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1、 重组重组DNA技术技术生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因： （1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。生物技术将是未来经济发展的新动力第一次技术革命 工业革命解放人的双手第二次技术革命 信息技术扩展人的大脑第三次技术革命 生物技术改造生命本身基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术直接相关联的学科：分子生
2、物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、生物信息学、化学工程学、医药学等。对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术l生物技术的主要内容 基因工程亦称遗传工程，即利用基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方重组技术的方法，把法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的（目的基因）和载体基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（胞的繁殖而增殖（
3、cloning，克隆），或最后得到表达，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。 基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物术之一，是许多分子生物术之一，是许多分子生物术之一，是许多分子生物, ,生物化学和细胞生物学实验实生物化学和细胞生物学实验实生物化学和细胞生物学实验实生物化学和细胞生物学实验实施的基础。施的基础。施的基础。施的基础。 现代基因工程的创始人现代基
4、因工程的创始人PP伯格伯格伯格伯格（美国（美国,1926,1926）在）在19601960年以敏锐的科学预见年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？19721972年，伯格把年，伯格把两种病毒的两种病毒的DNADNA用同一种限制性内切酶切割后，再用用同一种限制性内切酶切割后，再用DNADNA连接酶把这两种连接酶把这两种DNADNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组分子连接起
5、来，于是产生了一种新的重组DNADNA分子，首次实现两种不同生物的分子，首次实现两种不同生物的DNADNA体外连接，获得了第一批重组体外连接，获得了第一批重组DNADNA分子，这标志着基因工程分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了19801980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖。 19731973年，美国斯坦福大学教授年，美国斯坦福大学教授SS科恩科恩科恩科恩和加州大学旧金山分校教授和加州大学旧金山分校教授HWHW博耶博耶博耶博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，链霉素
6、质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“ “杂合质粒杂合质粒” ”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。 科恩随后以科恩随后以DNADNA重组技术发明人的身份向美国专利重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打着自
7、然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。传特性，甚至创造新的生命类型。 19771977年，吉尔伯特（年，吉尔伯特（W WGilbertGilbert）分别将编码）分别将编码胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素和干扰素和干扰素和干扰素和干扰素的的DNADNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。 基因工程的应用重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）克隆:目的基因与载体连
8、接，形成重组的DNA分子；（3）转化：用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）筛选：对转化子筛选和鉴定；（5）大量培养：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。DNA重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因） 切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞）转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系 目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总体技术路线总体技术路线(分分)-目的基因及载体的分离目的基
9、因及载体的分离获得需要的目的基因常用的方法：（1 1）化学合成）化学合成（2 2）基因组文库）基因组文库(genomic DNA library)(genomic DNA library)（3 3）cDNAcDNA文库文库（4 4）聚合酶链式反应（）聚合酶链式反应（PCRPCR）化学合成根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸较短的核酸片段（片段（60-80bp60-80bp） 多肽链的氨基酸顺序mRNA的碱基排列顺序相应
10、的基因结构化学合成目的基因化学合成的不足之处在于：（）要已知基因的核苷酸顺序；（）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（）价格昂贵。 化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。用途：用途： PCRPCR引物引物, ,测序引物测序引物, ,定点突变定点突变, ,核酸杂交探针核酸杂交探针基因组文库基因组文库细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建 基基因因组组DNA：在在真真核核生生物物体体，基基因因组组是是指指一一套套完完整整单单倍倍体体DNA（染染色色体体DNA）和和
11、线线粒粒体体DNA的全部序列。的全部序列。基因组文库 基基因因组组文文库库是是含含有有某某种种生生物物全全部部基基因因片片断断的的DNADNA克克隆隆群群体体。直直接接从从生生物物体体中中提提取取总总DNADNA，用用超超声声或或酶酶处处理理，将将染染色色体体DNADNA切切割割成成片片断断，插插入入载载体体，转转入入受受体体菌菌扩扩增增，得得到到基基因因组组DNADNA文文库库，从从中中调调用用目目的的基因；基因； 缺缺点点: : 结结构构基基因因只只含含基基因因组组很很小小一一部部分分，有有重重复复序序列列，假假基基因因。真真核核生生物物基基因因组组有有内内含含子子。这这些些给从基因组克隆
12、目的基因带来困难。给从基因组克隆目的基因带来困难。细胞内总DNA的提取分离程序苯酚沉淀蛋白质乙醇浓缩DNA组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌将将总总DNADNA经经过过酶酶解解，经经蔗蔗糖糖梯梯度度离离心心或或琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离不不同同长长短短的的DNADNA片片段段。包包含含的的基基因因组组片片段段分分别别克克隆隆在在质质粒粒或或噬噬菌菌体体载载体体上上，转转染染细细菌菌或或体体外外包包装装到到噬噬菌菌体体颗颗粒粒上上便便构构成成了了
13、该该生物的基因组文库。生物的基因组文库。基因组基因组DNA文库文库cDNAcDNA文库文库cDNA文库的构建文库的构建mRNA反转录酶cDNA(互补DNA）DNA聚合酶第二条DNA链用细胞总用细胞总mRNA，制备全套双链，制备全套双链cDNA后，建立后，建立的基因文库。简称的基因文库。简称cDNA文库。文库。以以mRNA为模板，为模板，用反转录酶，合成用反转录酶，合成与与mRNA互补的互补的cDNA(complementary DNA, cDNA) 片段，插片段，插入载体，转入受体入载体，转入受体菌扩增，得到菌扩增，得到cDNA文库；文库；n 比较基因组文库与cDNA文库 构建基因组文库获取目
