第七章蛋白质组学研究

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1、第七章蛋白质组学研究第七章蛋白质组学研究第一节概述第一节概述第二节常规双向电泳质谱路线第二节常规双向电泳质谱路线第三节蛋白质组学技术进展第三节蛋白质组学技术进展第四节亚细胞蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学第四节亚细胞蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学第一节概述第一节概述一一蛋白组学研究的历史和背景蛋白组学研究的历史和背景二蛋白组学研究的重要性二蛋白组学研究的重要性二蛋白组学研究的特点和难点二蛋白组学研究的特点和难点三蛋白组学研究的主要内容三蛋白组学研究的主要内容l基因组学（基因组学（genomicsgenomics）转录组学（）转录组学（transcriptomicstranscriptomics）l蛋

2、白质组学（蛋白质组学（proteomicsproteomics）l代谢组学（代谢组学（metabolomicsmetabolomics） 是上世纪是上世纪9090年代中期发展起来的一门对某一生物年代中期发展起来的一门对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门新学科门新学科. . l离子组学离子组学 （ionomicsionomics） 是近是近5 5年来植物营养与环境生物学研究领域的新年来植物营养与环境生物学研究领域的新方向，也是后基因组学时代研究土壤方向，也是后基因组学时代研究土壤植物相互作用植物相互作用的新思路。利用现代高通

3、量的元素分析手段，结合生物的新思路。利用现代高通量的元素分析手段，结合生物信息学和功能基因组学等手段来研究植物吸收、积累养信息学和功能基因组学等手段来研究植物吸收、积累养分和重金属污染物的机理及遗传学与分子生物学机制。分和重金属污染物的机理及遗传学与分子生物学机制。 组学时代组学时代l糖组学糖组学( (glycomicsglycomics) ) 是继基因组学和蛋白质组学后的新兴研究领域是继基因组学和蛋白质组学后的新兴研究领域, ,主要研究聚糖结构与功能。主要研究聚糖结构与功能。l脂组学（脂组学（lipidomicslipidomics) )lRNARNA组学（组学（RNomicsRNomics

4、 ）l相互作用组学（相互作用组学（interactomicsinteractomics）l生理组学（生理组学（physiomicsphysiomics）l表型组学（表型组学（phenomicsphenomics）组学时代组学时代l蛋白质组蛋白质组(proteome) (proteome) 一词，源于蛋白质一词，源于蛋白质(protein)(protein)与基与基因组因组(genome)2(genome)2个词的杂合，意思是指一种基因组或一种个词的杂合，意思是指一种基因组或一种生物、一个细胞生物、一个细胞( (组织组织) )所表达的全套蛋白质所表达的全套蛋白质l一般认为蛋白质组是指处于一定发育

5、阶段的有机体、组一般认为蛋白质组是指处于一定发育阶段的有机体、组织、细胞或亚细胞结构在一定的条件下所表达出的全部织、细胞或亚细胞结构在一定的条件下所表达出的全部蛋白质群体。研究这种群体的构成及活动规律的科学就蛋白质群体。研究这种群体的构成及活动规律的科学就是是蛋白质组学（蛋白质组学（proteomicsproteomics）。）。蛋白组学研究的历史蛋白组学研究的历史l蛋白质组是澳大利亚蛋白质组是澳大利亚MacquarieMacquarie麦考瑞麦考瑞大学的大学的WilkinsWilkins和和WilliamsWilliams等于等于19941994年在意大利的年在意大利的SienaSiena召

6、开的双向电泳会召开的双向电泳会议上首次提出的，最早见诸于文献是在议上首次提出的，最早见诸于文献是在19951995年年7 7月的月的EletrophoresisEletrophoresis杂志上，指的是基因组编码的全部杂志上，指的是基因组编码的全部蛋白质及存在方式。蛋白质及存在方式。蛋白组学研究的历史蛋白组学研究的历史悉尼悉尼麦考瑞麦考瑞大学大学 Marc WilkinsKeith Williams 通过对某一种生物的所有蛋白质全部进行通过对某一种生物的所有蛋白质全部进行质谱筛选与序列分析质谱筛选与序列分析, ,以一种不同于以一种不同于DNA DNA 快速快速测序的途径对其提供分子水平的全面分

7、析。测序的途径对其提供分子水平的全面分析。向澳政府提出一项建议向澳政府提出一项建议: :http:/www.proteome.org.au/Australia Proteome Analysis Facility ( APAF ) 1996年l相关研究可以追溯到世纪年代中期甚至相关研究可以追溯到世纪年代中期甚至更早，尤其是年代初，在基因组计划提出之更早，尤其是年代初，在基因组计划提出之前，美国科学家前，美国科学家NormsnNormsn G. Anderson G. Anderson就提出过类就提出过类似的蛋白质组计划，当时称为似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Human

8、Protein Index Index 计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质但计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质但技术搁浅技术搁浅l世纪年代初期，各种技术成熟，大背景世纪年代初期，各种技术成熟，大背景下提出了蛋白质组的概念下提出了蛋白质组的概念蛋白组学研究的历史蛋白组学研究的历史l蛋白质组学蛋白质组学（proteomics)是人类基因组计划是人类基因组计划研究发展的基础上形成的交叉学科，研究发展的基础上形成的交叉学科，是研究和是研究和探索蛋白质组的一门新兴科学，探索蛋白质组的一门新兴科学，主主要是从整体要是从整体水平研究细胞内蛋白质的组成，结构及其自身水平研究细胞内蛋白质的组成，结构及其自身特有的活

9、动规律。特有的活动规律。是功能基因组学的重要组成是功能基因组学的重要组成部分。部分。蛋白组学？蛋白组学？功能基因组时代功能基因组时代结构基因组学研结构基因组学研究取得巨大成就究取得巨大成就完成了包括人类、拟南芥完成了包括人类、拟南芥和水稻在内的多种生物的和水稻在内的多种生物的全基因组测序工作。全基因组测序工作。转录组学转录组学蛋白质组学蛋白质组学高通量的蛋白质高通量的蛋白质解析技术解析技术产生背景产生背景 国际人国际人类基因组测类基因组测序委员会对序委员会对已经完成的已经完成的人类基因组人类基因组序列给出了序列给出了更为科学的更为科学的陈述，将人陈述，将人类蛋白质编类蛋白质编码基因的估码基因的

10、估计数目由原计数目由原来的约来的约35000个缩减到了个缩减到了20500个。个。人类基因数量如此之少，甚至与微小的开人类基因数量如此之少，甚至与微小的开花植物拟南芥花植物拟南芥(2.7万万)和小蠕虫和小蠕虫(1.95万万)的的基因数量基本相同，这无疑对人类虚荣心基因数量基本相同，这无疑对人类虚荣心是一次打击。是一次打击。 第一节概述第一节概述一蛋白组学研究的历史和背景一蛋白组学研究的历史和背景二蛋白组学研究的重要性和战略地位二蛋白组学研究的重要性和战略地位二蛋白组学研究的特点和难点二蛋白组学研究的特点和难点三蛋白组学研究的主要内容三蛋白组学研究的主要内容蛋白组学研究的重要性蛋白组学研究的重要

11、性l生物功能的主要体现者或执行者是蛋白质，蛋白质的表达生物功能的主要体现者或执行者是蛋白质，蛋白质的表达水平、存在方式及相互作用等直接与生物功能相关。水平、存在方式及相互作用等直接与生物功能相关。lDNADNA芯片技术虽然能给出生物体所启动基因的相关信息，芯片技术虽然能给出生物体所启动基因的相关信息，但它并不能反映蛋白质的合成情况但它并不能反映蛋白质的合成情况，即，即mRNAmRNA的表达水平并的表达水平并不能反映蛋白质的表达水平，它们之间的相关性很差。不能反映蛋白质的表达水平，它们之间的相关性很差。l蛋白质具有自身特有的活动规律，蛋白质的修饰加工、转蛋白质具有自身特有的活动规律，蛋白质的修饰

12、加工、转运定位、相互作用等，与生物功能密切相关，对其进行了运定位、相互作用等，与生物功能密切相关，对其进行了解，只能从蛋白质水平上进行研究。解，只能从蛋白质水平上进行研究。l对于基因组、转录组及蛋白质组这三者之间的联系，对于基因组、转录组及蛋白质组这三者之间的联系，RajparekhRajparekh的解释再恰当不过，的解释再恰当不过，基因组告诉您理论上能够基因组告诉您理论上能够发生什么，发生什么， mRNAmRNA告诉您可能发生什么，而蛋白质组告诉告诉您可能发生什么，而蛋白质组告诉您正在发生什么。您正在发生什么。蛋白组学研究的重要性蛋白组学研究的重要性它它们们是是生生命命活活动动的的实实际际

13、执执行行者者l 20012001年年NatureNature、ScienceScience杂志在公布人类基因杂志在公布人类基因组序列草图的同时，分别发表了题为组序列草图的同时，分别发表了题为“And now for the And now for the proteomeproteome”、“Proteomics in genome landProteomics in genome land”的述评和的述评和展望，将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度，认为它展望，将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度，认为它是功能基因组学前沿研究的战略制高点和新世纪最大的战是功能基因组学前沿研究的战略制高点和新

14、世纪最大的战略资源。略资源。同时也标志着生命科学正式进入了后基因组时代，同时也标志着生命科学正式进入了后基因组时代，研究中心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到对其功研究中心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到对其功能的研究。能的研究。蛋白组学研究的蛋白组学研究的战略地位战略地位l 国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。技术方法，都在不断进步和完善。l 很多种生物的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互很多种生物的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也不断涌现。联网站也不断涌现。 继继19961996年

