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1、共轭焦显微镜简介Confocalmicroscopy八组八组王玉兴王玉兴 郭少雄郭少雄 程飞程飞 张志强张志强宋百江宋百江共轭焦显微镜共焦显微术的形成与发展共焦显微术的原理共焦显微镜的分类共焦显微镜的关键技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜的应用 共轭焦显微镜共轭焦显微技术形成：1953年美国学者马文明斯基提出。发展：随后，随后，P.Davidovits, A.f.Slomba和和C.J.R.Sheppard等多等多位学者对共焦成像进行了更细致的研究位学者对共焦成像进行了更细致的研究 ，越来越多的基于共焦原理的，越来越多的基于共焦原理的显微术被开发出来显微术被开发出来 。 直到直到70年代年代
2、才有真正实用的共焦显微镜问世才有真正实用的共焦显微镜问世。80年代中期年代中期才有商品机型出售。才有商品机型出售。 九十年代九十年代以来随着计算机图像处理技术的发展，共焦显微术三维以来随着计算机图像处理技术的发展，共焦显微术三维层析能力的优点也逐渐凸现出来，受到越来越多研究人员的重视。层析能力的优点也逐渐凸现出来，受到越来越多研究人员的重视。 近几年近几年对共焦显微术的研究已形成了一个世界性的热潮对共焦显微术的研究已形成了一个世界性的热潮 ，人们已，人们已经研制出了多种多样的共焦显微镜。经研制出了多种多样的共焦显微镜。共焦显微术原理共焦：从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果
3、物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微术原理共焦共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜半反半透镜（dichroicmirror），将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔针孔（Pinhole），小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管光电倍增管（photomultipliertube，PMT）。激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片 共轭焦显微镜共焦显微术原理共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显微镜分为反射式与透射式两种形式。点光源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面，再由物体反射或透射后经聚光镜再
4、聚焦到探测器。共焦显微术原理共焦显微术的基本原共焦显微术的基本原理如图所示。共焦显理如图所示。共焦显微镜分为微镜分为反射式反射式与与透透射式射式两种形式。点光两种形式。点光源发出的光经物镜后源发出的光经物镜后聚焦到物体的表面，聚焦到物体的表面，再由物体反射或透射再由物体反射或透射后经聚光镜再聚焦到后经聚光镜再聚焦到探测器。探测器。 共焦显微术原理优点：具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的优点：具有高分辨率尤其是纵向高分辨率的 特点特点 ，使得它可以对样品的轴向进行光学，使得它可以对样品的轴向进行光学 层析，从而可以重构出样品的三维图像。层析，从而可以重构出样品的三维图像。 原因：探测器前面放置了小
5、孔光阑，使得杂散光被大大消原因：探测器前面放置了小孔光阑，使得杂散光被大大消除，而且小孔位于聚光镜的焦点处，非物镜焦平面上的光除，而且小孔位于聚光镜的焦点处，非物镜焦平面上的光线被挡住，这样探测器的信噪比就大大提高，成像有很高线被挡住，这样探测器的信噪比就大大提高，成像有很高的对比度和清晰度。的对比度和清晰度。 共轭焦显微镜的分类商业化的共聚焦（共轭焦显）显微镜共聚焦（共轭焦显）显微镜（Confocalmicroscope）分三类：共聚焦激光扫描显微镜共聚焦激光扫描显微镜（ConfocalLaserScanningMicroscope，CLSM，LSCM）（点扫描激光共焦显微镜、线扫描激光共点
6、扫描激光共焦显微镜、线扫描激光共焦显微镜、光纤激光共焦显微镜）焦显微镜、光纤激光共焦显微镜）转盘共聚焦显微镜转盘共聚焦显微镜（Spinning-disk(Nipkowdisk)confocalmicroscopes）可编程序阵列显微镜可编程序阵列显微镜（ProgrammableArrayMicroscopes(PAM)）其他：其他：荧光共焦显微镜、共焦干涉显微镜、全息荧光共焦显微镜、共焦干涉显微镜、全息共焦显微镜、非扫描激光共焦显微镜共焦显微镜、非扫描激光共焦显微镜（需做说明）显微镜成像清晰度的决定因素: 1.1.分辨率分辨率2.2.球差球差3.3.色差色差1、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个
7、质点指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力分辨清楚的能力, ,通常是用显微镜所能通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。表示。人眼及各类显微镜的分辨率人眼分辨率：人眼分辨率： 0.20 mm光学显微镜分辨率：光学显微镜分辨率： 0.25 m25 mm共焦显微镜分辨率：共焦显微镜分辨率： 0.18 m mm电子显微镜分辨率：电子显微镜分辨率： 0.20 nm2、球差： 是由于透镜不能把近轴光线和远是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不标本一点的光线，在通过透镜时不能聚
8、焦成一点能聚焦成一点, ,而是形成一个光斑而是形成一个光斑, ,从而使成像模糊不清。从而使成像模糊不清。3 3、色差：色差： 是由于显微镜透镜类似于三棱镜是由于显微镜透镜类似于三棱镜, ,对不同颜色的光线具有不同的折射率。对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后所以光线透过透镜后, ,不同色的光聚不同色的光聚焦在不同点上焦在不同点上, ,从而使成像模糊从而使成像模糊, ,而且而且像的边缘尚带有色晕。像的边缘尚带有色晕。共焦显微镜的几个关键技术共焦小孔光阑大小的选择：当小孔的直径等于艾利斑大小时既能保证共焦成像的高分辨率和层析能力，又有足够的光能通过小孔被探测器接收。高精度扫描系统的
9、设计：目前主要采用的扫描方式主要有以下几种：（1）机械式工作台扫描2）光束扫描（3）Nipkow盘扫描4）光学扫描光学层析与图像重构算法：由探测器探测到的共焦信号是样品某个层面的反射光，通过改变聚焦深度即可以获得不同断层的光强信息，然后信号经过A/D转换变为数字量，以一定的图像格式存储到计算机中。每个断层的平面图像要经过图像平滑、图像增强等预期处理达到可进行三维重构的要求，再经过三维重构算法将各断层二维图像重构成三维图像。激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜共聚焦扫描显微镜的系统组成共聚焦扫描显微镜的系统组成硬件：硬件： 激光源激光源 共聚焦显微镜共聚焦显微镜 步近器步近器 检测器检测器 光电