14、的基因存在的问题费时费事内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势 不含内含子序列获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术PCR(Polymerasechainreaction)-聚合酶链式反应分子生物学，医学，考古，法医美国Mullis教授1988年发明了PCR技术1993年获得诺贝尔奖聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）Polymerase Chain Reaction载体载体DNA的选择的选择可转移性可转移性,为目的基因提供进入
15、受体细胞的为目的基因提供进入受体细胞的转移转移能力。能力。合适的复制位点合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞中的为目的基因提供在受体细胞中的复制能复制能力或整合能力。力或整合能力。多克隆位点：广泛、特异多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源分子较小，可容纳较大的外源DNA理想载体的基本条件：理想载体的基本条件：质粒质粒噬菌体噬菌体腺病毒载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体种类：种类：质粒载体的一般结构质粒载体的一般结构存在于细菌染色存在于细菌染色存在于细菌染色存在于细菌染色体外的小型环状体外的小型环状体外的小型环状体外的小型环
16、状DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。具有具有具有具有自我复制自我复制自我复制自我复制功功功功能。能。能。能。带有抗性基因及带有抗性基因及带有抗性基因及带有抗性基因及表型识别等表型识别等表型识别等表型识别等遗传遗传遗传遗传性标记物性标记物性标记物性标记物。经改造后具有经改造后具有经改造后具有经改造后具有多多多多克隆位点。克隆位点。克隆位点。克隆位点。DNA重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞）转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体
17、系切切-限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切限制性内切酶酶切酶酶切酶切载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺多种，所识别的顺序往往为序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突突出粘性末端和出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。
18、突出粘性末端三种情况。形成粘性末端形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载者较有利于载体体DNA和目的基因的重组。和目的基因的重组。DNA重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞）转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系接接-载体和目的基因的载体和目的基因的连接连接即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的起来，得到重新组合后的DNA分子。分子。（一）粘性末端连接法：（一）粘
19、性末端连接法：当载体当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。接。载体DNA与目的基因的连接（二）人工接尾法：（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同即同聚物加尾连接法。当
20、载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的体或目的基因的3-端，如载体上添加一段端，如载体上添加一段polyG，则，则可在目的基因上添加一段可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。连接酶连接。 （三）人工接头连接法
21、：（三）人工接头连接法：将人工连接器（将人工连接器（linker,即一段人工合成的含有多种限即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子制酶切点的小分子DNA片段片段,约约1020个核苷酸，个核苷酸， ）连接到平末端连接到平末端DNA分子分子(载体和目的基因载体和目的基因)上，即有可上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。到可以互补的粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。DNA重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因） 切（割目的基因和载体）
22、接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞）转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系转转-重组体的转化重组体的转化受体细胞重组体的转化重组体的转化宿主菌或受体细胞宿主菌或受体细胞真核系统 酵母菌酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞原核系统 大肠杆菌 枯草杆菌原核细胞的转化（细菌转化）受体细胞的选择限制缺陷型: 避免修饰和降解重组缺陷型： 避免重组整合转化亲和型： 较高的可转化性遗传互补型： 利于筛选感染缺陷型： 防止感染感受态细胞感受态细胞（competentcellcompetentcell）所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子
23、的生理状态。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competent cells)。大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞得到噬菌斑或单菌落与重组DNA共同冰浴而后42短暂热刺激CaCl2处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌转化转化E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受体细胞
24、。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。转化方法转化方法真核细胞的转染真核细胞的转染受体细胞系统 永生细胞系 细胞特异性的选择标记对抗某种药物对抗某种药物电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。转转转转染染染染方法方法方法方法磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和和NaH2PO4组成的组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包
25、裹在沉淀中。将这包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞被细胞内的核酸酶水解。内的核酸酶水解。磷酸钙介导的转染重组体 + + 磷酸钙微粒内吞作用重组体进入细胞大颗粒基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆
26、性的穿孔，使DNA进入细胞。显微注射法：利用毛细管直接将DNA注入细胞内。脂质体（liposome）介导法：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。多聚物介导法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。DNA重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞）转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向
27、”体系重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定转化后的克隆群体：阳性重组子的阳性重组子的筛选与筛选与鉴定鉴定1、遗传检测法遗传检测法( (根据重组载体的标志作筛选)-插入失活法-互补法2.限制性酶切法3.PCR法4.杂交筛选法5.免疫学方法6.核苷酸序列测定法遗传检测法菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入插入灭活法灭活法进行筛选。如进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四霉素和抗四
