细胞生物学研究方法#上课课堂

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1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学 第三章细胞生物学的研究方法郭兆峰10生物工程学号:1041773061第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节细胞及生物大分子的动态变化 第五节模式生物与功能基因组的研究 学习内容2第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜一、光学显微镜(light microscopy) （一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜（二）

2、相差显微镜和微分干涉显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜（四）激光扫描共焦显微镜（四）激光扫描共焦显微镜（五）其他（五）其他二、电子显微镜二、电子显微镜(Electro microscopy)3第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜1. 1. 构成：构成： 光学放大系统：目镜与物镜光学放大系统：目镜与物镜 照明系统：光源和聚光镜照明系统：光源和聚光镜 机械装置：镜架和样品调节系统机械装置：镜架和样品调节系统2. 2. 原理：物体经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放原理：物体经物镜形成

3、倒立实像，经目镜进一步放大成像。大成像。4第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学0.61 分辨率分辨率 DN . sin/2=分辨率分辨率(resolusion)：区分两个质点间的最小距离。：区分两个质点间的最小距离。其中其中: N=: N=标本和物镜之间介质折射标本和物镜之间介质折射率；率； =入射光线波波长；入射光线波波长； =镜口角（样品对物镜镜口镜口角（样品对物镜镜口的张角）的张角） Nsin/2Nsin/2称为物镜的数值孔径称为物镜的数值孔径5第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的

4、玻璃折射率为制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.781.651.78，所用介，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。质的折射率越接近玻璃的越好。sin /2sin /2的最大值必然小于的最大值必然小于1 1；介质为空气，镜口率一；介质为空气，镜口率一般为般为0.050.950.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近近1.51.5。普通光线的波长为普通光线的波长为400700nm400700nm，分辨力数值不会小于，分辨力数值不会小于0.2m0.2m，人眼的分辨力为，人眼的分辨力为0.2mm0.2mm，因此显微镜的最大设，因此显微镜的最大设计倍数为计

5、倍数为1000X1000X。6第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学1.1.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比。差，表现为明与暗的对比。2.2.两个特殊构件：两个特殊构件：环状光阑（环状光阑（annular diaphragmannular diaphragm）：位于光源与聚光）：位于光源与聚光器之间。器之间。相位板（相位板（annular phaseplateannular phaseplate）：涂有光吸收物质）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。和相位推迟物质。3.用途：能观察无色、透

6、明、活细胞中的结构。用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。（二）相差显微镜7第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学决定光学显微镜分辨率的要决定光学显微镜分辨率的要素：物镜的镜口角（素：物镜的镜口角（），），入射光的波长（入射光的波长（ ），介质），介质的折射率（的折射率（N）A A 两束光的相位相同是，干涉两束光的相位相同是，干涉使光的振幅加强使光的振幅加强 ，B B 相位相相位相反是，干涉使光的振幅减弱反是，干涉使光的振幅减弱8第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学1.1.原理：原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的利用两

7、组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。明暗效果，能显示结构的三维立体投影。 微分干涉显微镜微分干涉显微镜2.2.应用：应用：适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。计算机辅助的计算机辅助的DICDIC分辨率比普通光镜提高了一个数分辨率比普通光镜提高了一个数量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（video-video-enhance microscopyenhance microscopy）可以观察）可以观察微管上颗粒的运动微管上颗粒的运动。9第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞

8、生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜 Fluorescence microscopeFluorescence microscope1.1.原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的位置。位置。2.2.特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊的滤色镜；分辨率高。的滤色镜；分辨率高。3.3.用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生

9、物大分子的定性、定位。的定性、定位。既可以观察切片，也可以进行活既可以观察切片，也可以进行活体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。 10第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学荧光的基本原理及其应用11第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（四）激光扫描共聚焦显微镜 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描, ,形成立体形成立体图像，可重构样品的三维结构。图像，可重构样品的三维结构。能显示细胞样品的立体结构。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光

10、学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。用途类似荧光显微镜，但可以排除焦平面以外光的干用途类似荧光显微镜，但可以排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率。扰，增强图像反差和提高分辨率。12第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学 激光扫描共聚焦显微镜的原理13第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学倒置显微镜倒置显微镜 荧光共振能量转移技荧光共振能量转移技 (Fluorescence resonance energy (Fluorescence resonance energy transfer, FRET)trans

11、fer, FRET)(五)其他光学显微镜荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术14第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学二电子显微镜15第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。（一）原理16第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细