15、，澳大利亚建立蛋白质组研年，澳大利亚建立蛋白质组研究中心后丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究机究中心后丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究机构。构。l 在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。瑞士成立的加入蛋白质组的研究阵容。瑞士成立的GeneProtGeneProt公司，是由公司，是由以蛋白质组数据库以蛋白质组数据库“SWISSPROT” SWISSPROT” 著称的蛋白质组研究人员著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目

16、的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。蛋白组学研究的蛋白组学研究的战略地位战略地位l 当年提出当年提出Human Protein Index Human Protein Index 的美国科学家的美国科学家NormsnNormsn G. G. AndersonAnderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。现的梦想。l 20012001年年4 4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization,

17、HUPOHuman Proteome Organization, HUPO），随后欧洲、亚），随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（Human Human Proteome ProjectProteome Project）。）。 蛋白组学研究的蛋白组学研究的战略地位战略地位20012001年当选最年轻的院士年当选最年轻的院士作为首席科学家，领衔攻关作为首席科学家，领衔攻关973973重大研究项重大研究项目目-人类重大疾病的蛋白

18、质组学研究人类重大疾病的蛋白质组学研究“国际人类肝脏蛋白质组计（国际人类肝脏蛋白质组计（HLPPHLPP）划执行主席）划执行主席 贺福初贺福初20032003年底至年底至20072007年年来围绕人类肝脏蛋白质组的表达谱、修饰谱年年来围绕人类肝脏蛋白质组的表达谱、修饰谱及其相互作用的连锁图等九大科研任务，我国科学家已经成功测定及其相互作用的连锁图等九大科研任务，我国科学家已经成功测定出出67886788个高可信度的中国成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第一个高可信度的中国成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第一张人类器官蛋白质组张人类器官蛋白质组“蓝图蓝图”；发现了包含；发现了包含10001000余

19、个余个“蛋白质蛋蛋白质蛋白质白质”相互作用的网络图；建立了相互作用的网络图；建立了20002000余株蛋白质抗体。余株蛋白质抗体。 第一节概述第一节概述一蛋白组学研究的历史和背景一蛋白组学研究的历史和背景二蛋白组学研究的重要性二蛋白组学研究的重要性三三蛋白组学研究的主要内容蛋白组学研究的主要内容四蛋白组学研究的特点和难点四蛋白组学研究的特点和难点五相关技术路线五相关技术路线蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容l 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学，蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学，functionalfunctional proteomicsproteomics ）：蛋白质与蛋白质及其与其他

20、分子的相互）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用。作用。l 比较蛋白质组学（比较蛋白质组学（comparative proteomicscomparative proteomics），），即对即对生物体在经过遗传变异或应答激素和环境信号后蛋白质生物体在经过遗传变异或应答激素和环境信号后蛋白质表达模式变化的研究。表达模式变化的研究。l 基本蛋白质组学（基本蛋白质组学（basic proteomicsbasic proteomics），），即通过大规即通过大规模的鉴定生物体内的蛋白质，并提供蛋白质的各种结构模的鉴定生物体内的蛋白质，并提供蛋白质的各种结构信息来描述生物体的蛋白表达模式，包括蛋白

21、质的胞内信息来描述生物体的蛋白表达模式，包括蛋白质的胞内运输和亚细胞定位。运输和亚细胞定位。 MitochondriaChloroplast举举例例PingfangYang,YuLiang,ShihuaShen,TingyunKuang.2006.Proteomeanalysisofriceuppermostinternodesatthemilkystage.Proteomics,6:3330-3338举举例例ThispartwascutforproteinextractionPingfangYang,YuLiang,ShihuaShen,TingyunKuang.2006.Proteomea

22、nalysisofriceuppermostinternodesatthemilkystage.Proteomics,6:3330-3338Ping-FangYang,Xiao-JuanLi,YuLiang,Yu-XiangJing,Shi-HuaShen*andTing-YunKuang，Proteomicsanalysisoftheresponsesofliangyoupeijiuseedlingstocoldstress,Journal of integrative plant biology,2006,48(8)：873-888 PingfangYang,XiaojuanLi,Xiao

23、qinWang,YuLiang,ShihuaShen,Proteomicanalysisofriceseedsduringgermination,Proteomics,2007,7(18):3358-3368LiXiaojuan,YangMingfeng,ChenHui,QuLeqing,ChenFan,ShenShihua.Abscisicacidpretreatmentenhancessalttoleranceofriceseedlings:Proteomicevidence.BiochimBiophysActa(BBA)-ProteinsandProteomics,2010,1804(4

24、):929-940.第一节概述第一节概述一蛋白组学研究的历史和背景一蛋白组学研究的历史和背景二蛋白组学研究的重要性二蛋白组学研究的重要性三蛋白组学研究的主要内容三蛋白组学研究的主要内容四蛋白组学研究的特点和难点四蛋白组学研究的特点和难点五相关技术路线五相关技术路线（一）（一）同一性和多样性同一性和多样性（二）有限和无限（二）有限和无限（三）静态与动态（三）静态与动态（四）时间和空间（四）时间和空间蛋白组学研究的特点与难点蛋白组学研究的特点与难点修饰修饰 对于单细胞或多细胞生物来说，同一个对于单细胞或多细胞生物来说，同一个个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不个体的基因组不论是在不同的发育阶段或

25、不同种类的细胞里都是同样的。同种类的细胞里都是同样的。 然而，对于蛋白质组而言，对于不同类然而，对于蛋白质组而言，对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态下，型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态下，蛋白质组的构成是不一样的。蛋白质组的构成是不一样的。（一）（一）同一性和多样性同一性和多样性（二）有限和无限（二）有限和无限（三）静态与动态（三）静态与动态（四）时间和空间（四）时间和空间蛋白组学研究的特点与难点蛋白组学研究的特点与难点修饰修饰（一）（一）同一性和多样性同一性和多样性（二）有限和无限（二）有限和无限（三）静态与动态（三）静态与动态（四）时间和空间（四）时间和空间蛋白组学研究的特

26、点与难点蛋白组学研究的特点与难点修饰修饰（一）（一）同一性和多样性同一性和多样性（二）有限和无限（二）有限和无限（三）静态与动态（三）静态与动态（四）时间和空间（四）时间和空间蛋白组学研究的特点与难点蛋白组学研究的特点与难点修饰修饰（五（五）孤立行为和相互作用孤立行为和相互作用（六）单一手段和多种技术（六）单一手段和多种技术（七）互补和互助（七）互补和互助（八）技术层面上有好多问题还未解决（八）技术层面上有好多问题还未解决 基因组的基因表达的各种基因组的基因表达的各种mRNAmRNA是彼此孤立的，是彼此孤立的，互不干扰。互不干扰。 但是，但是，mRNAmRNA的产物的产物蛋白质正好相反，它蛋白

27、质正好相反，它们彼此间存在着广泛的相互作用。也许可以说，们彼此间存在着广泛的相互作用。也许可以说，不存在不与其他蛋白质相互作用的不存在不与其他蛋白质相互作用的“孤立蛋白质孤立蛋白质”。蛋白质功能的实现离不开蛋白质与蛋白质或。蛋白质功能的实现离不开蛋白质与蛋白质或蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用。蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用。（五（五）孤立行为和相互作用孤立行为和相互作用（六）单一手段和多种技术（六）单一手段和多种技术（七）互补和互助（七）互补和互助（八）技术层面上有好多问题还未解决（八）技术层面上有好多问题还未解决（五（五）孤立行为和相互作用孤立行为和相互作用（六）单一手段和多种技

28、术（六）单一手段和多种技术（七）互补和互助（七）互补和互助（八）技术层面上有好多问题还未解决（八）技术层面上有好多问题还未解决（五（五）孤立行为和相互作用孤立行为和相互作用（六）单一手段和多种技术（六）单一手段和多种技术（七）互补和互助（七）互补和互助（八）技术层面上有好多问题还未解决（八）技术层面上有好多问题还未解决蛋白质组学研究的对象是蛋白质，但它不同于传统的蛋白质蛋白质组学研究的对象是蛋白质，但它不同于传统的蛋白质研究手段，具有研究手段，具有大规模、高通量大规模、高通量的特点。的特点。蛋白质组的蛋白质组的特点（动态性）特点（动态性）第一节概述第一节概述一蛋白组学研究的历史和背景一蛋白组学

29、研究的历史和背景二蛋白组学研究的重要性二蛋白组学研究的重要性三蛋白组学研究的主要内容三蛋白组学研究的主要内容四蛋白组学研究的特点和难点四蛋白组学研究的特点和难点五相关技术路线五相关技术路线对蛋白质组对蛋白质组学研究的两学研究的两种策略种策略竭泽法研究生物体内尽可能多的甚至全部研究生物体内尽可能多的甚至全部蛋白质蛋白质但由于蛋白质的表达随时间的变化而变但由于蛋白质的表达随时间的变化而变化，所以这个目标很难实现化，所以这个目标很难实现功能法研究不同时期细胞内蛋白质组的变化研究不同时期细胞内蛋白质组的变化非凝胶分离技术非凝胶分离技术非凝胶分离技术非凝胶分离技术蛋白质组学研究技术路线蛋白质组学研究技术