28、环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 如果外源如果外源DNA插入，氨卞青霉插入，氨卞青霉素抗性基因失活素抗性基因失活 如果外源如果外源DNA插插入，四环素抗性基入，四环素抗性基因失活因失活pBR322质粒结构pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmpAmpAm
29、p平板平板平板平板TetTetTetTet平板平板平板平板-互补法互补法蓝白筛选蓝白筛选现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端个氨基酸偏码区（全长1201氨基酸）。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌是Z基因突变型，只含编码半乳糖苷酶端的序列。当外源基因插入时，在IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）诱导下合成半乳糖苷酶N端片断,和受体菌的C端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的半乳糖苷酶,称互补。具有互补的细菌培养在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）的培养基上.X-gal本身是无色
30、的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。-互补法互补法限制性酶切法经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。凝胶电泳检测加样孔DNA Marke
31、rDNA Marker空质粒空质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段PCR法法利用的目标引物(例如分离目的基因所使用的引物),抽提需要筛选的克隆的重组DNA作为模板,进行PCR扩增,根据是否扩增出目的片段来确定阳性克隆.杂交筛选法杂交筛选法为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重
32、组体中带目的基因。体中带目的基因。32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法分子杂交依据：碱基互补配对原则合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记）升高温度或改变pH使DNA变性分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。步骤：免疫化学检测法滤膜（固定抗体）+DNA序列分析法序列分析法 该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。ACTGAAGGCTDNA重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞）转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆
33、）筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系外源基因在宿主细胞中的表达外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌（ E.coliE.coli）受体细胞外源基因在宿主细胞中的表达原核生物基因结构和表达特点原核生物基因结构和表达特点1.原核生物染色体原核生物染色体DNA是裸露的环形是裸露的环形DNA，其，其转录和翻译是偶联的连续进行。转录和翻译是偶联的连续进行。 2.原核生物形成多顺反子原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。肽链。 3、一般不含内含子（、一般不含内
34、含子（intron），没有转录及翻译后），没有转录及翻译后加工系统加工系统。 4、原原核核生生物物中中功功能能相相关关的的基基因因串串联联在在一一起起，形形成成操操纵纵子子。操操纵纵子子是是一一组组功功能能上上相相关关，受受同同一一调调控区控制的基因组成的一个遗传单位控区控制的基因组成的一个遗传单位。启动子启动子(promoter, P)是指能被是指能被RNA聚合酶识聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。序列。 一般长一般长40-60bp，富含，富含A-T碱基对碱基对具有保守序列：具有保守序列： -10区（区（pribnow box）：）：TATAAT -
35、35区：区： 终止子（终止子（terminatorterminator，T T）: :位于基因位于基因3 3端端, ,给予给予RNARNA聚合酶转录终止信号的聚合酶转录终止信号的DNADNA序列序列 5、原核生物中参与转录的基因结构：、原核生物中参与转录的基因结构：翻译起始密码子翻译起始密码子AUG 或或GUGSD顺序（顺序（shine-dalgarno）：）：AUG上游上游3-11 bp长约长约3-9bpmRNA与与16s核核糖糖体体亚亚基基间间的的识识别别与与结合序列结合序列 6、与翻译有关的原核细胞结构：、与翻译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点核糖体结合位点人类对大肠杆菌经过长期的研究
36、，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有几十年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所需要的元件，包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列等；外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等；外源基因还应当插入到适合于表达的
37、位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点；此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等。原核表达载体原核表达载体(expressing vector)特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：启动子启动子终止子终止子SDmRNA
38、多肽链原核表达系统的缺点原核表达系统的缺点没有真核转录后加工的功能，不能进行没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表的剪接，所以只能表达达cDNA而不能表达真核的基因组基因；而不能表达真核的基因组基因；没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；生的蛋白质常没有足够的生物学活性；表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（表达的蛋白质经常是不
39、溶的，会在细菌内聚集成包涵体（inclusion body），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性（纯化，但无生物活性的不溶
40、性蛋白，要经过复性（renaturation），），使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。 真核表达系统的必要性及优势真核表达系统的必要性及优势1. 具转录后加工系统具转录后加工系统2. 具翻译后修饰系统具翻译后修饰系统3. 可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达4. 基因治疗基因治疗基因载体基因载体目的基因目的基因 质粒
41、质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 病毒病毒病毒病毒 PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA 化学合成化学合成化学合成化学合成 基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库限制性内切酶限制性内切酶有切口的载体有切口的载体有切口的目的基因有切口的目的基因DNADNA连接酶连接酶 重组体重组体 转化转化转化转化 转染转染转染转染 体外包装体外包装体外包装体外包装带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞 表型筛选表型筛选表型筛选表型筛选 电泳法电泳法电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法目的基因的表达基因工程用于生产蛋白质类药物基因工程用于生产蛋白质类药物治疗糖尿病的胰岛素，是一种51个氨基酸残基组成的蛋白质1982年美国EliLilly公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。1升发酵液中所得的干扰素相当于过去从1000升人血中所得。生产成本也大为降低。目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物，现在用基因工程办法便可能大量生产。