12、胞生物学生物学17第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压波长与加速电压( (通常通常50120KV)50120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等统、电源系统等5 5部分构成。部分构成。分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍数可达百万倍。，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构即小于用于观察超微结构即小于0.20.2 m m、光学显微镜

13、下无法看清、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构。的结构，又称亚显微结构。电子显微镜的优点电子显微镜的优点18第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学显微显微镜镜分辨分辨本领本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理光镜光镜200nm200nm可见光可见光（400-700nm400-700nm） 玻璃玻璃透镜透镜不要求真空不要求真空利用样品对光的吸收利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色形成明暗反差和颜色变化变化电镜电镜0.1nm0.1nm电子束电子束（0.01-0.9nm0.01-0.9nm）电磁电磁透镜透镜1.33x101.33x10-5-51.33x1

14、01.33x10-3-3PaPa利用样品对电子的散利用样品对电子的散射和透射形成明暗反射和透射形成明暗反差差电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较19第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（二）（二） 主要电镜制样技术主要电镜制样技术1. 1. 超薄切片技术超薄切片技术制作超薄切片流程：制作超薄切片流程： 固定固定 包埋包埋 切片切片 染色染色通常以锇酸和戊二醛固定样品，通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色重金属（铀、铅）盐染色20第三章第

15、三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学21第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学2. 2. 负染色技术负染色技术用重金属盐用重金属盐( (如磷钨酸如磷钨酸) )对铺展在载网对铺展在载网 上的样品染色；上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达达1.5nm1.5nm左右。左右。22第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学3. 3. 冷冻蚀刻技术

16、冷冻蚀刻技术亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜来，此膜即为复膜23第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学24第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学4. 4. 电镜三维重构与低温电镜技术电镜三维重构与低温电镜技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成电子

17、显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。的具有重要应用前景的一门新技术。的具有重要应用前景的一门新技术。的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学要研究生物大分子分析技术相结合，是当前结构生物学要研究生物大分子分析技术相结合，是当前结构生物学要研究生物大

18、分子分析技术相结合，是当前结构生物学要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。空间结构及其相互关系的主要实验手段。空间结构及其相互关系的主要实验手段。空间结构及其相互关系的主要实验手段。 25第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学5. 5. 扫描电镜技术扫描电镜技术工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，由探测器收集，信号经放

19、大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。号。26第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学扫描电镜原理示意图扫描电镜原理示意图27第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学三三 扫面隧道显微镜扫面隧道显微镜原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳原理：根据隧

20、道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V2mV2V2mV2V2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，

21、将扫描过程中电流的变化转换为图像，样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。即可显示出原子水平的凹凸形态。即可显示出原子水平的凹凸形态。即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为分辨率：横向为分辨率：横向为分辨率：横向为0.10.2nm0.10.2nm0.10.2nm0.10.2nm，纵向可达，纵向可达，纵向可达，纵向可达0.001nm0.001nm0.001nm0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。用途：

22、三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。28第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学扫面隧道显微镜主要特点：扫面隧道显微镜主要特点：具有原子尺度的高分辨本领，侧分辨率为具有原子尺度的高分辨本领，侧分辨率为0.10.1到到0.2nm0.2nm，纵分辨率为纵分辨率为0.001nm0.001nm可以在真空、大气、液体等多种环境下工作可以在真空、大气、液体等多种环境下工作非破坏性测量非破坏性测量29第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学第二节细

23、胞及其组分的分析方法一超离心技术分离细胞组分二细胞组分的细胞化学显示方法三特异蛋白抗原的定位与定性四细胞内特异核酸的定位与定性五定量细胞化学分析与细胞分选技术30第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学一超离心技术分离细胞组分是分离细胞器及各种大分子基本手段。是分离细胞器及各种大分子基本手段。转速为转速为1025kr/min1025kr/min的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。转速转速25kr/min25kr/min，离心力，离心力89K89K者称为超速离心机。者称为超速离心机。超速离心机的最高转速可达超速离心机的最高转速可达100000r/min1

24、00000r/min，离心力超过，离心力超过500Kg500Kg。31第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学差速离心：分离差速离心：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。大小相差悬殊的细胞和细胞器。大小相差悬殊的细胞和细胞器。大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核沉降顺序：核沉降顺序：核沉降顺序：核线粒体线粒体线粒体线粒体溶酶体与过氧化物溶酶体与过氧化物溶酶体与过氧化物溶酶体与过氧化物酶体酶体酶体酶体内质网与高基体内质网与高基体内质网与高基体内质网与高基体核蛋白体。核蛋白体。核蛋白体。核蛋白体。密度梯度离心：将分离的细胞组分放在密度逐渐增加、高溶解密度梯度离心：将分