30、路线Proteomics研究通用的技术流程图研究通用的技术流程图l双向凝胶电泳技术用于蛋白质组研究在于分离成千上双向凝胶电泳技术用于蛋白质组研究在于分离成千上万的蛋白质和差异显示蛋白质组学方面。万的蛋白质和差异显示蛋白质组学方面。l19751975年年, , 意意大大利利生生化化学学家家OFarrell OFarrell P P H H等等发发明明的的, , 大大大大提提高高了了蛋蛋白白质质分分离离的的分分辨辨率率而而得得以以广广泛泛应应用用, , 至至今已经历了整整今已经历了整整3333年的发展。年的发展。 l原理是第一向采用等电聚焦理论，根据蛋白质的等电原理是第一向采用等电聚焦理论，根据蛋

31、白质的等电点的差异进行一次分离，然后按照它们的分子量大小点的差异进行一次分离，然后按照它们的分子量大小进行进行SDS-PAGESDS-PAGE第二次分离，近年来经过多方面的改进第二次分离，近年来经过多方面的改进已成为研究蛋白质组最具实用价值的核心方法。已成为研究蛋白质组最具实用价值的核心方法。l2DE2DE面临的挑战是高分辨率和重复性，主要分为三种系面临的挑战是高分辨率和重复性，主要分为三种系统。统。双向凝胶电泳技术双向凝胶电泳技术lISO-DALT(isoelectricfocusDALT)系统，第一向应用载体两系统，第一向应用载体两性电解质，在外加电场下建立性电解质，在外加电场下建立pHp

32、H梯度，其主要缺点为梯度，其主要缺点为随聚焦时间的延长，随聚焦时间的延长， pHpH梯度不稳定，重复性较差。梯度不稳定，重复性较差。lNEPHGE(NEPHGE(non-equilibriumpH-gradientelectrophoresis )（非平衡（非平衡pHpH梯度电泳），主要用于分离碱性蛋白质，梯度电泳），主要用于分离碱性蛋白质， pI7-11.5pI7-11.5，电泳展开时间相对比较短。电泳展开时间相对比较短。lIPG-IPG-DALT(DALT(immobilizedpHgradients )，19821982年发明了年发明了固固相相pHpH梯度等电聚焦，优点为：不产生电极漂移

33、；梯度等电聚焦，优点为：不产生电极漂移； pHpH梯度稳定且可以随意精确设定，由于可以建立很窄的梯度稳定且可以随意精确设定，由于可以建立很窄的pHpH范围（如每厘米差范围（如每厘米差0.05 pH0.05 pH单位），因此特别感兴趣单位），因此特别感兴趣的区域可以在较窄的的区域可以在较窄的pHpH范围内做第二轮分析，从而大范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率；上样量大，常用于蛋白质微量制备；大提高了分辨率；上样量大，常用于蛋白质微量制备；重复性好，由于已有商品化重复性好，由于已有商品化pHpH胶条生产，使不同人、胶条生产，使不同人、不同实验室之间的结果可以相互比较，这为其最突出不同实验室之

34、间的结果可以相互比较，这为其最突出的优点。的优点。双向凝胶电泳技术双向凝胶电泳技术一一 样品的提取分离、溶解及保存样品的提取分离、溶解及保存二二 双向电泳双向电泳三三 固定、染色及脱色固定、染色及脱色四四 凝胶的干胶及扫描凝胶的干胶及扫描五五 图像分析及差异点的寻找图像分析及差异点的寻找六六 蛋白点的挖取及酶解蛋白点的挖取及酶解七七 蛋白点的质谱鉴定蛋白点的质谱鉴定第二节常规双向电泳质谱路线第二节常规双向电泳质谱路线l 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。蛋白质组分析。l 也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细也可以进行样品预分级，即

35、采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。白质组研究。l 样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。蛋白质成分。l 样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。研究。 一

36、样品的提取分离、溶解及保存一样品的提取分离、溶解及保存 （一）（一） 理想的样品制备需满足条件理想的样品制备需满足条件 （二）（二） 一般分离过程一般分离过程 （三）（三） 样品的保存样品的保存 （一）（一） 理想的样品制备需满足条件理想的样品制备需满足条件 l 在合适的盐浓度下在合适的盐浓度下, ,可重复溶解所有的蛋白质可重复溶解所有的蛋白质, ,包括疏水包括疏水性蛋白质性蛋白质, ,并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在. .l 避免溶解性低的蛋白质在等电聚焦时由于溶解度降低而避免溶解性低的蛋白质在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出沉淀析出. .l

37、 防止蛋白质的化学修饰防止蛋白质的化学修饰, ,包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰。热分解后所引起的修饰。l 排除核酸、多糖、脂类和其它干扰分子。排除核酸、多糖、脂类和其它干扰分子。l 获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要去除高丰获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。度蛋白质和不相关蛋白质。（二）（二） 一般分离一般分离l 细胞和组织的破碎细胞和组织的破碎l 样品的提取样品的提取l样品中干扰物质的去除样品中干扰物质的去除l 样品裂解液中各成分的分析样品裂解液中各成分的分析l细胞和组织的破碎细胞和组织的破碎主要方法有

38、组织匀浆法、超声波法、主要方法有组织匀浆法、超声波法、压力法、酶消化法等，细菌和培养细胞压力法、酶消化法等，细菌和培养细胞多用超声波法、压力法、冻溶法；组织多用超声波法、压力法、冻溶法；组织破碎多用匀浆法和超声波法，也可用多破碎多用匀浆法和超声波法，也可用多种方法相结合。种方法相结合。 分分离离的的一一般般过过程程样品缓冲液（样品缓冲液（samplebuffer）：）：9MUrea4%NonidetP-40(NP-40)2%ampholinepH3.5-105%2-mercaptoethanol（使用前加入）（使用前加入）将将0.25g0.25g材料剪碎至加有材料剪碎至加有1ml1ml样品缓冲

39、液的预冷的研钵中，样品缓冲液的预冷的研钵中，在冰上研磨至匀浆。材料转移到离心管中，在冰上研磨至匀浆。材料转移到离心管中，44下下15000g15000g离离心心1515分钟，去沉淀，上清液即为蛋白质抽提液，加样之前再分钟，去沉淀，上清液即为蛋白质抽提液，加样之前再次离心即可。次离心即可。 该方法的优点是操作简单、步骤少，因而减少了操作过该方法的优点是操作简单、步骤少，因而减少了操作过程中蛋白质的损失；但缺点是样品中含有核酸、糖类、色素程中蛋白质的损失；但缺点是样品中含有核酸、糖类、色素以及多酚等一些杂质从而影响电泳结果。因此，该方法只适以及多酚等一些杂质从而影响电泳结果。因此，该方法只适用于非

40、常幼嫩的植物材料、或者黄化、白化苗等。用于非常幼嫩的植物材料、或者黄化、白化苗等。 l样品的提取样品的提取 直接提取法直接提取法 l样品的提取样品的提取TCA/TCA/丙酮法丙酮法 100mg100mg材料剪碎后（加入材料剪碎后（加入10mgPVP-4010mgPVP-40，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮) ) ，用液氮研磨成粉，加入，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，三氯乙酸（丙酮配制，含含10mM10mM即即0.07%-0.07%-巯基乙醇），混匀，巯基乙醇），混匀，-20-20沉淀沉淀1 1小时，小时，44，15000 r/min1500

41、0 r/min离心离心15 min15 min，弃上清，沉淀复溶于，弃上清，沉淀复溶于1.5ml1.5ml冷丙冷丙酮酮( (含含10 10 mMmM- -巯基乙醇巯基乙醇) )，再于，再于-20-20沉淀沉淀1 1小时，同上离心小时，同上离心弃上清，所得沉淀低温冷冻真空抽干。弃上清，所得沉淀低温冷冻真空抽干。 l样品的提取样品的提取 酚抽提法酚抽提法称取称取0.25g0.25g材料，在液氮中研磨成精细的粉末，然后加入材料，在液氮中研磨成精细的粉末，然后加入1ml1ml预冷的匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆。材料转移到离心预冷的匀浆缓冲液，在冰上研磨至匀浆。材料转移到离心管中，管中，44下下1500

42、0g15000g离心离心1515分钟，弃沉淀，上清液中加入分钟，弃沉淀，上清液中加入TrisTris- -饱和酚饱和酚, ,在摇床上混合在摇床上混合. . 混合混合3030分钟分钟, ,离心离心, ,将上层酚相转移至新的离心管将上层酚相转移至新的离心管. . 用甲醇用甲醇( (含含0.1M0.1M醋酸铵醋酸铵) )沉淀沉淀(-20)(-20) 洗涤沉淀，先用甲醇洗涤沉淀，先用甲醇, ,后用丙酮后用丙酮, ,完毕后完毕后,4,4下下15000g15000g离心离心1515分钟后，将沉淀真空干燥即得到蛋白干粉，将蛋白干粉溶于分钟后，将沉淀真空干燥即得到蛋白干粉，将蛋白干粉溶于适量的样品缓冲液中即可

43、进行电泳。该方法能更好地除去杂质，适量的样品缓冲液中即可进行电泳。该方法能更好地除去杂质，但是，由于操作步骤较多，过程烦琐但是，由于操作步骤较多，过程烦琐, ,酚有很强的腐蚀性酚有很强的腐蚀性, ,并且并且容易造成蛋白的损失。容易造成蛋白的损失。l样品中干扰物质的去除样品中干扰物质的去除样品中的核酸、脂、多糖和盐等会样品中的核酸、脂、多糖和盐等会影响蛋白质的可溶性和双向电泳重复性，影响蛋白质的可溶性和双向电泳重复性，可采用超离心、透析、柱层析，或加入可采用超离心、透析、柱层析，或加入核酶等方法消除干扰物质。核酶等方法消除干扰物质。 分分离离的的一一般般过过程程样品裂解液中各成分的分析样品裂解液

