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1、ELISA的基本原理及质量控制的基本原理及质量控制The fundamental principle and quality control of ELISAThe fundamental principle and quality control of ELISAELISAELISAELISAELISA（Enzyme-linked Enzyme-linked Enzyme-linked Enzyme-linked immunosorbentimmunosorbentimmunosorbentimmunosorbent assay assay assay assay 酶联免疫吸附实验）酶联免疫
2、吸附实验）酶联免疫吸附实验）酶联免疫吸附实验）是是是是20202020世纪世纪世纪世纪60606060年代发展年代发展年代发展年代发展起来的起来的起来的起来的免疫学免疫学免疫学免疫学检测检测技术，也是技术，也是技术，也是技术，也是目前目前目前目前应应用最广泛用最广泛用最广泛用最广泛的的的的传染病检测传染病检测传染病检测传染病检测方法方法方法方法。ELISAELISAELISAELISA的特点：的特点：的特点：的特点：敏感度和特异度较高，重复性好。敏感度和特异度较高，重复性好。敏感度和特异度较高，重复性好。敏感度和特异度较高，重复性好。试剂比较稳定，易于保存。试剂比较稳定，易于保存。试剂比较稳定
3、，易于保存。试剂比较稳定，易于保存。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。易于标准化和对检测对象进行定量。易于标准化和对检测对象进行定量。易于标准化和对检测对象进行定量。易于标准化和对检测对象进行定量。可以自动化。可以自动化。可以自动化。可以自动化。ELISA的基本原理的基本原理抗原或抗体在体外结抗原或抗体在体外结抗原或抗体在体外结抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表合到某种固相载体表合到某种固相载体表合到某种固相载体表面后，仍然能保持其面后，仍然能保持其面后，仍然
4、能保持其面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互免疫学活性而能相互免疫学活性而能相互免疫学活性而能相互特异性特异性特异性特异性结合。结合。结合。结合。将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。又同时保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的达到很高的敏感性敏感性。抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适
5、的抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，底物在酶的作用下显色，底物在酶的作用下显色，底物在酶的作用下显色，颜色的深浅颜色的深浅颜色的深浅颜色的深浅与与与与特异性抗特异性抗特异性抗特异性抗体水平体水平体水平体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。成比例关系，可进行定性和定量分析。成比例关系，可进行定性和定量分析。成比例关系，可进行定性和定量分析。间接法间接法ELISA|间接法间接法间接法间接法ELISAELISA（IndirectELISAIndirectELISA）将特将特将特将特异性
6、抗原包被于固相载体表面，与标本中相异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人人人人IgGIgG或或或或IgMIgM抗体与之结合，洗涤后加入底抗体与之结合，洗涤后加入底抗体与之结合，洗涤后加入底抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。物显色。物显色。物显色。1.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤4.加入二加入二抗抗5.孵育孵育6.显色显色间接法间接法ELISA使用使用RFRF吸附剂
7、吸附剂 类风湿因子（10）是一种自身抗体，主要有IgM组成，能与抗原抗体复合物的FC段结合，非特异性IgM抗体（风湿因子）的存在将导致IgM检测出现假阳性结果。麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人抗人酶标IgM抗体类风湿因子阳阳性性结结果果假假阳阳性性结结果果RFRF吸附剂的组成吸附剂的组成RFRF吸附剂吸附剂人人IgGIgG抗体抗体Protein AProtein A羊抗人羊抗人IgGIgG 因此，在使用间接法因此，在使用间接法ELISAELISA进行进行IgMIgM检检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理处理 。捕获法捕获法ELISA|捕获法捕获法捕获法捕获
8、法ELISAELISA（CaptureELISACaptureELISA）专门专门专门专门用来检测用来检测用来检测用来检测IgMIgM型抗体的方法。将抗人型抗体的方法。将抗人型抗体的方法。将抗人型抗体的方法。将抗人IgMIgM抗抗抗抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人体包被于固相载体表面，与标本中所有人体包被于固相载体表面，与标本中所有人体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgMIgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性应的特异性应的特异性应的特异性IgMIgM抗体结合，洗涤后再加入
9、酶抗体结合，洗涤后再加入酶抗体结合，洗涤后再加入酶抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。底物显色。底物显色。底物显色。1.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤4.加入抗原加入抗原孵育孵育5.加入二抗加入二抗孵育孵育6.显色显色捕获法捕获法ELISAELISA试剂的组成试剂的组成固相载体：许多物质可以作为固相载体，固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是和聚苯
10、乙烯等等。目前最为常用的是聚聚苯乙烯苯乙烯材质的微孔板，多为材质的微孔板，多为8 81212道道9696孔孔板条。板条。 吸附能力吸附能力吸附能力吸附能力 通透性通透性通透性通透性 均一性均一性均一性均一性酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。产生非特异反应。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HorseRadishHorseRadish PeroxidasePeroxidase，简称简称简称简称HRPHRP）是目前应用最为广泛的酶，是从辣）是目前应用
