的离子信号强度.基峰基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰基峰.总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子离子；同位素离子11总离子流图总离子流图在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对在选定的质量
7、范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图时间或扫描次数所作的图,也称也称TIC图图.12质量色谱图质量色谱图指定指定某一质量某一质量(或质荷比或质荷比)的离子的离子其强度对时间所作的图。其强度对时间所作的图。利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低测定中最有用的方式。当样品浓度很低时时LC/MS的的TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入量信息，输入M+1或或M+23等数值，观察提取离子的质量色等数值，观察提取离
8、子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映上都能反映出来，确定出来，确定LC条件是否合适，以后进行条件是否合适，以后进行MRM等其他扫描等其他扫描方式的测定时可作为参考。方式的测定时可作为参考。131.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100质量色谱图质量色谱图总离子流图总离子流图14准分子离子准分子离子指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量。液指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是质中
9、最常见的准分子离子峰是M+H+ 或或M-H-。在在ESI中中, 往往生成质量大于分子量的离子如往往生成质量大于分子量的离子如M+1，M+23，M+39，M+18.称准分子离子，表示为称准分子离子，表示为:M+H+，M+Na+等等15碎片离子碎片离子准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关，数目多碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关，数目多表示该分子较容易断裂，丰度高的碎片峰表示该离表示该分子较容易断裂，丰度高的碎片峰表示该离子较稳定，也表示分子比较容易断裂生成该离子。子较稳定，也表示分子比较容易断裂生成该离子。
10、16Ephedrine, MW = 1651717多电荷离子多电荷离子指带有指带有2个或更多电荷的离子，常见于蛋白质或多肽等离子。有个或更多电荷的离子，常见于蛋白质或多肽等离子。有机质谱中，单电荷离子是绝大多数，只有那些不容易碎裂的基机质谱中，单电荷离子是绝大多数，只有那些不容易碎裂的基团或分子结构团或分子结构-如共轭体系结构如共轭体系结构-才会形成多电荷离子。它的存才会形成多电荷离子。它的存在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术，可产生带在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术，可产生带很多电荷的离子，最后经计算机自动换算成单质很多电荷的离子，最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。
11、荷比离子。 18同位素离子同位素离子由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子。由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子。各种元素的同位素各种元素的同位素, ,基本上按照其在自然界的丰度比出现基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中在质谱中, ,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便有很大方便, , 还可利用稳定同位素合成标记化合物还可利用稳定同位素合成标记化合物, ,如如: :氘等标记化合物氘等标记化合物, ,再用质谱法检出这些化合物再用质谱法检出这些化合物, ,在质谱图在质谱图外貌上无变化外貌上无变化, ,只是质量数的位移只是质量数的位移,