44、中各成分的分析离液剂离液剂还原剂还原剂去污剂去污剂两性电解质载体两性电解质载体 分分离离的的一一般般过过程程l离液剂离液剂加入尿素、硫脲、胍等蛋白质变性剂加入尿素、硫脲、胍等蛋白质变性剂利用它们能与肽键竞争氢键，改变溶液中利用它们能与肽键竞争氢键，改变溶液中氢键的结构，将蛋白质变性以解聚疏水区，暴氢键的结构，将蛋白质变性以解聚疏水区，暴露亲水基团，提高蛋白质的溶解性。硫脲和尿露亲水基团，提高蛋白质的溶解性。硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。特别是膜蛋白的溶解性。 硫脲在水中的溶解性差，需要高浓度的尿硫脲在水中的溶解性差

45、，需要高浓度的尿素来助溶，在实际应用中，需要高溶解强度时，素来助溶，在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用一般用2M2M硫脲和硫脲和5-8M5-8M尿素联合使用。尿素联合使用。 分分离离的的一一般般过过程程l还原剂还原剂 加入还原剂打开分子内的二硫键加入还原剂打开分子内的二硫键 利利用用它它们们使使蛋蛋白白质质折折叠叠完完全全打打开开，变变性性更更加加充充分分，常常用用的的试试剂剂有有巯巯基基乙乙醇醇、二二硫硫苏苏糖糖醇醇（DTTDTT）、二硫赤藓糖醇（二硫赤藓糖醇（DETDET）等。）等。 DTTDTT应应用用比比较较广广泛泛，但但是是如如果果浓浓度度过过高高会会干干扰扰IEFIEF的的pH

46、pH梯梯度度，另另外外，其其在在碱碱性性pHpH下下会会发发生生去去质质子子化化，在在等等电电聚聚焦焦时时，向向阳阳极极发发生生迁迁移移，使使得得阴阴极极的的DTTDTT损损耗不足，导致二硫键复原，蛋白质沉淀。耗不足，导致二硫键复原，蛋白质沉淀。 后后多多用用非非离离子子型型三三正正丁丁基基磷磷（TBPTBP）代代替替DTTDTT，能能大大大大增增加加难难溶溶性性蛋蛋白白质质的的溶溶解解性性，并并提提高高蛋蛋白白质质从从第一向到第二向电泳中的转移。第一向到第二向电泳中的转移。 分分离离的的一一般般过过程程l加入去污剂加入去污剂利利用用它它们们破破坏坏蛋蛋白白质质分分子子内内疏疏水水基基团团的的

47、相相互互作作用用，从从而而使使蛋蛋白白质质更更好好地地溶溶解解在在样样品品中中，常常用用的的有有离离子子型型SDSSDS、非非离离子子型型TritonX-100TritonX-100、NP-40NP-40，两两性性离离子去污剂子去污剂CHAPSCHAPS等。等。 原原则则上上，应应该该是是非非离离子子型型或或兼兼性性离离子子型型，才才不不会影响蛋白质到达各自等电点。会影响蛋白质到达各自等电点。 近近年年来来，国国际际上上多多用用1%-2%1%-2%的的CHAPSCHAPS。但但是是它它在在高高浓浓度度的的尿尿素素中中溶溶解解度度较较低低，因因此此不不断断有有新新的的象象ASB-14ASB-14

48、等涌现出来。等涌现出来。 分分离离的的一一般般过过程程两性电解质载体两性电解质载体在去污剂存在的情况下，某些蛋白质聚焦的时在去污剂存在的情况下，某些蛋白质聚焦的时候仍旧容易沉淀在等电点上。候仍旧容易沉淀在等电点上。 加入某些盐类以增加蛋白质的溶解度，但盐类加入某些盐类以增加蛋白质的溶解度，但盐类多是聚焦不理想。多是聚焦不理想。 加入两性电解质作为载体。加入两性电解质作为载体。 能够促进蛋白质的溶解；吸附高浓度尿素在溶能够促进蛋白质的溶解；吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子；离心时还有助于核酸的沉液中形成的氰酸盐离子；离心时还有助于核酸的沉淀；阻止样品蛋白质和淀；阻止样品蛋白质和IPGIPG

49、胶条中固相化的两性电解胶条中固相化的两性电解质相互作用。质相互作用。 分分离离的的一一般般过过程程l蛋白质预分离技术的应用蛋白质预分离技术的应用v利用超离心或密度梯度离心技术分离目的细利用超离心或密度梯度离心技术分离目的细胞器的蛋白质。胞器的蛋白质。v利用层析技术富集目的蛋白质。利用层析技术富集目的蛋白质。v高丰度蛋白的预去除高丰度蛋白的预去除，以改善将来的蛋白质，以改善将来的蛋白质双向图谱。双向图谱。 分分离离的的一一般般过过程程高丰度蛋白的预去除高丰度蛋白的预去除RuBisCORuBisCO 的去除-应用PEGl蛋白质分布抽提技术的应用蛋白质分布抽提技术的应用指根据蛋白质溶解性差异，用具有

50、不同指根据蛋白质溶解性差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行顺序抽提，从而溶解能力的蛋白溶解液进行顺序抽提，从而分离出具有不同溶解度范围的蛋白质组亚群。分离出具有不同溶解度范围的蛋白质组亚群。 分分离离的的一一般般过过程程l蛋白质分布抽提技术蛋白质分布抽提技术举例举例溶液溶液A(40mmol/L A(40mmol/L TrisTris) )提取提取: : 将细胞裂解将细胞裂解, ,振荡混振荡混匀匀,10000g,10000g离心离心1010分分, ,取上清液取上清液, ,抽提出细胞中的可溶性蛋抽提出细胞中的可溶性蛋白质白质. . 溶液溶液B(8mol/LB(8mol/L尿素尿素, 4%CHA

51、PS, 25mmolDTT ), 4%CHAPS, 25mmolDTT )提取提取: : 在上一步的沉淀物中加入在上一步的沉淀物中加入B,B,振荡混匀振荡混匀,10000g,10000g离心离心1010分分, ,取上清液取上清液. . 溶液溶液C(5mol/LC(5mol/L尿素尿素,2mol/L ,2mol/L 硫脲硫脲,2%CHAPS, 2%SB3-,2%CHAPS, 2%SB3-10, 2mmol/LTBP )10, 2mmol/LTBP )提取提取: : 在上一步的沉淀物用溶液在上一步的沉淀物用溶液A A洗两洗两次次, ,加溶液加溶液C,C,振荡混匀振荡混匀,10000g,10000g

52、离心离心1010分分, ,取上清液。取上清液。 如果有必要如果有必要可以用更强烈的溶解液进行第四步提取可以用更强烈的溶解液进行第四步提取. . 对疏水性性强的蛋白质如膜蛋白和低丰度蛋白质起了对疏水性性强的蛋白质如膜蛋白和低丰度蛋白质起了富集作用富集作用. .使最终获得蛋白点数量增多使最终获得蛋白点数量增多. .（三）样品的保存（三）样品的保存干粉干粉保存保存溶解后保存溶解后保存一一 样品的提取分离、溶解及保存样品的提取分离、溶解及保存二二 双向电泳双向电泳三三 固定、染色及脱色固定、染色及脱色四四 凝胶的干胶及扫描凝胶的干胶及扫描五五 图像分析及差异点的寻找图像分析及差异点的寻找六六 蛋白点的

53、挖取及酶解蛋白点的挖取及酶解七七 蛋白点的鉴定蛋白点的鉴定第二节常规双向电泳过程第二节常规双向电泳过程二二 双向电泳双向电泳（一）等电聚焦电泳的原理（一）等电聚焦电泳的原理（二）第一向胶的制备（二）第一向胶的制备（三）上样（三）上样 ( (二二) ) 胶条的水化胶条的水化（四）平衡（四）平衡（五）第二向电泳（五）第二向电泳( (一一) ) 原理原理聚丙烯酰胺等电聚焦电泳聚丙烯酰胺等电聚焦电泳( (IsoelectricIsoelectric Focusing-PAGEFocusing-PAGE，简称简称IEF-PAGE)IEF-PAGE)：利用各种蛋白质利用各种蛋白质pIpI不同，以聚丙烯酰胺

54、凝胶为电泳支持物，并在其不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入中加入两性电解质载体两性电解质载体(carrier (carrier ampholytesampholytes) )，两两性电解质载体在电场作用下，按各自性电解质载体在电场作用下，按各自pIpI形成从阳极形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的到阴极逐渐增加的平滑和连续的pHpH梯度。在电场作梯度。在电场作用下，蛋白质在此用下，蛋白质在此pHpH梯度凝胶中泳动，当迁移至梯度凝胶中泳动，当迁移至pHpH值等于值等于pIpI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。带。l两性电解质载体两性电解质

55、载体(carrier (carrier ampholytesampholytes) )( (1)1)易易溶溶于于水水，在在pIpI处处应应有有足足够够的的缓缓冲冲能能力力，形形成成稳稳定定的的pHpH梯梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pHpH梯度。梯度。(2)(2)在在pIpI处处应应有有良良好好的的电电导导及及相相同同的的电电导导系系数数，以以保保持持均均匀匀的的电场。电场。(3)(3)分分子子量量小小，可可通通过过透透析析或或分分子子筛筛法法除除去去，便便于于与与生生物物大大分分子分开。子分开。(4)(4)化化学学性性能能稳稳定定，与与被被分分离离

