《生物制药工艺学微生物药物的工业生产分享资料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物制药工艺学微生物药物的工业生产分享资料（28页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章 微生物药物的工业生产生物制药工艺学1微生物药物工业生产的组成发酵分离 菌种 菌种选育 菌种分离纯化菌种制备保存 摇瓶种子制备 罐上种子制备发酵生产 发酵液预处理 产物提取产物精制纯化微生物药物2一. 菌种工艺与技术n微生物药物的产生菌 1.放线菌 是一类具有丝状分枝细胞和无性孢子的G+原核微生物,由于菌落呈放射状而得名。放线菌中链霉菌属占到50%，但是目前从稀有放线菌中发现的新的次生代谢物越来越多。 2. 真菌 包括了霉菌、酵母菌和大型真菌。其中霉菌是主要的次生代谢物来源，也是最早发现次生代谢物的微生物。近年来，植物内生真菌的研究成为重点，如从红豆杉科植物体寻找可产紫杉醇的内生真菌。
2、3. 细菌 所产次生代谢物比例最少，以假单孢菌和芽孢杆菌为主要产生菌。但部分特殊种属，如黏细菌、光合细菌能产生罕有而重要的次生代谢物，如抗癌药物埃博霉素、抗氧化剂辅酶Q10等。3一. 菌种工艺与技术 新抗生素产生菌比例（据日本抗生素杂志） 放线菌的菌丝结构4一. 菌种工艺与技术n菌种的选育 1. 寻找产生新化合物的菌种（略） 2. 现有微生物药物产生菌种的选育 目的：a. 提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含量 b. 提高菌种对工业化生产条件的适应力 方法：a. 自然纯化选育 b. 传统诱变选育（紫外线、诱变剂、离子束） c. 代谢调控和条件模型选育 d. 基因工程选育5一. 菌种工艺与技术
3、n工业用菌种的分离纯化正常菌退化菌传代传代传代微生物遗传变异是绝对的，稳定是相对的；退化性的变异是多数的，进化性的变异是少数的。不对工业用菌种加以分离纯化，剔除变异菌，那么通过传代的累积效应，退化变异菌种将占据种群遗传优势。最终导致生产水平的波动和下降。6一. 菌种工艺与技术n菌种分离纯化流程（例）保存菌种涂布平板点种平板斜面稀释涂布单菌落点种接斜面扩增生产能力鉴定斜面斜面7一. 菌种工艺与技术n菌种制备保存方式： 1.短期制备保存 短期制备保存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。 保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用 于生产。 主要包括：菌落平板 试管/茄子瓶斜面
4、麸皮/米孢子培养物 2. 中长期制备保藏 中长期制备保存方式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗 传特性和活力，保证生产菌种有可靠来源。 主要包括：冷冻甘油管保藏 冷冻干燥管保藏 液氮甘油管保藏 沙土/石蜡管保藏 8二. 发酵生产n发酵生产流程概况生产菌种培养摇瓶种子培养一级种子 罐培养二级种子 罐培养发酵罐培养微生物药物的发酵生产包括种子培养和发酵产抗两个阶段。种子培养阶段通过连续的扩增培养，获得足够量健壮均一的 种子投入发酵生产。发酵产抗包括生长期和生产期，生长期仍以菌量的扩增为目的；当营养消耗等条件适宜后，微生物即开始产抗，进入生产期。9二. 发酵生产n发酵种子培养迟滞期对数期平台期衰亡
5、期种子生长曲线种龄菌量种子的评价指标：1.生长健壮旺盛，移入下一级后能迅速生长，迟滞期短2.菌体稳定均一，生长同步性好3.菌体总量和生长密度适宜4.无杂菌污染10二. 发酵生产n发酵种子培养的调控 1. 培养基 碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。一般而言，种子配方中碳/氮比要求均衡，量以满足生长为宜，优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌种的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中碳氮源组成。 2. 环境因素 影响菌种生理活性的因素包括了温度、PH、溶氧、渗透压、离子 强度等。不同的菌种都有着其最适应的范围，从而进行正常的生理代谢。 所有上述因素的选择在种
6、子阶段都应以菌种的生长最适条件来进行选择。 3. 种子级数的设计 种子培养级数越多，培养周期越长，过程中可能出现的不稳定因素越多。在设备条件允许的情况下，应尽可能缩减种子培养级数，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一级需要。 11二. 发酵生产迟滞期对数期平台期衰亡期发酵曲线发酵周期生长期生产期次生代谢发酵原理：当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。12二. 发酵生产n发酵生产流程培养基投料溶解移入发酵罐定容调节灭菌前pH值高压蒸汽灭菌降温至培养温度种子液移入调节空