12、 ,从而说明化合物结构从而说明化合物结构, ,反应历程等。反应历程等。19有机质谱有机质谱OrganicMassSpectroscopy优点：优点：1.灵敏度高灵敏度高2.测定分子量，确定分子式测定分子量，确定分子式3.分析分析范围广（范围广（气体、液体、固体）气体、液体、固体）4.各种联用技术各种联用技术5.新的电离、检测技术新的电离、检测技术20真空系统真空系统Vacuum System进样系统进样系统Sample Inlet检测器检测器Detector数据处理系统数据处理系统Data System质量分析器质量分析器Mass Analyser离子源离子源Ionization Source
13、一、一、质谱仪的组成质谱仪的组成Components of any Mass Spectrometer2121进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器22真空系统真空系统 质质谱谱仪仪的的离离子子源源、质质量量分分析析器器和和检检测测器器必必须须在在高高真真空空状状态态下下工工作作，以以减减少少本本底底的的干干扰扰，避避免免发发生生不不必必要要的的离离子子- -分分子子反反应应。所所以以质质谱谱反反应应属属于于单单分分子子分分解解反反应应。利利用用这这个个特特点点，我我们们用用液液质质联联用用的的软软电电离离方方式式可可以以得得到到化化合合物物的准分子离子，从而得到分子量。
14、的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵由机械真空泵( (前极低真空泵前极低真空泵) )，扩散泵或分子泵，扩散泵或分子泵( (高真空高真空泵泵) )组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。真空度不够则灵敏度低。23进样系统进样系统把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GCGC，LCLC及接口，加热进样，参考物进样等。及接口，加热进样，参考物进样等。24离子源离子源GC-MS的
15、的EI和和CI源，离子化方式有大气压电离（源，离子化方式有大气压电离（API）（包括）（包括大气压电喷雾电离大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离、大气压化学电离APCI、大气压光电离、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。）与基质辅助激光解吸电离。API采用四极杆或离子阱质量分析器，统称采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。MALDI常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。）。2525质量分析器质量分析器磁质量分析器（磁质量分析
16、器（MagneticSectorAnalyzer） 飞行时间质谱计飞行时间质谱计（timeofflight,TOF）四极四极质量分析器（质量分析器（quadrupolemassanalyzer）离子阱离子阱（iontrap）傅立叶变换离子回旋共振质谱计傅立叶变换离子回旋共振质谱计（Fouriertransformioncyclotronresonance,FT-ICR）26检测接收器检测接收器接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板器、微通道板27数据及供电系统数据及供电系统将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及将接收来的电信号放
17、大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。控制质谱仪个部分工作。从几伏低压到几千伏高压。从几伏低压到几千伏高压。281.质量范围（质量范围（massrange）质谱仪所能测定的离子质荷比的范围。质谱仪所能测定的离子质荷比的范围。四极质谱：四极质谱：1000以内以内离子阱质谱：离子阱质谱：6000飞行时间质谱：飞行时间质谱：无上限无上限二、质谱仪的主要性能指标29292. 分辨率（分辨率（resolution）分辨率分辨率R是指质荷比相邻的两质谱峰的分辨能力。是指质荷比相邻的两质谱峰的分辨能力。若近似等强度的质量分别为若近似等强度的质量分别为M1及及M2的两个相邻峰的两个相邻峰正好正好分开，
18、则分开，则质谱仪的分辨率定义为：质谱仪的分辨率定义为：R = ; 式中式中 M = ; M = M2 -M1M MM1+M223030国际上：国际上：1）R10%：两峰间的峰谷高度为峰高的：两峰间的峰谷高度为峰高的10%时的测定值；时的测定值；2）一般难以找到两个质量峰等高，且重叠的谷高正好等于峰高的）一般难以找到两个质量峰等高，且重叠的谷高正好等于峰高的10%，则定义：，则定义：R= ;式中式中a为其中一峰的峰高为其中一峰的峰高5%处的峰宽处的峰宽;b为相邻两峰的中心距离为相邻两峰的中心距离M Mb a3131低分辨率质谱仪：低分辨率质谱仪： R 50 1）的分子离子峰所需的样品）的分子离子