56、物物不不起起化化学学反反应应，也也无无变变性性作作用用，其化学组成不同于蛋白质。其化学组成不同于蛋白质。氢氧化钠氢氧化钠磷酸磷酸( (二二) ) 胶柱的制备及上样胶柱的制备及上样（1 1）玻璃管的一端插在橡皮帽中）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2 2）配胶）配胶凝胶浓度为凝胶浓度为3.6%3.6%8M 8M 尿素尿素2% NP-402% NP-40AmpholineAmpholine pH 3.5-10 pH 3.5-10以及以及pH 5-8pH 5-8各各2.5%2.5%。 氢氧化钠氢氧化钠磷酸磷酸l 固相固相pHpH梯度技术梯度技术(IPG)(IPG)的开发是真正的一维等电聚的开发是真正的一维

57、等电聚焦技术突破焦技术突破. .l 其基本原理是：在快速形成的其基本原理是：在快速形成的pHpH梯度中根据蛋白质梯度中根据蛋白质移动能力进行蛋白质的分离移动能力进行蛋白质的分离. .将适宜的将适宜的IPGIPG试剂添加至试剂添加至含有特定结构的丙烯酰胺衍生物系列含有特定结构的丙烯酰胺衍生物系列( (它们构成了分它们构成了分布在布在pH3-pH10pH3-pH10范围不同值的缓冲体系范围不同值的缓冲体系) )的混合物中用的混合物中用于凝胶的聚合，在聚合中，缓冲基团通过乙烯键共价于凝胶的聚合，在聚合中，缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中，形成聚合至聚丙烯酰胺骨架中，形成pHpH梯度。梯度

58、。7,11,13,17,18,24cm*3mm*0.5mm胶胶条条泡泡胀胀7M尿素尿素2M硫脲硫脲2%CHAPS定容到定容到10ml并分装保存在并分装保存在-20C.用前每用前每1ml需加入需加入DTTAmpholytesBromophenolblueTrace胶胶条条泡泡胀胀上上样样7cm IPG Strip125ul*11cm IPG Strip200ul*13cm IPG Strip250 ul18cm IPG Strip350ul*电电泳泳胶条长度胶条长度7cm7cm11cm11cm13cm13cm17cm17cm18cm18cm24cm24cm上样体积上样体积125ul125ul18

59、5ul185ul250ul250ul300ul300ul350ul350ul450ul450ul银染上样量范围银染上样量范围 pH3-10L(ug)pH3-10L(ug)5-1005-10015-20015-20025-25025-25030-30-30030040-40040-40050-50-500500推荐使用量（推荐使用量（ugug） 5050100100125125150150200200250250银染银染VHrsVHrs120001200020000200002400024000300003000036000360005200052000考染上样量范围考染上样量范围 pH3-10

60、L(mg)pH3-10L(mg)0.05-0.50.05-0.50.15-1.20.15-1.20.25-0.25-1.51.50.25-0.25-2.52.50.75-30.75-31-41-4推荐使用量（推荐使用量（ugug） 2502505005006506507507501000100012501250考染考染VHrsVHrs220002200030000300003400034000400004000046000460006200062000胶条长度、上样量、上样体积、等点聚焦的伏小时数的设置及说明胶条长度、上样量、上样体积、等点聚焦的伏小时数的设置及说明Re-equilibrati

61、on Buffer:Tris HCl (1.5M stock pH 8.8 w/HCI) 50mMUrea 6MGlycerol (87% stock) 30%SDS 2%Bromophenol blue Trace (add with pipette tip)两次各平衡两次各平衡1515分钟分钟第一次平衡每第一次平衡每10mL10mL平衡液平衡液+ 100mg DTT+ 100mg DTT第二次平衡每第二次平衡每10mL10mL平衡液平衡液+ 250mg + 250mg iodacetamideiodacetamide( (四四) )平衡平衡平衡液配置平衡液配置( (四四) )平衡平衡 平平

62、衡衡缓缓冲冲液液包包括括6 6 M M 尿尿素素和和30% 30% 甘甘油油，会会减减少少电电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。 第第一一步步平平衡衡在在平平衡衡液液中中加加入入DTTDTT，使使变变性性的的非非烷烷基基化化的的蛋蛋白白处处于于还还原原状状态态；第第二二步步平平衡衡步步骤骤中中加加入入碘碘乙乙酰酰胺胺，使使蛋蛋白白质质巯巯烷烷基基化化，防防止止它它们们在在电电泳泳过过程程中中重重新新氧氧化化，碘碘乙乙酰酰胺胺并并且且能能使使残残留留的的DTT DTT 烷烷基基化化( (银银染染过过程程中中，DTT DTT 会导致点拖尾会导致点拖尾“

63、point streaking”) point streaking”) 。 将将IPG IPG 胶胶条条轻轻轻轻润润洗洗，并并去去除除多多余余的的平平衡衡缓缓冲冲液液，然后放入第二向然后放入第二向SDS SDS 胶中。胶中。( (五五) )第二向第二向SDSSDS电泳电泳准备准备0.5% 0.5% 的热的热agaroseagarose胶面朝里（高的玻璃板）胶面朝里（高的玻璃板）剥剥胶胶一一 样品的提取分离、溶解及保存样品的提取分离、溶解及保存二二 双向电泳双向电泳三三 固定、染色及脱色固定、染色及脱色四四 凝胶的干胶及扫描凝胶的干胶及扫描五五 图像分析及差异点的寻找图像分析及差异点的寻找六六

64、蛋白点的挖取及酶解蛋白点的挖取及酶解七七 蛋白点的鉴定蛋白点的鉴定第二节常规双向电泳过程第二节常规双向电泳过程l目前，电泳后呈现蛋白质斑点的有考马斯亮蓝目前，电泳后呈现蛋白质斑点的有考马斯亮蓝R250R250（CBB-R250CBB-R250）、）、考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250（CBB-CBB-G250G250）、）、氨基黑、丽春红氨基黑、丽春红S S、银染、胶态金和荧银染、胶态金和荧光染色法，也有采用免疫抗体结合染色和放射性光染色法，也有采用免疫抗体结合染色和放射性标记等方法检测蛋白质。标记等方法检测蛋白质。l其中银染灵敏度高，可达其中银染灵敏度高，可达2-52-5微克，因此广泛用微

65、克，因此广泛用于于2DE2DE分离后蛋白质点的染色，但对质谱测定有分离后蛋白质点的染色，但对质谱测定有干扰，必须先脱银，荧光染色技术新近开始应用干扰，必须先脱银，荧光染色技术新近开始应用于双向电泳图谱显示，它具有灵敏度高，使用方于双向电泳图谱显示，它具有灵敏度高，使用方便等优点，但需较高费用和专门的荧光检测仪。便等优点，但需较高费用和专门的荧光检测仪。蛋白质图谱呈现技术蛋白质图谱呈现技术1)1)考马斯亮蓝考马斯亮蓝( (CommassieCommassieblue)blue)染色染色考马斯亮蓝染料可以检测到考马斯亮蓝染料可以检测到3030100ng100ng蛋白质，极限是蛋白质，极限是8 81

66、0ng10ng。考染的优点是染色过程简单，所需配制的试剂少，操作。考染的优点是染色过程简单，所需配制的试剂少，操作简单，无毒性，染色后的背景及对比度良好，与下游蛋白质鉴简单，无毒性，染色后的背景及对比度良好，与下游蛋白质鉴定方法兼容。在样品量允许情况下，考染是一个比较好的选择。定方法兼容。在样品量允许情况下，考染是一个比较好的选择。考染的缺点是所需的时间长，染色过程大约需要考染的缺点是所需的时间长，染色过程大约需要24h24h48h48h，灵，灵敏度远低于银染和荧光染色检测。敏度远低于银染和荧光染色检测。(2)(2)银染银染银染是非放射性染色方法中灵敏度最高的，其灵敏度可达银染是非放射性染色方

67、法中灵敏度最高的，其灵敏度可达200pg200pg，成本较低，是目前差异蛋白质组分析中最常用的显色方，成本较低，是目前差异蛋白质组分析中最常用的显色方法。缺点是，银染中醛类的特异反应，使得对凝胶酶切肽谱提法。缺点是，银染中醛类的特异反应，使得对凝胶酶切肽谱提取存在困难。目前大多数实验室采用银染凝胶进行图谱分析，取存在困难。目前大多数实验室采用银染凝胶进行图谱分析，后用加大上样量的方法进行考染，进而进行切胶的下游鉴定。后用加大上样量的方法进行考染，进而进行切胶的下游鉴定。但由于银染和考染特异性不同，使得这两种方法所得二维电泳但由于银染和考染特异性不同，使得这两种方法所得二维电泳图谱可比性不好，不

68、利于蛋白质研究的高通量筛选。图谱可比性不好，不利于蛋白质研究的高通量筛选。(3)(3)负染负染考染和银染方法，其蛋白质产量都很低，使得用于考染和银染方法，其蛋白质产量都很低，使得用于随后的微量化学表征的样品量不足。负染的开发是专门随后的微量化学表征的样品量不足。负染的开发是专门为提高胶上蛋白回收率而设计的。所谓提高胶上蛋白的为提高胶上蛋白回收率而设计的。所谓提高胶上蛋白的回收率，是指在负染的情况下，显示出更多的蛋白质。回收率，是指在负染的情况下，显示出更多的蛋白质。负染的结果是在凝胶表面产生半透明背景，其中蛋白质负染的结果是在凝胶表面产生半透明背景，其中蛋白质以透明的形式被检测出来。染色过程约