7、气流量、搅拌速度、罐顶压至规定值，开始发酵13二. 发酵生产n影响发酵的相关因素培养基 1. 碳源 碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳源达到5%以上就形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物合成酶，形成碳分解代谢物阻遏。 2. 氮源 氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源和有机氮源，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、蛋白胨等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有阻遏产物合成酶的性质。 3. 矿物盐 磷酸盐、镁盐
8、、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。锌、铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液pH，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。14二. 发酵生产n影响发酵的相关因素培养基 4. 生长因子 许多微生物生长需要它们所不能合成的生长因子，如特殊氨基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵母粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。 5. 消泡剂 发酵过程中，由于营养物分解代谢和菌体老化，加上发酵罐内通气和搅拌效果，易导致泡末产生，造成溶氧不足和逃液等问题。可通过消泡剂的添加控制泡末。一般消泡剂为高分子聚合物，如泡敌，聚乙二醇等。油类也具有类似效果
9、，如豆油、葵花子油等。 6. 前体物质 次生代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。如青霉素发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正丙醇。15二. 发酵生产n影响发酵的相关因素培养条件 1. 温度 温度影响微生物酶系的活力，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。 2. pH pH对微生物的影响，主要也是作用于酶。另外对营养利
10、用和细胞结构也有重要影响。无控制的条件下，pH 呈现如下变化规律有机氮分解，形成大量NH4+NH4+消耗利用 碳源消耗产生有机酸菌体老化，进入鸟氨酸循环形成大量NH4+菌体二次生长16二. 发酵生产n影响发酵的相关因素培养条件 pH的调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质调控，如盐酸、氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同时也兼具营养补充功能。 3. 氧的供应 工业微生物大都为好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以
11、增大氧的溶解度。 反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。 类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵黏度、泡末等因素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。17二. 发酵生产n影响发酵的相关因素培养条件 4. 灭菌条件 发酵罐和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致营养损失和毒性物质积累。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制微生物发酵也是常用的
12、手段。 5. 剪切力 发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但桨叶尖端末速形成的剪切力也会损伤菌体，造成菌体断裂破碎，进而导致二次生长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。 对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，提高菌种抵抗能力。在设备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨叶。1819二. 发酵生产n影响发酵的相关因素其他因素 1. 种子质量的影响（略） 2. 设备的影响 良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要因素。设备对于发酵生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失效导致染菌问题；搅拌不平衡导致罐体震动，影响供氧；开关阀门动作失灵导致温度、pH控制不稳等等。 3. 人员