19、峰所需的样品量。量。3333质谱图质谱图横坐标：质荷比横坐标：质荷比 (m/z)纵坐标：纵坐标：相对丰度相对丰度(最强峰的强度定为最强峰的强度定为100%) 苯乙酮的质谱图苯乙酮的质谱图 3434三、三、离子源离子源（Ionization Source）电子轰击电离（电子轰击电离（electronimpactionization,EI）化学电离（化学电离（chemicalionization,CI）场电离（场电离（fieldionization,FI）场解吸（场解吸（fielddesorption,FD）快原子轰击（快原子轰击（fastatombombardment,FAB）基质辅助激光解吸电
20、离基质辅助激光解吸电离（matrix-assistedlaserdesportionionization,MALDI）电喷雾电离（电喷雾电离（electrosprayionization,ESI）大气压化学电离大气压化学电离（atmosphericpressurechemicalionization,APCI）3535质谱中最常用的离子源，一般为质谱中最常用的离子源，一般为70eV的电子束，远大于的电子束，远大于大多数有机化合物的电离电位（大多数有机化合物的电离电位（715eV），会使相当多的分），会使相当多的分子离子进一步裂解，产生广义的碎片离子。子离子进一步裂解，产生广义的碎片离子。图 电
21、子轰击分子示意图1、电子轰击电离（电子轰击电离（electronimpactionization,EI）3636优点：优点：1）稳定）稳定,质谱图再现性好，便于计算机检索及比较；质谱图再现性好，便于计算机检索及比较；2）离子碎片多，可提供较多的分子结构信息。）离子碎片多，可提供较多的分子结构信息。缺点：缺点：1）样品必须易于气化；）样品必须易于气化；2）当样品分子稳定性不高时，分子离子峰的强度低，甚至）当样品分子稳定性不高时，分子离子峰的强度低，甚至不存在分子离子峰。不存在分子离子峰。372 化学电离（化学电离（chemical ionization, CI）化学电离是通过离子化学电离是通过离
22、子-分子反应来完成的。反应气体一般是分子反应来完成的。反应气体一般是甲烷、异丁烷、氨等甲烷、异丁烷、氨等, 生成生成(M+H)+, (M-H)+, (M+NH4)+ 的准的准分子离子分子离子。37优点：优点：准分子离子峰强度高，便于推算分子量；准分子离子峰强度高，便于推算分子量；缺点：缺点：1）只适用于易挥发、受热不分解的样品；）只适用于易挥发、受热不分解的样品；2）碎片离子峰少，强度低。）碎片离子峰少，强度低。例：例：CH4+eCH4+2eCH4+CH4CH5+CH3CH5+MCH4+(M+H)+CH5+MCH4+(M-H)+H23838(a) EI源源 (b) CI源（甲烷）源（甲烷） (
23、c) CI源（异丁烷）源（异丁烷）图1-4 邻苯二甲酸二辛酯的质谱图39393 场电离（场电离（field ionization, FI）和）和 场解吸（场解吸（field desorption, FD）场解吸：场解吸：原理与原理与FI相同，但样品是被沉积在电极上。相同，但样品是被沉积在电极上。FD适用于适用于难汽化的、热不稳定难汽化的、热不稳定样品。样品。FD的准分子离子峰比的准分子离子峰比FI的强，质谱图比的强，质谱图比FI的还要简单。的还要简单。场电离：场电离：是一种软电离技术。当样品蒸汽邻近或接触到带高正是一种软电离技术。当样品蒸汽邻近或接触到带高正电位的金属针时，由于高曲率的针端产生
24、很强的电位梯度，样电位的金属针时，由于高曲率的针端产生很强的电位梯度，样品分子可被电离。品分子可被电离。优点：优点：电离快速，适合于和气相色谱联机；电离快速，适合于和气相色谱联机；缺点：缺点：要求样品汽化，灵敏度低。要求样品汽化，灵敏度低。40404快原子轰击（快原子轰击（fastatombombardment,FAB）FAB：是一种广泛应用的软电离技术。快原子轰击利用的重原子：是一种广泛应用的软电离技术。快原子轰击利用的重原子一般为一般为He或或Ar。Ar+(高动能的高动能的)+Ar(热运动的热运动的)Ar(高动能的高动能的)+Ar+(热运动热运动的的)图 FAB离子源原理示意图电离室414
25、1FAB可完成连可完成连FD都有困难的、都有困难的、高极性、难汽化的化合物高极性、难汽化的化合物的电离。的电离。FAB得到的是准分子离子峰得到的是准分子离子峰(M+H)+;当分析极性样品（糖类），常加入当分析极性样品（糖类），常加入NaCl水溶液，得到水溶液，得到(M+Na)+离子峰。离子峰。4242MALDI的方法：的方法：将被分析化合物的溶液和某种基质溶液相混合。蒸发掉溶剂，则被分析物质与基质形成晶体或半晶体。用一定波长的脉冲式激光进行照射。基质分子能有效地吸收激光的能量，并间接地传给样品分子，从而得到电离。优点：优点：1）使一些难于电离的样品电离，且无明显的碎裂，从而得到完）使一些难于电