69、需以透明的形式被检测出来。染色过程约需5 510min10min即可即可完成，蛋白质的生物学活性得到保持。缺点是灵敏度不完成，蛋白质的生物学活性得到保持。缺点是灵敏度不够。够。 l 高灵敏度，检出下限可达纳克高灵敏度，检出下限可达纳克l 操作简便，只需固定、染色和清洗三个简单的步骤，无须操作简便，只需固定、染色和清洗三个简单的步骤，无须 脱色，染色后凝胶可长期存放在染色液中也不会造成过染脱色，染色后凝胶可长期存放在染色液中也不会造成过染l 精确度高，可检测高度糖基化蛋白，并且不会染色样品中混精确度高，可检测高度糖基化蛋白，并且不会染色样品中混杂的核酸、脂类和碳水化合物杂的核酸、脂类和碳水化合物

70、l 与微量测序和质谱技术兼容与微量测序和质谱技术兼容l 检测信号简易，用紫外线或蓝光激发即可得到红检测信号简易，用紫外线或蓝光激发即可得到红- -橙荧光橙荧光(4)荧光染色荧光染色SYPRO蛋白质染料主要优点蛋白质染料主要优点荧光试剂对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，灵荧光试剂对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，灵敏度高，线性范围高，适合于大规模蛋白质组研究。敏度高，线性范围高，适合于大规模蛋白质组研究。(4)(4)荧光染色荧光染色 较新的应用是利用较新的应用是利用丙基丙基Cy3Cy3和甲基和甲基Cy5Cy5两种染料分别对两种两种染料分别对两种蛋白质样品进行荧光标记，并在一块蛋白质样品进行荧

71、光标记，并在一块2-DE2-DE胶上同步运行，由胶上同步运行，由于两种修饰后染料的激发波长不同，可以在一块胶上用两个于两种修饰后染料的激发波长不同，可以在一块胶上用两个波长范围进行扫描，同时得到两个图像，经相应软件匹配，波长范围进行扫描，同时得到两个图像，经相应软件匹配，可方便地找到两个样品间的差异，即完全避免了实验因素对可方便地找到两个样品间的差异，即完全避免了实验因素对重复性的影响。重复性的影响。 缺点是标记过程中的共价修饰和荧光探针淬灭作用可能缺点是标记过程中的共价修饰和荧光探针淬灭作用可能改变样品中蛋白的某些性质改变样品中蛋白的某些性质( (如移动性能、溶解性能等如移动性能、溶解性能等

72、) )，标，标记蛋白与未标记蛋白质间的轻微相对分子质量的差异，可能记蛋白与未标记蛋白质间的轻微相对分子质量的差异，可能会导致分离后蛋白质的后续分析出现偏差。会导致分离后蛋白质的后续分析出现偏差。 N2羟基琥珀酰亚胺衍生的两种不同光谱特性羟基琥珀酰亚胺衍生的两种不同光谱特性的染料的染料Cy3和和Cy5,分别去标记两种不同状样品分别去标记两种不同状样品的蛋白质赖氨酸的蛋白质赖氨酸(Lys)的的2氨基氨基(称为称为“基于基于Lys标签的标签的DIGE”技术技术)。标记一旦完成标记一旦完成,样品则可混合并在同一块胶上样品则可混合并在同一块胶上进行进行2DE分离。采集分离。采集2DE图像时图像时,在连续

73、不同在连续不同的两种激发波长下的两种激发波长下(Cy35分别在分别在540620nm发射及发射及590680nm释放能量释放能量)进行荧光扫描。进行荧光扫描。染色液配制：染色液配制：0.1% 0.1% 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 (R250 (先用甲醇充分溶解先用甲醇充分溶解) ) 50% 50% 甲醇甲醇 10% 10% 冰乙酸冰乙酸 40% 40% 蒸馏水蒸馏水 滤纸过滤滤纸过滤脱色液配制：脱色液配制：10% 10% 甲醇甲醇 10% 10% 冰乙酸冰乙酸 80% 80% 蒸馏水蒸馏水5倍体积染色倍体积染色4小时以上，小时以上，脱色摇床，中间更换几次脱色液脱色摇床，中间更换几次脱色液硝酸

74、银染色硝酸银染色银染的机制银染的机制: :来源于摄影银染技术来源于摄影银染技术, ,是将蛋白分子结合的银离是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。子还原作成金属银。优点优点: :检测灵敏度高检测灵敏度高, ,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-50-100100倍倍, ,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白可在蛋白质中找到含量较低的蛋白, ,而且所需的上样量而且所需的上样量较少。较少。缺点缺点: : 可重复性差可重复性差 耗费人力耗费人力 质谱测定有一定的干扰质谱测定有一定的干扰一一 样品的提取分离、溶解及保存样品的提取分离、溶解及保存二二 双向电泳双向电泳三三 固定、

75、染色及脱色固定、染色及脱色四四 干胶及扫描干胶及扫描五五 图像分析及差异点的寻找图像分析及差异点的寻找六六 蛋白点的挖取及酶解蛋白点的挖取及酶解七七 蛋白点的鉴定蛋白点的鉴定第二节常规双向电泳过程第二节常规双向电泳过程一一 样品的提取分离、溶解及保存样品的提取分离、溶解及保存二二 双向电泳双向电泳三三 固定、染色及脱色固定、染色及脱色四四 凝胶的干胶及扫描凝胶的干胶及扫描五五 图像分析及差异点的寻找图像分析及差异点的寻找六六 蛋白点的挖取及酶解蛋白点的挖取及酶解七七 蛋白点的鉴定蛋白点的鉴定第二节常规双向电泳过程第二节常规双向电泳过程l将染色后蛋白质的图像转化为电信号是进行蛋白质斑点的将染色后

76、蛋白质的图像转化为电信号是进行蛋白质斑点的定性和定量分析的关键步骤，可用图像扫描仪、激光扫描定性和定量分析的关键步骤，可用图像扫描仪、激光扫描仪、荧光测定仪等，把双向电泳后凝胶上的蛋白质点数字仪、荧光测定仪等，把双向电泳后凝胶上的蛋白质点数字化，并成为以象素为基础的空间和网络。化，并成为以象素为基础的空间和网络。l其次是对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较，其次是对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较，常用软件有常用软件有AmershamAmersham bioscience bioscience公司的公司的 ImageMasterImageMaster 2D 2D、 Bio-B

77、io-RadRad公司的公司的 PDquestPDquest ，另外还有另外还有 TychoTycho、 GellabGellab、 KeplerKepler、 GR42GR42、 LipsLips、 HermesHermes、 Elsie Elsie 、GeminiGemini和和 MelanieMelanie，运用软件对凝胶图谱去除纹理和背景，找出表运用软件对凝胶图谱去除纹理和背景，找出表达上有差异的蛋白质点，并对其进行分析，发现有生物学达上有差异的蛋白质点，并对其进行分析，发现有生物学意义的蛋白质。意义的蛋白质。凝胶图像分析与采集技术凝胶图像分析与采集技术l 满天星满天星”式的式的2-D

78、E2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析基础的数据处理，进行定量分析. . 在一系列高质量在一系列高质量的的2-DE2-DE凝胶产生凝胶产生( (低背景染色，高度的重复性低背景染色，高度的重复性) )的前的前提下，图象分析包括斑点检测、斑点配比等步骤提下，图象分析包括斑点检测、斑点配比等步骤PCKPACKSA+SA一一 样品的提取分离、溶解及保存样品的提取分离、溶解及

79、保存二二 双向电泳双向电泳三三 固定、染色及脱色固定、染色及脱色四四 凝胶的干胶及扫描凝胶的干胶及扫描五五 图像分析及差异点的寻找图像分析及差异点的寻找六六 蛋白点的挖取及酶解蛋白点的挖取及酶解七七 蛋白点的鉴定蛋白点的鉴定第二节常规双向电泳过程第二节常规双向电泳过程蛋白质组工作站-全自动蛋白凝胶切取系统蛋白点的挖取蛋白点的挖取手工挖点保存保存- -度冰箱可以保存一段时间度冰箱可以保存一段时间蛋白点的酶解蛋白点的酶解脱色脱色 还原还原干燥干燥烷基化烷基化清洗清洗干燥干燥酶解酶解样品的回收样品的回收注意事项注意事项l 酶的质量要求，酶的质量要求，romegaromega公司的不错公司的不错l 酶

80、液不易过多，酶解时间不易过长酶液不易过多，酶解时间不易过长l 器皿应该洁净器皿应该洁净l 所有试剂纯度要高，达到后续的质谱分析的要求所有试剂纯度要高，达到后续的质谱分析的要求l 手套、管应该质量好洁净手套、管应该质量好洁净l 操作环境，人员装备操作环境，人员装备一一 样品的提取分离、溶解及保存样品的提取分离、溶解及保存二二 双向电泳双向电泳三三 固定、染色及脱色固定、染色及脱色四四 凝胶的干胶及扫描凝胶的干胶及扫描五五 图像分析及差异点的寻找图像分析及差异点的寻找六六 蛋白点的挖取及酶解蛋白点的挖取及酶解七七 蛋白点的鉴定蛋白点的鉴定第二节常规双向电泳过程第二节常规双向电泳过程l 质谱分析质谱

81、分析l 数据库查询数据库查询七七蛋白点的鉴定蛋白点的鉴定2002年诺贝尔化学奖得主年诺贝尔化学奖得主l近年来，质谱技术在生物大分子中的广泛近年来，质谱技术在生物大分子中的广泛应用和发展，为蛋白质组的分析鉴定提供应用和发展，为蛋白质组的分析鉴定提供了快速、准确、灵敏、自动化的检测方法，了快速、准确、灵敏、自动化的检测方法，采用质谱法鉴定经采用质谱法鉴定经2DE2DE分离后的胶内蛋白质，分离后的胶内蛋白质，是目前蛋白质组研究中主要的支撑技术。是目前蛋白质组研究中主要的支撑技术。蛋白质质谱鉴定技术蛋白质质谱鉴定技术Mass spectrometer质谱的原理是：质谱的原理是：l 通过电离源将蛋白质通