25、离的细胞组分放在密度逐渐增加、高溶解密度梯度离心：将分离的细胞组分放在密度逐渐增加、高溶解密度梯度离心：将分离的细胞组分放在密度逐渐增加、高溶解度性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面通过重力或离心作用使度性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面通过重力或离心作用使度性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面通过重力或离心作用使度性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面通过重力或离心作用使样品中不同组分以不同速率沉降。样品中不同组分以不同速率沉降。样品中不同组分以不同速率沉降。样品中不同组分以不同速率沉降。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分等密度沉降用于分

26、离不同密度的组分等密度沉降用于分离不同密度的组分32第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学二细胞组分的细胞化学显示方法DNADNA：福尔根（：福尔根（FeulgenFeulgen）反应紫红色）反应紫红色多糖类：多糖类：PASPAS反应黄色反应黄色脂肪：苏丹脂肪：苏丹IIIIII红色红色蛋白质：米伦（蛋白质：米伦（MillonMillon）红色）红色细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类等物质，利用一些显色剂细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类等物质，利用一些显色剂与所检测物质中的一些特殊基团特异性结合，显现出颜色来判断与所检测物质中的一些特殊基团特异性结合，显现出颜色

27、来判断含量和分布的技术含量和分布的技术33第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学1.金金属属沉沉淀淀法法：如如磷磷酸酸酶酶分分解解磷磷酸酸酯酯底底物物后后，反反应应产产物物最最终终生生成成CoS或或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。有色沉淀，而显示出酶活性。2.Schiff反反应应：醛醛基基可可使使Schiff试试剂剂中中的的无无色色品品红红变变为为红红色色。用用于于显显示示糖和脱氧核糖核酸。糖和脱氧核糖核酸。3.联联苯苯胺胺反反应应：过过氧氧化化酶酶分分解解H202，产产生生新新生生氧氧，后后者者再再将将无无色色联联苯苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。胺氧

28、化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。4.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。5.茚三酮反应：显示蛋白质。茚三酮反应：显示蛋白质。显示方法显示方法34第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学三特异蛋白抗原的定位与定性1 1、免疫荧光技术、免疫荧光技术将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白在将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白在细胞内的分布。常用的荧光素细胞内的分布。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、罗丹有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。有直接免疫荧光和间接免疫荧光。明等。有直接免疫荧光和间接免疫荧光。35第三

29、章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学A A 直接免疫荧光标记技术：将荧光分子与抗体欧联后直接免疫荧光标记技术：将荧光分子与抗体欧联后直接用于免疫标记技术直接用于免疫标记技术B B 间接免疫标记技术：先将抗体（称第一抗体）与抗间接免疫标记技术：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体（称第二抗体）。体（称第二抗体）。36第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学2免疫电镜技术将样品进行特殊标记增强反差，从而进行亚细胞结构和将样品进行特殊标记增强反差，从而进

30、行亚细胞结构和分子的定位。分子的定位。特点特点: 分辨率高分辨率高根据标记方法不同分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技根据标记方法不同分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。术和免疫胶体金技术。37第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学四四 细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性通常采用原位杂交技术细胞内特异核酸的定位与定性通常采用原位杂交技术原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异性核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。特异性核苷酸序列在染色体上或细胞中

31、的位置的方法。38第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学A A 免疫胶体金标记技术原理示免疫胶体金标记技术原理示意图，细菌蛋白意图，细菌蛋白A A可以与胶体金可以与胶体金结合，也和与胶体的结合，也和与胶体的FcFc端特异端特异性结合性结合B B免疫胶体金标记显示膀胱上皮免疫胶体金标记显示膀胱上皮细胞膜蛋白的分布细胞膜蛋白的分布39第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学免疫胶体金技术免疫胶体金技术：胶体金是直径1-100mm的金颗粒分散在水中形成的金溶胶。特点：特异性强容易识别分辨率高40第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研

32、究方法细胞细胞生物学生物学五五 定量细胞化学分析与细胞分选技术定量细胞化学分析与细胞分选技术原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送发出散射光和荧光，经探测器检

33、测，转换为电信号，送发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%99%99%99%。包被细胞的液。包被细胞的液。包被细胞的液。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计流称为鞘液，所用仪器称为流式细