11、最为广泛的酶，是从辣）是目前应用最为广泛的酶，是从辣）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。根菜的根中提取。根菜的根中提取。根菜的根中提取。碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AlkalineAlkalinePhosphatasePhosphatase ，简称，简称，简称，简称APAP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。取工艺复杂，价格比较昂贵。取工艺复杂，价格比较昂贵。取工艺复杂，价格比较昂贵。底物：底物：底物：底物：不同种类的酶要求使用不同的底
12、物不同种类的酶要求使用不同的底物不同种类的酶要求使用不同的底物不同种类的酶要求使用不同的底物。l lHRPHRPHRPHRP邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺（OrthopenylenediamineOrthopenylenediamineOrthopenylenediamineOrthopenylenediamine，OPDOPDOPDOPD） 、四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TetramethylbenzidineTetramethylbenzidineTetramethylbenzidineTetramethylbenzidine，TMBTMBTMBTMB）和）和）和）
13、和ABTSABTSABTSABTS 2,22,22,22,2- - - -连氮连氮连氮连氮- - - -双双双双-(3-(3-(3-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸乙基苯并噻唑啉磺酸乙基苯并噻唑啉磺酸乙基苯并噻唑啉磺酸) ) ) )，OPDOPDOPDOPD为在为在为在为在ELISAELISAELISAELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方中应用最多的底物，灵敏度高，比色方中应用最多的底物，灵敏度高，比色方中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性便，作用后变橙红色，
14、其缺点是配成应用液后稳定性差。差。差。差。TMBTMBTMBTMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。加酸停止酶反应后变黄色。加酸停止酶反应后变黄色。加酸停止酶反应后变黄色。l lAPAPAPAP对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphatep-nitrophenylphosphatep-nitrophenylphosphatep-nitrophenylphosphate，p-NPPp-NPPp-NP
15、Pp-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm405nm405nm有吸收峰。用有吸收峰。用有吸收峰。用有吸收峰。用NaOHNaOHNaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时终止酶反应后，黄色可稳定一段时终止酶反应后，黄色可稳定一段时终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。间。间。间。 洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在作用是普遍性的，因此在ELISAELISA在洗涤时在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
16、洗应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的涤是最主要的关键技术关键技术，应引起操作者的，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是是吐温吐温2020（聚山梨酯聚山梨酯）。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。标本稀释液：用来稀释血清标本，有时标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。也稀释酶结合物。RF吸附剂：在进行吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间抗体检测
17、时，间接接ELISA方法需要使用方法需要使用RF吸附剂去除类吸附剂去除类风湿因子的干扰作用。风湿因子的干扰作用。ELISA的质量控制的质量控制及注意事项及注意事项ELISA质量控制的目的质量控制的目的获得正确的检验结果。获得正确的检验结果。使不同时间和地点的使不同时间和地点的ELISA检验结果检验结果具有可比较性。具有可比较性。ELISA准确度准确度的影响因素的影响因素患病率患病率在检测真正感染疾病患者中，检测的在检测真正感染疾病患者中，检测的准确度随着该传染病在人群中的患病准确度随着该传染病在人群中的患病率的变化而改变。率的变化而改变。患病率越高，被检测者阳性是真阳性患病率越高，被检测者阳性
18、是真阳性的可能性就越大。的可能性就越大。患病率和阳性预测值患病率和阳性预测值(PPV)的关系的关系患病率患病率高高低低被检测数量被检测数量1000010000总阳性数总阳性数100030假阳性数量假阳性数量2727真阳性数量真阳性数量9733阳性预测值（阳性预测值（PPV）97.3%10%PPV=患病率灵敏度/患病率灵敏度+(1-患病率)(1-特异性)100%解决方法解决方法试剂试剂1试剂试剂2试剂试剂1+2敏感度敏感度特异度特异度99.0%99.0%99.5%99.9%(串联串联)患病率患病率PPVPPVPPV0.2%28.4%66.4%99.75%2.0%80.2%80.2%99.97%2
19、0.0%98.0%99.6%99.99%ELISA准确度准确度的影响因素的影响因素实验过程实验过程实验操作人员的教育背景和培训实验操作人员的教育背景和培训标本的条件标本的条件试验过程中的对照试验过程中的对照试剂试剂设备设备结果的解释结果的解释结果的抄写和报告结果的抄写和报告ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制仪器仪器n移液器，移液器，ELISA的加样量小，选择量程合适的的加样量小，选择量程合适的加样枪，其准确性直接影响试验结果。定期进加样枪，其准确性直接影响试验结果。定期进行校准。行校准。n水浴锅，有外部温度计对仪器温度进行校准。水浴锅，有外部温度计对仪器温度进行校准。n
20、洗板机，残留液体不能使拍干的纸变湿，定期洗板机，残留液体不能使拍干的纸变湿，定期检查加液孔有无堵塞。检查加液孔有无堵塞。n酶标仪，定期检查。酶标仪，定期检查。ELISA的标本最为常见的是血清（浆），有时因为特定的标本最为常见的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。1.要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标为标记酶的记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较测定中，如血清标本中血