82、过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定电场、磁场将具有特定质量与电荷比值质量与电荷比值( (/Z/Z值值) )的蛋白质离子分离的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定收集分离的离子，确定离子的离子的/Z/Z值，分析鉴值，分析鉴定未知蛋白质。定未知蛋白质。l质谱仪一般由离子源、质量分析器和离子检测器质谱仪一般由离子源、质量分析器和离子检测器三部分组成，如今针对多肽、蛋白质、寡糖、三部分组成，如今针对多肽、蛋白质、寡糖、DNADNA等发展了特殊电离技术以及高分辨率、高灵敏度、等发展了特

83、殊电离技术以及高分辨率、高灵敏度、大质量范围、多级串联的高档质谱仪。大质量范围、多级串联的高档质谱仪。l现用于蛋白质组研究中主要有以基质辅助激光解现用于蛋白质组研究中主要有以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS）或电喷雾或电喷雾电离质谱（电离质谱（ESI-MSESI-MS）；）；串联质谱（串联质谱（MS/MSMS/MS）。）。蛋白质质谱鉴定技术蛋白质质谱鉴定技术质谱仪的组成部分：质谱仪的组成部分：离子源、质量分析器和检测系统离子源、质量分析器和检测系统两种离子发生方法：两种离子发生方法：基质辅助激光解吸附基质辅助激光解吸附/离子

84、化（离子化（MALDI）、）、电喷雾离子化（电喷雾离子化（ESI）。）。l MALDIMALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。的测定。l TOFTOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据的原理是离

85、子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/ZM/Z）与离子的飞行时间成正比）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。，检测离子。l MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。演着越来越重要的作用。 MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MSl 电喷雾质谱技术是在毛细管的出口处施加一

86、高电压，所产生电喷雾质谱技术是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。子的形式进入气相。l 电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（质量电荷比（m/zm/z）降低到多数质量分析仪器都可以

87、检测的范围，）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。以根据质荷比及电荷数算出。ESI-MS蛋白质的鉴定和功能分类蛋白质的鉴定和功能分类第八章蛋白质组学研究第八章蛋白质组学研究第一节概述第一节概述第二节常规双向电泳质谱路线第二节常规双向电泳质谱路线第三节蛋白质组学技术进展第三节蛋白质组学技术进展第四节亚细胞蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学第四节亚细胞蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学第三节蛋白质组学技术进展第三节蛋白质组学技术进展l分离和鉴定技术分离和鉴定技术l蛋白质相互

88、作用研究技术蛋白质相互作用研究技术分离和鉴定技术分离和鉴定技术l尽管尽管2-DE在蛋白质组研究中已获得广泛的应用，但是以在蛋白质组研究中已获得广泛的应用，但是以2-DE为基础的蛋白质组方法体系还存在很多局限，新的蛋白为基础的蛋白质组方法体系还存在很多局限，新的蛋白质组技术不断涌现。质组技术不断涌现。l近年来近年来,高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳和毛细管电泳(CE)的发展的发展为蛋白质和多肽的分离分析提供了新的手段。然而一维分离为蛋白质和多肽的分离分析提供了新的手段。然而一维分离模式所能提供的分辨率等往往十分有限。模式所能提供的分辨率等往往十分有限。l多维液相分离系统是两种或两

89、种以上具有不同分离原理特多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特性的液相分离方法的优化和组合。性的液相分离方法的优化和组合。l可以采用多种不同的可以采用多种不同的HPLC模式模式尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱(SEC)、离、离子交换色谱子交换色谱(IEC)、亲和色谱、亲和色谱(AC)和反相液相色谱和反相液相色谱(RPLC)等等)和和CE模式模式(毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳、毛细管凝胶电泳(CGE)、等电聚焦等电聚焦(CIEF)和毛细管电色谱和毛细管电色谱(CEC)等等通过在线或离线的通过在线或离线的方式进行偶联方式进行偶联,从而实现对复杂样品的分离。从而实现对复

90、杂样品的分离。l常见的多维液相分离系统有二维色谱常见的多维液相分离系统有二维色谱(2DLC)、二维毛细、二维毛细管电泳管电泳(2DCE)、液相色谱一毛细管电泳、液相色谱一毛细管电泳(LCCE)等。等。l它具有以下优点它具有以下优点:灵敏度高、分析速度快灵敏度高、分析速度快;可以通过不同分可以通过不同分离模式的偶联来实现对样品中分子大小差别较大的蛋白、低含离模式的偶联来实现对样品中分子大小差别较大的蛋白、低含量的蛋白以及疏水蛋白的分析量的蛋白以及疏水蛋白的分析;可以直接和可以直接和MS联用联用;易于实现易于实现系统的自动化等。因此系统的自动化等。因此,作为和作为和2D-PAGE互补的一种分离模式

91、互补的一种分离模式,它在蛋白组学研究中已开始发挥重要的作用。它在蛋白组学研究中已开始发挥重要的作用。多维液相分离系统多维液相分离系统激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)lLCM操作由激光捕获显微切割机来完成，这种特殊设计的仪器主要操作由激光捕获显微切割机来完成，这种特殊设计的仪器主要由激光发生器和光学显微镜部分以及转移臂组成。将载有组织的切片置由激光发生器和光学显微镜部分以及转移臂组成。将载有组织的切片置于载物台上，转移臂上装有于顶端覆有转移膜的塑料盖，先在显微镜下于载物台上，转移臂上装有于顶端覆有转移膜的塑料盖，先在显微镜

92、下找到目的细胞团，将转移膜覆于其上，然后用红外激光瞬时照射目的区找到目的细胞团，将转移膜覆于其上，然后用红外激光瞬时照射目的区域使膜熔化，与组织牢固结合，当转移臂提起时，目的细胞团便留在转域使膜熔化，与组织牢固结合，当转移臂提起时，目的细胞团便留在转移膜上，这样便完成一次分离。接下来可以直接在膜上裂解细胞获取蛋移膜上，这样便完成一次分离。接下来可以直接在膜上裂解细胞获取蛋白。白。l一次一次LCM操作不影响剩余的组织切片，操作可反复进行，操作不破操作不影响剩余的组织切片，操作可反复进行，操作不破坏组织和细胞结构，短暂温和的升温也对坏组织和细胞结构，短暂温和的升温也对DNA、RNA和蛋白质等细胞和

93、蛋白质等细胞成分不造成影响。这一技术使后续实验的可重复性强，是一种高效、稳成分不造成影响。这一技术使后续实验的可重复性强，是一种高效、稳定、可靠的技术。定、可靠的技术。lLCM的设想和开发由美国国立卫生研究院的设想和开发由美国国立卫生研究院(NIH)完成，现已由多家完成，现已由多家生物技术公司实现了商品化，常见的有生物技术公司实现了商品化，常见的有Arcturus(USA)、PALMMikrolaserTechnolgie(Germany)、Leica(Germany)等公司。等公司。l利用利用LCM技术可以直接从冰冻切片、石蜡切片及细胞学涂片中获取技术可以直接从冰冻切片、石蜡切片及细胞学涂片

94、中获取感兴趣的细胞群，大大提高了后续分析的准确性和可重复性，增强了结感兴趣的细胞群，大大提高了后续分析的准确性和可重复性，增强了结果的可信度和说服力。它唯一的缺点是一次得到的细胞量较少，故需要果的可信度和说服力。它唯一的缺点是一次得到的细胞量较少，故需要花费一定时间反复操作，直至收集到足量的细胞。花费一定时间反复操作，直至收集到足量的细胞。l标准的标准的2DEMS蛋白质组分析方法无法平行地分析大量样蛋白质组分析方法无法平行地分析大量样品，需要个别地纯化样品，再用品，需要个别地纯化样品，再用MS分析。分析。l分子扫描技术能对分子扫描技术能对2DE的各蛋白质斑点同时消化，是利用分的各蛋白质斑点同时

95、消化，是利用分子扫描仪进行蛋白质鉴定的技术子扫描仪进行蛋白质鉴定的技术l2DE的各蛋白质斑点经电转移至涂有酶解液的的各蛋白质斑点经电转移至涂有酶解液的PVDF(polyvinylidenefluoride)膜，在双向凝胶转膜的同时进行酶切，膜，在双向凝胶转膜的同时进行酶切，该膜直接用特种该膜直接用特种MS扫描，得出肽质量指纹图谱。扫描，得出肽质量指纹图谱。l这些数据可以充分地诠释这些数据可以充分地诠释2DE图谱图谱。该技术在很大程度上。该技术在很大程度上实现了高通量与检测一体化，在同一实验中，完成了高通量的实现了高通量与检测一体化，在同一实验中，完成了高通量的消化、转移、鉴定与成像一系列过程，

96、较大减少了蛋白质样品消化、转移、鉴定与成像一系列过程，较大减少了蛋白质样品的丢失。的丢失。分子扫描技术分子扫描技术l此此技技术术目目前前是是蛋蛋白白质质组组研研究究技技术术中中的的核核心心技技术术之之一一。它它主主要要用于研究蛋白质组差异。用于研究蛋白质组差异。lICAT试剂由试剂由3部分组成部分组成:活活性性反反应应基基团团(碘碘乙乙酰酰胺胺)，可可与与细细胞胞蛋蛋白白质质的的半半胱胱氨氨酸酸(Cys)反反应应；连连接接子子(含含8个个氘氘或或氢氢称称为为重重或或轻轻试试剂剂)可可引引入入稳稳定定同位素；亲和标签同位素；亲和标签(生物素生物素)用来分离含用来分离含Cys的多肽的多肽l用用具具