26、离的样品电离，且无明显的碎裂，从而得到完整的被分析化合物分子的电离产物；整的被分析化合物分子的电离产物；2）特别适用于与飞行时间质谱相配（）特别适用于与飞行时间质谱相配（MALDI-TOFMS）。）。5 基质辅助激光解吸电离 （matrix-assisted laser desportion ionization, MALDI）434344446 电喷雾电离（电喷雾电离（electrosprayionization,ESI）ESIESI源示意图源示意图 主要应用于高效液相色谱主要应用于高效液相色谱HPLC与质谱仪的联用。与质谱仪的联用。从雾化器套管的毛细管端喷出的带电液滴，随着溶剂的不断快速蒸
27、发，液从雾化器套管的毛细管端喷出的带电液滴，随着溶剂的不断快速蒸发，液滴迅速变小，表面电荷密度不断增大。由于电荷间的排斥作用，就会排出溶剂滴迅速变小，表面电荷密度不断增大。由于电荷间的排斥作用，就会排出溶剂分子，得到样品的准分子离子。分子，得到样品的准分子离子。45毛细管2-4kV离子从液滴表面蒸发出来-+-+-含各种离子的液滴-+-+-+-+-随着液滴的挥发,电荷密度增大, 离子集中到液滴表面+-+-+-+-+-+-电喷雾离子大致化分为三个过程电喷雾离子大致化分为三个过程: :1.形成带电液滴2.溶剂蒸发和液滴碎裂3.形成气相离子6 电喷雾电离（电喷雾电离（electrosprayioniz
28、ation,ESI）46ESIESI中的多电荷离子中的多电荷离子质谱测定是基于质荷比 (m/z)z)。 1.1.单电荷离子单电荷离子m/z = (M+H)/1m/z = (M+H)/12.2.双电荷离子双电荷离子m/z = (M+2H)/2m/z = (M+2H)/23.3.多电荷离子多电荷离子 m/z = (M+nH)/nm/z = (M+nH)/n多电荷离子的同位素峰等于 1/n Da (例如,双电荷离子的质荷比等于 0.5 Da)。多电荷离子可以扩展质谱的质量范围。47(M + nH)n+M + (n+1)H(n+1)+M + (n-1)H(n-1)+M + (n-2)H(n-2)+m/
29、z abcdM/z轴上,b处离子所带电荷数n(整数)为n =c/(c-b)分子量可以通过以下公式计算:a x (n + 1) - (n + 1)b x n - nc x (n - 1) - (n - 1)d x (n - 2) - (n - 2)专用软件可用 (Transform and MaxEnt)多电荷离子的解析多电荷离子的解析48多电荷离子簇多电荷离子簇 n = 20n = 22n = 18n = 16, m/z = 1060n = 23, m/z = 738n = 21n = 19n = 17Horse Heart Myoglobin( (马心肌红蛋白马心肌红蛋白) )49497.大
30、气压化学电离大气压化学电离（atmosphericpressurechemicalionization,APCI）APCIAPCI工作原理示意图工作原理示意图 是由ESI源派生出来的，常压下电晕放电。 喷出的液滴先汽化，随后溶剂分子溶剂分子被电离，发生化学电离的过程。 要样品汽化，适用于弱极性的小分子化合物(M165.0995.200e+0020.1ppb,S/N=10.721.07Quattromicro APIr2=0.998010002000300040005000ppb0r2=0.9930102030405060708090100ppb01ppb5000ppb0.1ppb100ppbZ
31、Q112LC-MS技术的应用技术的应用以大气压电离为接口的以大气压电离为接口的LC-MS技术已经在药物、技术已经在药物、化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得广化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得广泛的应用泛的应用113具体应用领域具体应用领域医药学：医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析生物化学：生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品食品/水分析水分析临床医学：临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变
