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1、MEGA 软件的使用Mega 是一款操作十分简便的遗传学分析软件，其界面十分友好，即使初学者也很易上手。1 1、数据的录入及编辑、数据的录入及编辑Mega 软件能够接受多种数据格式，如 FASTA格式、Phylip 格式、PAUP数据格式等等。而且 Mega 软件专门提供了把其他格式的数据转换位 Mega 数据格式的程序。首先，打开 Mega 程序，有如以下图所示的操作界面：单击工具栏中的“File”按钮，会出现如以下图所示的菜单：从上图可以看出，下拉菜单有“Open Data”打开数据 、“Reopen Data”打开曾经打开的数据， 一般会保留新近打开的几个数据 、 “Close Data
2、” 关闭数据 、“Export Data”导出数据 、“Conver To MEGA Format” 将数据转化为 MEGA 格式 、“Text Editor”数据文本编辑 、“Printer Setup”启动打印 、“Exit”退出MEGA 程序 。单击“Open Data”选项，会弹出如下菜单：浏览文件， 选择要分析的数据打开， 单击“打开”按钮， 会弹出如下操作界面：此程序操作界面，提供了三种选择数据选择：Nucleotide Sequences核苷酸序列 、Protein Sequences蛋白质序列 、Pairwise Distance遗传距离矩阵 。根据输入数据的类型，选择一种，点
3、击“OK”即可。如果选择“Pairwise Distance”，则操作界面有所不同；如以下图所示：根据遗传距离矩阵的类型，如果是下三角矩阵，选择“Lower Left Matrix” 即可；如果是上三角矩阵，选择“Upper Right Matrix”即可。点击“OK”按钮，即可导入数据。如果是核苷酸数据，则读完之后，会弹出如下对话框：如上图，如果是编码蛋白质的核苷酸序列，则选择 “Yes”按钮；如果是不编码蛋白质的核苷酸序列，则点击“No”按钮。之后，会弹出如下操作窗口：此作界面的名称是“Sequence Data Explorer” ，在其最上方是工具栏“Data”、“Display”、“
4、Highlight”等，然后是一些数据处理方式的快捷按钮，在操作界面的左下方是每个序列的名称。显示序列占了操作界面的绝大部分，与第一个序列相同的核苷酸用“.”表示，发生变异的序列则直接显示。2 2、遗传距离的计算、遗传距离的计算点击 Mega 操作主界面的“Distances”按钮，会弹出一个下拉菜单。如以下图所示：从上图易知，此菜单包括如下选项：“Choose Model”选择模型，即选择计算遗传距离的模型 、 “Compute Pairwise” 计算遗传配对差异 、 “Compute OverallMean”计算包括所有样本在内的平均遗传距离 、“Compute With Group M
5、eans”计算组内平均遗传距离 、“Compute Between Groups Means”计算组间平均遗传距离 、“Compute Net Between Groups Means”计算组间平均净遗传距离 、“Compute Sequence Diversity”计算序列分歧度 。“Compute Sequence Diversity”选项包括四个子菜单：“Mean Diversity WithinSubpopulations”亚群体内部平均序列多态性、“Mean Diversity for EntirePopulation”整个人群平均序列多态性 、“Mean Interpopulaio
6、nal Diversity”群体内部平均序列多态性 、“Coefficient of Differentiation”遗传变异系数 。点击“Choose Model”选项，会弹出如下操作界面：从上述操作界面可以看出，通过此对话框可以选择计算遗传距离的模型等。“Data Type”显示数据的类型：NucleotideCoding 编码蛋白质的 DNA 序列 、Nucleotide不编码蛋白质的 DNA 序列 、Amino Acid氨基酸序列 。通过“Model”选项可以选择，计算遗传距离的距离模型。点击“Model”一行末端的按钮会弹出一选择栏。如上图所示，对于非编码的核苷酸序列 Mega 程序
7、提供了八种距离模型：“Number of Difference”核苷酸差异数 、“P-distance”P 距离模型 、“Jukes-Cantor”Jukes 和 Cantor 距离模型 、“Kimura 2-Parameter”Kimura 双参数模型 、 “Tajima-Nei” Tajima和 Nei 距离模型 、 “Tamura 3-parameter”Tamura三参数模型 、 “Tamura-Nei” Tamura和 Nei 距离模型 、 “LogDet Tamura kumar ”对数行列式距离模型 。对于编码的核苷酸序列，其遗传距离模型如以下图所示：如上图所示，对于编码蛋白质的
8、 DNA 序列，Mega 程序提供了一下几种模型：“Nei-Gojobori Method”，“Modified Nei-Gojobori Methoed”、“Li-Wu-LuoMethod”、“Pamilo-Bianchi-Li Method”、“Kumar Method”。其中 Nei-Gojobori 方法和修正的 Nei-Gojobori 方法都包含三种距离模型：“Number of Differences”、“P-distance”、“Jukes-Cantor”。对于氨基酸序列，Mega 所提供的遗传距离模型如以下图所示：如上图所示，对于氨基酸序列，Mega 程序提供了一下六种遗传距