34、胞计41第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。42第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学A 流式细胞仪分选原理示意图B 显示流式细胞仪分析处在不同相的HaLa细胞的实验结果43第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学第三节细胞培养与细胞工程细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，细胞工程技术是

35、细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要是利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学主要是利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先设计，有计划地改变或的技术手段，按照人们预先设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。主要内容包括：细胞融合、创造细胞遗传性的技术。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、基因转移、细胞及细胞生物反应器、染色体转移、基因转移、细胞及组织培养等。目的是获得细胞产品或利用细胞本身。组织培养等。目的是获得细胞产品或利用细胞本身。44第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（一）动物细胞培养原代细胞原代细胞 ：1 110

36、10代以内的细胞代以内的细胞原代细胞的培养：提取健康动物的组织块，剪碎用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与螯合剂等将细胞分散给予良好的营养液与无菌环境在培养中进行慢速转动或静止培养无论何种培养液都要加入一定量的小牛血清45第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学贴壁培养贴壁培养：培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，保持接触抑制（保持接触抑制（contact inhibitioncontact inhibition），也叫单层细胞培），也叫单层细胞培养。养。细胞系细胞系：能够传代：能够传代40-5040-50次并且仍保持原来染色体

37、的次并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为的传代细胞。二倍体数量及接触抑制行为的传代细胞。特点：有部分细胞遗传物质发生改变，有癌变的倾向特点：有部分细胞遗传物质发生改变，有癌变的倾向细胞株细胞株：经过生物学鉴定具有特殊遗传标记或性：经过生物学鉴定具有特殊遗传标记或性质的细胞克隆质的细胞克隆46第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学连续细胞系（永生细胞系）：5050代以后的代以后的 、遗传物质发生改变、遗传物质发生改变、能够无限制的的传代培能够无限制的的传代培养下去的养下去的特点：染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体失去接触抑制，容易传代培养A正在分裂

38、的HeLa细胞B长满单层的CHO原代细胞47第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学实验室中常用的几种连续细胞系细胞系名称细胞系名称细胞类型细胞类型来源来源3T33T3成纤维细胞成纤维细胞小鼠小鼠HeLaHeLa宫颈癌上皮细胞宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks Henrietta Lacks BHK21BHK21成纤维细胞成纤维细胞叙利亚仓鼠叙利亚仓鼠PtKlPtKl上皮细胞上皮细胞袋鼠袋鼠L6L6成肌细胞成肌细胞大鼠大鼠PCI2PCI2嗜铬细胞嗜铬细胞大鼠大鼠SP2SP2浆细胞浆细胞小鼠小鼠SP2SP20 0骨髓瘤浆细胞骨髓瘤浆细胞小鼠小鼠CHOCHO

39、卵巢细胞卵巢细胞中国地鼠中国地鼠48第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学(二)植物细胞培养单倍体细胞培养：花药在培养基上人工培养小孢子直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株原生质体培养：除去细胞壁的细胞诱导分化长成植株用不同的植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，长成体细胞杂交植株49第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学细胞工程细胞工程基本技术主要包括：细胞体外培养细胞融合细胞器移植及细胞工程，就是应用细胞生物学和分子生物学的方法，对细胞进行操作。50第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生

40、物学研究方法细胞细胞生物学生物学细胞融合：两个细胞融合成一个双核或多核细胞核的现象细胞融合：两个细胞融合成一个双核或多核细胞核的现象动物细胞融合：灭活病毒动物细胞融合：灭活病毒 ( (仙台病毒）或化学物质仙台病毒）或化学物质 ( (聚乙聚乙二醇二醇 PEG)PEG)介导形成融合细胞。介导形成融合细胞。植物细胞融合：先用纤维素酶去壁植物细胞融合：先用纤维素酶去壁电融合：电融合： 在高压电脉冲在高压电脉冲 (1-1.8kv/cm)(1-1.8kv/cm)下促使融合。下促使融合。（一） 细胞融合与单克隆抗体技术51第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学同核融合细胞：基

41、因型相同的细胞形成的融合细胞异核融合细胞：基因型不同的细胞形成的融合细胞融合核细胞：通过细胞杂交形成的单核子细胞52第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学单克隆抗体：高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞。1975年英国人Kohler和Milstein发明，因此获1984年诺贝尔奖。原理：淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能无限分裂，而瘤细胞虽然可以在体外长期培养，但不分泌抗体。将这两种细胞融合得到的杂交瘤细胞具有两个亲本的特性，既能产生抗体又能无限增殖。53第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生