32、异、胆酸新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸食品科学：食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物法医学：法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测兽医学：兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体兴奋剂、磺胺类药物、抗体合成化学：合成化学：有机金属化合物、有机合成物有机金属化合物、有机合成物有机化学：有机化学：表面活性剂、染料表面活性剂、染料114药物代谢研究药物代谢研究药物代谢与药物动力学：对液态样品和混合样品的分药物代谢与药物动力学：对液态样品和混合样品的分离能力高。离能力高。可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构。
33、可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构。已在世界上大型制药企业中取代已在世界上大型制药企业中取代HPLC而占据了主导地而占据了主导地位，其测试的样品量占总量的位，其测试的样品量占总量的70%以上。以上。115天然产物天然药物的研究天然产物天然药物的研究目前中药开发研究有两条途径。一条途径是从单一植物中目前中药开发研究有两条途径。一条途径是从单一植物中提取一种有效成分提取一种有效成分(单体化合物单体化合物)或提取物开发成新药。另或提取物开发成新药。另一途径则是中药复方制剂的开发研究。一途径则是中药复方制剂的开发研究。指纹图谱分离鉴定指纹图谱分离鉴定定量四、五种指标成分定量四、五种指标成分(有
34、效成分或特征成分有效成分或特征成分)进行，可以确进行，可以确定出简化的指纹图谱和指标成分。定出简化的指纹图谱和指标成分。国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。116临床诊断和疾病生物标志物的分析临床诊断和疾病生物标志物的分析新生儿遗传疾病筛选（新生儿遗传疾病筛选（PKU、MCAD等四十种左右）、新等四十种左右）、新生儿性激素变异的检测、男女激素的监测、老年痴呆症的生儿性激素变异的检测、男女激素的监测、老年痴呆症的早期诊断、抗排异药物的检测、磷酸脂的检测、血红
35、蛋白早期诊断、抗排异药物的检测、磷酸脂的检测、血红蛋白变异检测、糖化血红蛋白（糖尿病早期检测）、某些心脏变异检测、糖化血红蛋白（糖尿病早期检测）、某些心脏病、癌症疾病筛查如乳腺癌等等（病、癌症疾病筛查如乳腺癌等等（Biomarker法、通过鉴法、通过鉴定定DNA损伤程度测定）、药物剂量监测、药物相互作用监损伤程度测定）、药物剂量监测、药物相互作用监测、地区性突发性中毒病人的毒物检测等。测、地区性突发性中毒病人的毒物检测等。117残留、法医学和环境样品测定残留、法医学和环境样品测定进口动物源性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限进口动物源性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限量标准。量标准。
36、对环境中各种污染物、有害或有毒物以及法庭科学中毒物、对环境中各种污染物、有害或有毒物以及法庭科学中毒物、滥用药物等进行更加严格的监控。滥用药物等进行更加严格的监控。数百种农药、兽药、抗生素、兴奋剂类残留和毒物、毒素数百种农药、兽药、抗生素、兴奋剂类残留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺类、硝基呋喃类、毒品、多环芳烃等等化如氯霉素、磺胺类、硝基呋喃类、毒品、多环芳烃等等化合物的检测。合物的检测。118应用示例应用示例119119高效液相色谱高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸清开灵复方中胆酸采用采用HPLC/MS/MS技术，从清开灵注射液中，通过分子量、技术，从清开灵注射
37、液中，通过分子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用电直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾（喷雾（ESI）离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质）离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质谱图、即分子离子峰谱图、即分子离子峰M-H-，再用二级质谱（，再用二级质谱（MS/MS）扫）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级质谱图。进行测定，做出其一级、二级质谱图。120120通过对样品进行分子