21、红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的后面加入的HRP底物反应显色。底物反应显色。2.样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。测定方法产生非特异性干扰。ELISA实验过程中
22、涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制标本标本3.血清标本如是以无菌操作分离，则可以在血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在时间保存，应在-70以下。以下。4.冻存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。冻存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡
23、，反复冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。颠倒混匀即可。5.标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。应离心沉淀后取上清检测。p标准操作规程（标准操作规程（SOP）p实验纪录实验纪录日期日期操作人员操作人员试剂批号试剂批号试剂有效期试剂有效期p试剂准备，使用前在室温平衡试剂准备，使用前在室温平衡20min以上，以以上，以便在温育时很快达到反应要求温度，避免弱便在温育时很快达到反应要求温度，避免弱阳性标本产生假阴性结果。阳性标本产生假阴性结果。p水浴水浴ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程
24、中涉及的质量控制其它其它p试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内pELISA板的空白对照板的空白对照OD值在控制范围内值在控制范围内p实验室内部质控血清实验室内部质控血清(In-HouseControl,IHC)每次试验都要包括一个实验室质控血清。每次试验都要包括一个实验室质控血清。可以监测标本处理过程，而试剂质控只能监测之可以监测标本处理过程，而试剂质控只能监测之后的过程。后的过程。确保每次试验操作的正确性和结果的一致性。确保每次试验操作的正确性和结果的一致性。尤其是可以监测试剂不同批号之间的差异。尤其是可以监测试剂不同批号之间的差异。可以做质控图。可以做质控图
25、。ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制内部质控内部质控（IQC）包括）包括试剂质控和内部质控血清试剂质控和内部质控血清收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清，阳性血清，56加热加热30min灭活。灭活。用用0.45um滤器过滤除去污染物和杂质，用阴滤器过滤除去污染物和杂质，用阴性血清、正常人血清或性血清、正常人血清或PBS缓冲液将收集的缓冲液将收集的血清进行一系列稀释。血清进行一系列稀释。检测稀释标本并绘制检测稀释标本并绘制s形标准曲线。形标准曲线。选择选择Cutoff值值1.5至至3倍倍OD值所对应的稀释度，值所对应的稀释度
26、，作为作为IHC。一次准备一次准备12个月使用量，分装到血清管，每个月使用量，分装到血清管，每管管30ul，于，于-20保存备用。保存备用。内部质控血清内部质控血清（IHC）的制备的制备如何用内部质控血清如何用内部质控血清（IHC）做质控图做质控图在常规试验条件下，将在常规试验条件下，将IHC放在常规样本中，放在常规样本中，进行进行20次检测，计算均值和标准差（次检测，计算均值和标准差（SD）。并）。并绘制质控图。绘制质控图。2SD是一般公认的允许误差限度。是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时：每批测定放一份质控血清时：一次超过一次超过2SD2SD但小于但小于3SD3SD作为作为
27、 “告警告警”一次超出一次超出3SD3SD、连续二次超出、连续二次超出2SD2SD、3-53-5次连续处次连续处于一侧的于一侧的2SD2SD之内、之内、5 57 7次连续偏向横轴的一侧，次连续偏向横轴的一侧，均为失控均为失控 同一批号试剂和质控血清。同一批号试剂和质控血清。举例：质控图举例：质控图“即刻性即刻性”质控质控只需连续测只需连续测3次，即可对第次，即可对第3次检验结果进行质控。次检验结果进行质控。即刻法即刻法的建立具体计算方法如下：的建立具体计算方法如下：1)先将测定值从小到大排列先将测定值从小到大排列2)计算计算X和和SD。3)计算计算SDI上限和上限和SDI下限值。下限值。4)将
28、将SDI上限、上限、SDI下限值与下限值与SDI值中的数字比较。值中的数字比较。当当SDI上限值和上限值和SDI下限值下限值n2SD时，表示处于时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当各项计算；当SDI上限和上限和SDI下限有一值处于下限有一值处于n2SD和和n2SD值之间时，说明该值在值之间时，说明该值在2SD3SD范范围，处于围，处于“告警告警”状态；当状态；当SDI上限和上限和SDI下限有一下限有一值值n3SD时，说明该值已在时，说明该值已在3SD范围之外，属范围之外，属“失控失控”。数值处于。数值处于“告警告警”和和“
29、失控失控”状态应舍去，状态应舍去，重新测定。重新测定。Nn3sn2snn3sn2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.702.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56SI值表值表 ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制外部质控外部质控ELISA试验中的外部质控试验中的外部质控(EQA)用于连续地、客观地评价不同实验室
30、之间的检测结果，用于连续地、客观地评价不同实验室之间的检测结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。主要控制试验结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。主要控制试验结果的准确度结果的准确度。p发放质控血清（组合血清）进行调查（发放质控血清（组合血清）进行调查（PT）。定期发放质控血）。定期发放质控血清至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结清至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果上报。果上报。p由上级实验室定期对下级的检测结果进行复核由上级实验室定期对下级的检测结果进行复核。p现场调查，携带质控血清到实验室进行现场操作，并对结果进现场调查，携带质控血清到实验室进行现场操作，并对结果进行评价。行评价。