13、操作的影响 人员操作是发酵生产控制的重要因素,对发酵生产各环节都有决定性影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗略和错误的影响。 4. 环境因素 环境因素往往导致发酵水平的季节性波动。如环境空气的温湿度会使无菌空气的温湿度有差异，导致培养体积随时间的增减，影响发酵环境。20二. 发酵生产n发酵终点的判断 1. 发酵的评价指标 发酵产率：单位体积的产物含量 g/L 发酵总亿：发酵液中产物总产量 十亿单位/kg 发酵系数：产物总产量/总发酵体积*总发酵时间 kg/m3*h 发酵成本：发酵(原料+动力+人员+其他)成本/总产量 元/kg 2. 终点判断标准 发酵终点的判断主要从技术和经济指标两
14、方面来衡量。技术上需要寻找发酵总亿与发酵系数的平衡点，当总亿增加，发酵系数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营养物要尽量减少，另一方面菌体自溶不能大量出现。此外，一旦难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。 从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同时也应兼顾分离提取需要。21三. 产品分离发酵液发酵液预处理预处理细胞胞内产物细胞胞内产物路线路线1 1路线路线2 2细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线路线1A1A路线路线1B1B清液胞外产物清液胞外产物产物粗提（萃取、盐析、沉淀）产物粗提（萃取、盐析、沉淀）纯化纯化( (层析、电泳层析、电泳) )脱盐脱
15、色（离交、活性炭）脱盐脱色（离交、活性炭）浓缩浓缩( (纳滤、蒸发纳滤、蒸发) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性22三. 产品分离n微生物药物产品分离的特点 1.发酵微生物药物产品分离，是根据目标产物与发酵液中其他物质在物理、化学和生物学特性上的区别，将目标产物自发酵液中取得并达到一定质量标准的过程。 2. 产品分离的任务就是以最简捷的方案，最少的原料和能源消耗和最安全方便的操作获得规定质量的产物。 3. 实际操作中，分离的难度表现如下： 产物含量低微，活性易破坏 发酵液组成和性质复杂，相似物很多 可用的分离方法有限 不
16、同产品、不同步骤处理方式、规模相差巨大，没有普适方法 23三. 产品分离n菌体分离（发酵液预处理） 发酵液预处理的主要目的是将菌体与滤液分离开，便于后续处理。目前工业应用的处理流程主要如下： 1. 絮凝-过滤处理 对于较大并具有一定电荷特性的菌体，添加聚合盐、高分子聚合物等絮凝剂，促进菌体聚集成团。并视情况加入硅藻土、珍珠岩等助滤剂改善过滤效果。通过板框、离心机等过滤分离设备达到固液分离效果。 2. 膜分离 对于细菌等较小菌体，不易通过上述方式处理，通过膜过滤分离的方式较好。膜分离的原理主要通过膜对不同尺寸和分子量的物质截留能力不同而达到分离效果。膜主要包括微孔滤膜，用于过滤菌体；超滤膜，用于
17、截留蛋白质；钠滤膜，用于除盐和浓缩。 2425三. 产品分离n产物粗提 1. 萃取 萃取是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作。包括液液和固液萃取。液液萃取中，一般利用水相和有机相对产物的不同溶解度加以分离。固液萃取一般针对菌体，包括水提和有机溶剂提取两种方式。 2. 沉淀 沉淀指从液相中产生一个可分离的固相的过程，或是从过饱和溶液中析出的难溶物质。粗分离的沉淀一般利用离子与加入的物质形成难溶性化合物的原理。 3. 盐析 盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。 一般使用于蛋白质、肽类的分离。26三. 产品分离n产品纯化 产品纯化主要指目标产物与相似组分、
18、同系物由于分子量、极性、电荷的细微差别，通过相应手段而分离的过程。 1. 层析 利用待分离组分在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析原理十分丰富，包括：吸附层析、分配层析、亲和层析、离子交换层析、凝胶层析等。相应的层析介质如硅胶、纤维素、色谱填料、树脂、葡聚糖凝胶等。 2. 电泳 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。在生物技术药物中应用较多，如蛋白质、酶、核酸等。但是由于制备量的局限，在小分子药物中应用比较少。 27三. 产品分离n产物精制和最终制成 1. 结晶 晶体在溶液中形成的过程称为结晶。结晶既是最终制得固态产品的关键一步，也是分离杂质的最后一步。由于结构和在结晶溶剂中溶解度的差异，杂质往往较多溶解，不易结晶。 2. 喷雾干燥 喷雾干燥的工作原理是在干燥塔顶部导入热风，同时将料液泵送至塔顶，经过雾化器喷成雾状的液滴，这些液滴群的表面积很大，与高温热风接触后很快脱水成为固体。适用于不能结晶、温度不敏感的物质。 3. 冷冻干燥 冷冻干燥是指通过升华从冻结的产品中去掉水份或其他溶剂的过程。适用于高温敏感，易破坏，不易结晶的产物。 28