38、离子峰的扫描发现M-H-的峰中有一个很强的407，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其应该为一有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的分子量为408）。如图所示：通过对照样品(右)和标准品（左）的二级质谱图，发现其主要碎片峰均吻合较好。 121菲骈吲哚里西定122123124124125125126126127128129130130131131大鼠血清样品中马兜铃酸SPE净化及HPLC-MS含量测定132研究对象研究对象132133研究对象研究对象133R1R2AAIHOCH3AAIIHHAAIIIaOHHAAIVaOHOCH3四种马兜铃酸结构式134马兜铃酸净化方法马兜铃酸
39、净化方法134纯化方法纯化方法有机溶剂有机溶剂萃取速萃取速度度加样回收率加样回收率（%）所得样品纯度所得样品纯度液液-液萃取液萃取大量乙醚，大量乙醚，少量甲醇少量甲醇较慢较慢97.3105.0无选择性无选择性固相萃取固相萃取少量甲醇少量甲醇快速快速87.1105.693.7297.83%常用固相萃取材料为C18，虽然对马兜铃酸的富集有一定的效果，但是对强保留物质无法有效去除。135SPE分离材料的选择分离材料的选择135136血清中马兜铃酸前处理方法血清中马兜铃酸前处理方法136样品配制活化上样洗脱淋洗氮气吹干，以200 L甲醇重溶，过0.22 m滤膜备用 取血清，加马兜铃酸和内标物，作为上样
40、液3 mL甲醇5 mL纯水1 mL 样品3 mL甲醇/水（2:98，v/v）溶液6 mL三氟乙酸/甲醇（4:96，v/v）137SPE洗脱条件考察洗脱条件考察137实验分别考察了3mL甲酸/甲醇（5:100，v/v）、6 mL甲酸/甲醇（5:100，v/v）作为洗脱液，结果表明，回收率仅为60.3%62.7%。改用三氟乙酸（TFA）作为酸性介质添加。选择三氟乙酸/甲醇（1:100，v/v）作为洗脱液， AA I回收率达到85.6%138SPE洗脱条件考察洗脱条件考察1381：1%TFA洗脱；2：2%TFA洗脱3：3%TFA洗脱；4：4%TFA洗脱139三种三种SPE柱效果比较柱效果比较139样
41、品样品添加量添加量（ppb）C18-SAX（n=3）C18（n=3）SOLA（n=3）回收率回收率/%RSD/%回收率回收率/%RSD/%回收率回收率/%RSD/%AAI20095.58.2137.719.757.02.510078.619.063.821.055.717.1AAII100080.28.397.512.123.29.050098.113.323.148.823.524.0AAIIIa10089.16.6117.917.841.13.55091.122.033.026.748.822.5AAIVa500101.37.882.929.841.93.110092.716.242.62
42、1.940.616.8140液相色谱串联质谱实验条件液相色谱串联质谱实验条件140母离子母离子(m/z)子离子子离子(m/z)分析样品分析样品(analyte)34046AAI31046AAII326236AAIIIa356266AAIVa马兜铃酸与内标物的马兜铃酸与内标物的TIC图图1马兜铃酸IIIa，2马兜铃酸IVa，3萘普生，4马兜铃酸II，5马兜铃酸I141四种马兜铃酸液质联用仪器条件四种马兜铃酸液质联用仪器条件141样品样品标准曲线标准曲线相关系数相关系数RAAIY=0.0179X-0.07360.9892AAIIY=0.00431X+0.01770.9976AAIIIaY=0.30
43、4X+0.0280.9949AAIVaY=0.0609X+0.006150.9951样品样品LOQ(ng/mL)LOD(ng/mL)AAI103AAII4015AAIIIa10.3AAIVa52142各马兜铃酸经各马兜铃酸经SPE处理后加标回收率处理后加标回收率142成分成分加入量加入量测得量测得量回收率回收率%（n=3）g/mLg/mL xRSDAAI0.020.01576.758.120.050.03672.806.450.200.14278.0010.09AAII0.050.03366.9013.330.100.07978.958.430.500.3978.406.62AAIIIa0.0
44、020.001575.2519.210.0050.003773.607.820.020.01684.0016.23AAIVa0.010.006860.8016.820.0250.01870.603.130.10.075575.508.98143小结小结143lC18-SAX固相萃取柱对血清中马兜铃酸有较好的富集作用。在0.0020.5 g/mL的浓度范围内，回收率为60.884.0%，所发展的方法简单、快速，回收率较高，达到了很好的净化富集效果。l发展了多种马兜铃酸的高效液相色谱-质谱的含量测定方法，检测限为0. 315 ng/mL，定量限为140 ng/mL，方法灵敏、线性范围宽。所发展体内药物分析方法也能很好地满足马兜铃酸血药浓度的监测。144144谢谢谢谢!