10、倍光电倍增管增管 计算机计算机 图象输出设备（显示器图象输出设备（显示器 彩色打印机）彩色打印机）。软件：软件： 显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统系统激光共聚焦显微镜构成激光器光电倍增管检测器显微镜步近器计算机电子图像软件激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜共聚焦显微镜的特点光源共聚焦技术点扫描技术信号放大电子图像软件1、光源：激光 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。束集中、波长相同。2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，
11、将焦平面以外的杂散光挡住，消在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。除了球差。3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。后得到一个整体平面的或立体的像。 普通光镜：是在可见光源下一次性成像。普通光镜：是在可见光源下一次性成像。 4 4、图像信号及处理、图像信号及处理：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光电倍增管放
12、大信号，计算机采集和处理光信号。光信号。 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。共扼聚焦原理图共扼聚焦原理图普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像抑制图像的模糊，获得清晰的图像2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切具有更高的轴向分辨率，并可获
13、取连续光学切片片激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别共焦显微镜与传统显微镜的区别3. 3. 增加侧向分辨率增加侧向分辨率4. 4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响由于点对点扫描去除了杂散光的影响激光共聚焦显微镜的优势在结构方面在结构方面激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高可实现分层扫描可实现连续扫描，可动态记录变化可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像扫描速度快，对样品损伤小在应用方面在应用方面l形态观察-高清晰成像l半定量-荧光强度分析l荧光探针表达量测定l定位研究-分层扫描l多种荧光标记同时检测l荧光标记物绝对
14、定量分析l扩展应用-如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等激光共聚焦显微镜的优势在效果方面更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。到。定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。体被称为分子探针的原因。显微镜扫激光共聚焦显微镜的优势定量测量： 静态的定量测量静态的定量测量 对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同
15、时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。 动态的定量测量动态的定量测量 共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。激光共聚焦显微镜的优势在效果方面快速性： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。淬灭作用很小。数据图像可及时输出或长期储存： 用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及
16、胶卷冲洗方面的问数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。激光共聚焦显微镜的优势在效果方面牛肺动脉内皮细胞 ，微管高清晰成像高清晰成像牛肺动脉内皮细胞 ，微管高清晰成像高清晰成像鼠成纤维细胞单克隆anti-tubulin标记 高清晰成像高清晰成像检测人类癌细胞表皮生长因子高清晰成像高清晰成像培养的293细胞绿色荧光蛋白高清晰成像高清晰成像共聚焦显微镜的应用1)高清晰成像高清晰成像2)半定量荧光强度分析半定量荧光强度分析3)荧光探针表达量测定
17、荧光探针表达量测定4)分层扫描分层扫描5)荧光标记物绝对定量分析荧光标记物绝对定量分析6)扩展应用扩展应用高清晰成像激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。可以清晰的表现某些细微结构。半定量荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。半定量荧光强度分析随机圈取
18、细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值荧光表达量测定利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。荧光表达量测定分层扫描（切片扫描）按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。分层扫描（切片扫描）当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。入射光被检测层面整个样品白光（不能透过）发射光分层扫描（切片扫描） 较厚层面 较薄层面人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。分层扫描（切片扫描） 较厚层面 （平滑肌损伤可见） 较薄层面兔动脉血管内皮细胞PI标记观测
19、损伤。标记细胞为损伤细胞。293细胞GFP的表达细胞“CT”片细胞测量荧光强度分析空间定位三维重建植物切片三维重建动态观测激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激下瞬时发生的变化。常用的有检测细胞内游离Ca离子变化、细胞内PH值变化，等等。Ca离子动态检测荧光染料：Fluo-3AM。此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，胞外不标记。Ca离子动态检测加药加药峰值峰值所选细胞所选细胞Ca离子动态检测胞浆胞浆胞核胞核胞浆胞核同时测量胞浆胞核同时测量牛肺动脉内皮细胞蓝色：Hoechst 33342 染DNA红色：PI，染核仁RNA绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白藤黄微球菌绿色：活菌红色：死菌染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 猴胚肾细胞内弓形虫繁殖吖叮橙染色绿色为DNA红色为RNABravo,LSM!