42、物学生物学操作过程：将小鼠的髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）在聚乙醇或灭活的病毒介导下发生融合54第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学融合后的杂交瘤细胞具有两种细胞的特性一、可以分泌抗绵羊红细胞的抗体二、像肿瘤细胞一样，可以在体外培养条件下或移植到体内无限增殖单克隆抗体的主要优点：是可以用混合性的异质抗原制备出针对某单一性抗原分子上特异决定簇的同性质单克隆抗体。55第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（二）显微操作技术与动物的克隆细胞拆合细胞拆合物理方法：机械/短波光去核移入去核的细胞中杂交细胞显微操作仪

43、化学方法：松胞素处理细胞离心拆分细胞核体外包一层细胞膜和少量胞浆（小细胞）PEG介导核体可同另一胞质体融合重组细胞可合成RNA和进行细胞分裂结合胚胎移植技术直接应用于育种56第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学第四节细胞及生物大分子的动态变化（一）荧光漂白恢复技术（FPR）用亲脂性或亲水性的荧光分子与蛋白或脂质偶联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率原理：利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内的标记分子发生不可逆的淬灭，称为漂白区，随着脂质分子或蛋白质的运动，漂白区逐渐恢复到原有水平57第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生

44、物学研究方法细胞细胞生物学生物学荧光漂白技术原理示意图58第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（二）单分子技术与细胞生命活动的研究单分子技术是在细胞内实现观测单一分子运动规律的技术，可以在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上精确测量单个分子的距离、位置、指向、分布、结构以及各种动态过程分类：可以从工作原理或测量参数分类以工作原理分成单分子光谱及成像、单分子操作及力学性质测量优点：实时直接观测单个分子的反应动力学的途径测量单一分子间相互作用力捕捉单一分子随机过程和分子构象变化的中间态测量稀发但重要的信号和分布测量非平衡态和不同步的体系59第三章第三章 细胞生物学研究方法

45、细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（三）酵母双杂交技术酵母双杂交系统巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域和转录激活结构域是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。60第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学用于与检测蛋白质和蛋白质互做的酵母双杂交技术原理示意图61第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（四）荧光共振能量转移

46、技术原理：在一定波长的激发光照下，只有携带发光基团A的供体分子可以被激发出波长是A的荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团B的受体分子发出波长是B的荧光，当吸收光谱A和吸收光谱B重叠，并且两个发光基团距离小到一定程度时会发生不同程度的能量转移，受体分子发出了波长是B的荧光62第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学荧光共振能量转移原理图63第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（五） 放射自显影技术原理：利用放射性同位素的电离射线对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究步骤：选合适的放射性前体分子做标记按标记时

47、间做标记制片曝光再显影定影观察特点:可以对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪64第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学第五节模式生物与功能基因组的研究（一）细胞生物学研究常用的模式生物理想的研究材料是研究成功的关键。在生物研究中通常采用：噬菌体、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、四膜虫、黏菌海胆、拟南芥、斑马鱼和小鼠等模式生物通常具有的特征是个体较小、容易培养、操作简单65第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学大肠杆菌原核生物的代表，一条环状DNA，大约编码4288个基因特点：培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变、分离和鉴定容易

48、酵母单细胞真核细胞的代表，有芽殖酵母，裂殖酵母芽殖酵母好友16条线性染色体具有6000个可读框裂殖酵母的基因分布在3条染色体上，编码约4800个蛋白质66第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学线虫成体长约1mm，由959个细胞组成线虫繁殖快，生长周期为3天，在显微镜下通体透明。胚胎发育过程中细胞分裂、分化及死亡具有高度的程序性果蝇黑腹果蝇大约编码13600个基因作为遗传学的模式生物有100多年，与人类基因有很高的同源性67第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学（二） 突变体制备技术RNA干扰法包括瞬时干扰和永久干扰RNAi是利用一

49、段特异的双链RNA或单链反义RNA通过注射、转染或转基因的方法导入到细胞或模式生物中68第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学DNA敲除法化学诱变法：喂食有化学诱变剂的食物造成配子染色体突变特点：突变率高、但基因难定位P因子介导的突变：利用转座子带走部分DNA序列改变基因特点：突变率低、但针对性强基于同源重组的定点突变：基于同源重组技术特点：特异性高、受基因位置限制少、可在任意位点突变、但是相对耗时耗力69第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学三 蛋白质组学技术双向凝胶电泳色谱技术质谱蛋白质芯片生物信息学70第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法细胞细胞生物学生物学71