9、离模型：“Number of Differences”氨基酸差异数 、“P-distance”P 距离模型 、“PoissonCorrection”泊松校正距离模型 、“Equal Input”等量输入距离模型 、“PAMMatrix Dayhoff ” PAM距离矩阵模型 、 “JTT Matrix Jones-Taylor-Thornton ”JTT 距离矩阵模型 。在“Analysis Preference”操作界面中，“Pattern Among Lineages”仅提供了一个选项：“SameHomogenous”“，也就是说样本之间是有一定同源性的。“Ratesamong sites
10、”提供了两个选项： “Uniform Rates”和“Different Gamma Distributed ”。“Uniform Rates”意味着所有序列的所有位点的进化速率是相同的。 选择“DifferentGamma Distributed”，意味着序列位点之间的进化速率是不相同的，可以利用 Gamma 参数来校正，系统提供了四个数值可供选择：2.0、1.0、0.5、0.25；软件使用者也可以自行决定 Gamma 参数的大小。设置完毕后，在此界面中点击“OK”按钮，即可返回 Mega 操作主界面。选择主操作界面“Distance”中的“Compute Pairwise”选项，可以计算样
11、本之间的遗传距离的大小，其操作界面如以下图所示：“Data Type”显示数据的类型，图中为“Nucleotide”。“Analysis”显示计算分分析的类型， 图中为“Pairwise Distance Calculation” 配对差异距离计算 。“Compute”显示所要运行的对象，又两个选项：“Distance only”仅计算遗传距离和“Distance&Std.Err”计算遗传距离和其标准误 。“Include Sites”显示利用哪些位点来计算， 如果数据类型是不编码蛋白质的核苷酸序列，则全部参与计算，如果是编码蛋白质的核苷酸序列，则可以选择哪些位点如密码子的第 2 位等来参与运
12、算。“Substitution Model”是替代的模型 ，在下边“Model”中可以进行选择。“Substitutions to Inclued”选择哪些替代类型如以下图所示被用于运算， d选项将转换和颠换全部包括在内，s 选项仅包括转换，v 选项仅包括颠换，R 为转换和颠换的比值，L 为所有有效的普通位点的个数。“Pattern among Lineages”和“Rates among sites”上文已有介绍，不再详述。点击“Compute”按钮， 即可开始计算。 其显示运算结果的界面如以下图所示：上图是计算出的各个样本之间的遗传距离的矩阵。 在最下端的状态栏，显示的是所利用的遗传距离模
13、型，如图中所示：Nucleotide：Kimura 2-parameter。“File”按钮共有四个下拉菜单：“Show Input Data Title”显示输入数据的标题 、 “Show Analysis Description” 显示分析信息的描述 、 “Export/Print Distance”输出或打印距离矩阵 、“Quit viewer”退出此操作界面 。“Display”按钮共有四个下拉菜单： “Show Pair Name”显示配对序列的名字 、“Sort Sequence”用何种方式对序列进行排序 、“Show Names”显示序列的名字 、“Change Font”改变字
14、体 。“Sort Sequence”有两个选项：“Original”按原先输入的顺序和“By Name”通过序列的名字 。点击“Average”按钮可以计算平均的遗传距离，此按钮提供了四个下拉菜单：“Overall”所有样本之间的平均遗传距离 、“Within Groups”组内平均遗传距离 、“Between Groups”组间平均遗传距离 、“Net Between Groups”组间平均净遗传距离 。在上述按钮下方还有六个按钮，如以下图所示。点击第一个按钮可以使数据以下三角矩阵的方式显示； 点击第二个按钮可以使数据以上三角矩阵的方式显示；选中第三个按钮可以显示配对的序列的名字，点击第四个
15、按钮，可以减少数据小数点后的位数；点击第五个按钮，可以增加数据小数点后的位数；拖动第六个按钮中的小竖条可以改变数据显示的宽度。点击“File”下拉菜单中的“Export/Print Distance”选项， 会弹出如以下图所示的对话框：“Output Format”选项可以确定输出数据的格式：“Publication”一般格式和“Mega”Mega 格式，把此数据保存可直接由 Mega 程序打开，进行构建系统发育书等遗传分析 。Decimal Places小数位的大小 ，“Max Entries per line”每一行最多能显示的数据的个数 。通过“Matrix”可以选择输出数据矩阵的方式：
16、“Lower-left”下三角矩阵和“Upper-right”上三角矩阵 。点击“Print/Save Matrix”按钮， 可以输出数， 会弹出如以下图所示的操作界面：在上图中的数据和文字可以直接进行拷贝，粘贴到文本文档或MicrosoftWord 文档中。在此操作界面中，首先显示数据文件的一些信息，如数据文件的标题、总的样本个数、核苷酸替代的距离模型等。然后是每个序列的名字，之后是序列之间的距离矩阵。将此距离矩阵保存，可以用Mega 或其他系统发育分析软件来做系统树。点击 Mega 软件操作主界面的 “Distances”下拉菜单中的 “Compute OverallMean”选项，可以计
17、算所有序列的所有位点的平均遗传距离，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其运算结果如以下图所示：点击 Mega 软件操作主界面的 “Distances”下拉菜单中的 “Compute WithinGroup Means”选项，可以计算每个组组内的平均遗传距离，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其运算结果如以下图所示：点击 Mega 软件操作主界面的 “Distances”下拉菜单中的 “Compute betweenGroup Means”选项，可以计算分组之间的平均遗传距离，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其运算结
18、果如以下图所示：点击 Mega软件操作主界面的“Distances”下拉菜单中的“Compute net betweenGroup Means”选项，可以计算分组之间的平均遗传距离，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其运算结果如以下图所示：点击 Mega 软件操作主界面的“Distances”下拉菜单中的“Compute SequenceDiversity”选项中的“Mean Diversity Within Subpopulations”，可以计算亚组之间的平均遗传距离，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其运算结果如以下图所示：点击 Meg
19、a 软件操作主界面的“Distances”下拉菜单中的“Compute SequenceDiversity”选项中的“Mean Diversity for Entire Population”， 可以计算整个群体的平均遗传距离，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其运算结果如以下图所示：点击 Mega 软件操作主界面的“Distances”下拉菜单中的“Compute SequenceDiversity”选项中的“Mean InterPopulation Diversity”，可以计算群体内部的平均遗传距离，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其
20、运算结果如以下图所示：点击 Mega 软件操作主界面的“Distances”下拉菜单中的“Compute SequenceDiversity”选项中的“Coffient of Differentiation”，可以计算群体的变异系数，其操作方法和界面同“Compute Pairwise”相仿。其运算结果如以下图所示：3 3、系统发育树的构建、系统发育树的构建Mega 程序构建系统发育树的功能很强大。它提供了四种构建系统发育树，还包括一些检验程序。这四种构建分子系统树的方法为：Neighbor-JoiningNJ，邻接法 、Minimum EvolutionME，最小进化法 、Maximum P
21、arsimonyMP，最大简约法 、Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean UPGMA，算术平均的不加权对群法 。其中，NJ 法和 UPGMA 法都属于距离法。其操作界面如以下图所示：邻接法是距离法构建系统发育的常用方法， 此方法基于最小进化原理，而不使用优化标准。邻接法中一个重要概念就是“近邻”。在谱系树上，如果两个分支之间只通过一个内部节点相连，那么这两个分支就被称为“近邻”。完全解析出的进化树是通过对完全没有解析出的“星型”进化树进行“分解”得到的，分解的步骤是连续不断地在最接近实际上，是最孤立的的序列对中插入树枝，而保留进化树
22、的终端。于是，最接近的序列对被稳固了，而 “星型”进化树被改善了，这个过程将不断重复。这种方法并不检验所有可能的拓扑结构，因此相对而言运算速度很快，也就是说，对于一个 50 个序列的进化树，只需要假设干秒甚至更少。具体操作：输入数据，点击 Mega 操作主界面“Phylogeny”中的“ConstrcuctPhylogeny”选项中的“Neighbor-JoiningNJ”，会弹出如下操作界面。此操作界面可以显示数据的类型、计算分析的类型、构树的方法等等。点击“Phylogeny Test and options”后边的按钮，可以设置检验的类型： None不进行检验 、“Bootstrap”自
23、展法检验 、“Interior Branch Test”内部分支检验 。选择后两种检验方法，可以设置自展的次数等等。设置完毕后，点击下边有对号标记的按钮即可返回原操作界面。其操作界面如以下图所示：点击“Model”按钮，可以选择计算遗传距离所用的距离模型。其它按钮的解释和使用前边已有介绍，这里不作赘述。设置完毕后，点击“Compute”按钮，即可开始计算分析。结果界面如以下图所示：上图即是利用邻接法构建的系统发育树。点击此操作界面中的“File”按钮，会弹出一下拉菜单如以下图所示 ，此菜单包括八个选项： “Save Tree Session” 保存树文件， 快捷方式为 Ctrl+S 、 “ExportCurrent Tree”导出当前的谱系树 、“Export All Trees”导出所有的谱系树 、“Show Information”显示有关谱系树的一些信息 、“Print”打印 、“Print in asheet”在一张纸中打印 、“Printer setup”启动打印机 、“Exit Tree Explorer”。点击“Save Tree Session”选项，可以将树文件保存，有关系统树的所有信息都被存储。