97、有有不不同同质质量量的的同同位位素素亲亲和和标标签签(ICATs)标标记记处处于于不不同同状状态态下下的的细细胞胞中中的的半半胱胱氨氨酸酸，ICAT的的反反应应基基团团会会专专一一与与蛋蛋白白质质中中的的Cys共共价价结结合合，待待充充分分反反应应后后，将将二二者者等等量量混混合合，酶酶解解，再再通通过过生生物物素素的的亲亲和和层层析析就就可可以以将将标标记记含含Cys的的肽肽段段分分离离出出来来，利利用用串联质谱技术，对混合的样品进行质谱分析。串联质谱技术，对混合的样品进行质谱分析。同位素亲和标签技术同位素亲和标签技术（IsotopeCodedAffinityTages，ICAT）l来自两个

98、样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两来自两个样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两个峰形，能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不个峰形，能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不同同MSMS只鉴定含标记的只鉴定含标记的Cys肽段肽段,从而大大减小了样品从而大大减小了样品混合物的复杂性。混合物的复杂性。l胰酶消化后含胰酶消化后含Cys的多肽覆的多肽覆盖了绝大多数蛋白质，所以针盖了绝大多数蛋白质，所以针对对CysCys 标记提供了减小复杂性的好的靶点；标记提供了减小复杂性的好的靶点； ICAT ICAT 选择性分选择性分离含离含CysCys 肽，理论上一种独特的肽被鉴定就可知道其

99、母蛋白肽，理论上一种独特的肽被鉴定就可知道其母蛋白质，只分析含质，只分析含CysCys 肽从而简化了分析过程。肽从而简化了分析过程。同位素亲和标签技术同位素亲和标签技术（IsotopeCodedAffinityTages，ICAT）蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术l该系统由该系统由Fields Fields 和和SongSong首先在研究真核基因转录调控时建首先在研究真核基因转录调控时建立。立。l细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与，转录细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与，转录激活因子在结构上是组件式的，有激活因子在结构上是组件式的，有DNADNA结合域结合域(D

100、B(DB，DNADNAbindingbindingdomain)domain)和转录激活结构域和转录激活结构域(AD(AD， transcription-transcription-activatingactivatingdomain)domain)。lDB可识别可识别DNA上的特异序列，并使上的特异序列，并使AD定位于所调节的基定位于所调节的基因的上游，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在因的上游，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。域可重建发

101、挥转录激活作用。l分别与目标蛋白分别与目标蛋白X X 及可能与目标蛋白相互作用的蛋白及可能与目标蛋白相互作用的蛋白Y Y 相相连，并共同转入酵母细胞。连，并共同转入酵母细胞。酵母双杂交系统酵母双杂交系统l由由DBDB和和ADAD形成的融合蛋白现在一般分别称之为形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵诱饵”(bait)(bait)和和“猎物猎物”或或“靶蛋白靶蛋白”(prey(prey或或target protein)target protein)。l如果蛋白如果蛋白X X与与Y Y能够发生相互作用就能使转录因子原来分开能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活

102、下游报告基因的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因(reporter gene)(reporter gene) 。通过检测报告基因的表达产物就可判断可。通过检测报告基因的表达产物就可判断可判别作为判别作为“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”的两种蛋白是否发生相互作用。的两种蛋白是否发生相互作用。l双杂交技术只能反映蛋白质问可能发生作用，还必须结合双杂交技术只能反映蛋白质问可能发生作用，还必须结合其它试验才能确认，尤其是要与生理功能研究结合。虽然如此，其它试验才能确认，尤其是要与生理功能研究结合。虽然如此，该项技术在蛋白质问的相互作用研究、筛选新的蛋白质以及研该项技术在蛋白质问的相互作用研

103、究、筛选新的蛋白质以及研究蛋白质功能等方面仍发挥着重要的作用。究蛋白质功能等方面仍发挥着重要的作用。l将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。系统、三杂交系统和反向杂交系统等。His,-galHis,-gall噬菌体展示技术是以改造的噬菌体为载体，把待选基因片噬菌体展示技术是以改造的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外源多肽或蛋白质表达并段定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外

104、源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一展示于噬菌体表面，由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。码基因。l通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质，并实现基因克隆化的一蛋白质，并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。种重要的分子生物学技术。l与酵母双杂交技术互为补充，弥补了酵母双杂交技术的一与酵母双杂交技术互为补充，弥补了

105、酵母双杂交技术的一些限制些限制l近来的一些改进也使噬菌体展示技术的基本原理取得了突近来的一些改进也使噬菌体展示技术的基本原理取得了突破性的进展，拓宽了噬菌体展示技术的应用范围，外源基因表破性的进展，拓宽了噬菌体展示技术的应用范围，外源基因表达的载体从达的载体从M13噬菌体拓展到了噬菌体拓展到了噬菌体、酵母和细菌，所插入噬菌体、酵母和细菌，所插入的外源基因片段也从小肽基因扩展到了抗体片段基因、蛋白质的外源基因片段也从小肽基因扩展到了抗体片段基因、蛋白质基因和基因和cDNA文库等。文库等。噬茵体展示噬茵体展示(phage display)技术技术lSPRSPR的原理是利用平面单色偏振光与金属膜内表

106、面的原理是利用平面单色偏振光与金属膜内表面电子发生等离子共振时，电子发生等离子共振时，SPRSPR角角( (反射光强度最小时的入射角反射光强度最小时的入射角) )与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵诱饵”蛋蛋白作为配基，固化在几十纳米的金属膜表面白作为配基，固化在几十纳米的金属膜表面, ,加入加入“猎物猎物”蛋蛋白溶液，这样就可以通过白溶液，这样就可以通过SPRSPR角的改变来反映角的改变来反映“诱饵诱饵”蛋白与蛋白与“猎物猎物”蛋白形成的蛋白质复合物，从而反映二者的相互作蛋白形成的蛋白质复合物，从而反映二者的相互作用。用。lSPRSPR技

107、术测定分子相互作用的优越性：技术测定分子相互作用的优越性：1)1)反应物无需标记反应物无需标记甚至纯化；甚至纯化；2)2)反应过程可实时监控，测定快速且安全，还可反应过程可实时监控，测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用表面等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)Biacore 3000厂厂 家：家：GEHealthcare代理商：代理商：GEHealthcareLifeSciencesChina货 号：号：BR-1100-43Biacore 3000 生物大分子

108、相互作用分析生物大分子相互作用分析仪BIA是英语是英语BiomolecularInteractionAnalysis的缩写，的缩写，Biacore提供了实时观察生提供了实时观察生物分子间相互作用的技术。物分子间相互作用的技术。l荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、生物活体内蛋白质、脂类、DNA和和RNA的时空信息。的时空信息。荧光能量转移技术（荧光能量转移技术（FluorescenceResonanceEnergyTran

109、sfer ）l一项古老的技术一项古老的技术l 1948 1948 年年, ,F F rsterrster 创立了创立了FRET FRET 的原则的原则, ,这是一项应用能量这是一项应用能量转移来测量分子内和分子间的距离的技术转移来测量分子内和分子间的距离的技术（1-10nm1-10nm）。lFRET技术与荧光成像技术连用，可用于蛋白质结构、蛋技术与荧光成像技术连用，可用于蛋白质结构、蛋白质间的相互作用及酶研究中。将蛋白质标记上荧光探针，当白质间的相互作用及酶研究中。将蛋白质标记上荧光探针，当蛋白质不发生作用时，其相对距离较大，无蛋白质不发生作用时，其相对距离较大，无FRET现象；而蛋现象；而蛋

110、白质发生作用时，白质发生作用时，FRET发生。用发生。用LSCM或或WFM技术，从成像技术，从成像的照片中色彩的变化，可以很直观地反映出该过程的发生，这的照片中色彩的变化，可以很直观地反映出该过程的发生，这有利于在空间上研究蛋白质的作用。有利于在空间上研究蛋白质的作用。l随着绿色荧光蛋白（随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，）的发展，FRET荧光显微镜有荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法。该方法简单效率以及供体与受体间距离的简单方法。该方法简单快速，可实时定量测量快

111、速，可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离，的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于尤其适用于基于GFP的供体受体对。的供体受体对。荧光能量转移技术（荧光能量转移技术（FluorescenceResonanceEnergyTransfer ）当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠叠, ,并且两个探针在几个原子直径范围以内时并且两个探针在几个原子直径范围以内时, ,就会就会发生一种非放射性的能量转移发生一种非放射性的能量转移, ,这种现象就叫这种现象就叫FRETFRET。用青绿色的用青绿色的CFPCFP作供体、黄色的作供体、黄色的Y

112、FPYFP作受体是最适合做活细胞作受体是最适合做活细胞FRETFRET实验的，因为实验的，因为CFPCFP放射光谱部分重叠了放射光谱部分重叠了YFPYFP激发光谱。激发光谱。 当它们足够接近时，用当它们足够接近时，用CFPCFP的吸收波长激发，的吸收波长激发，CFPCFP的发色基团的发色基团将会把能量高效率地共振转移至将会把能量高效率地共振转移至YFPYFP的发色基团上，所以的发色基团上，所以CFPCFP的的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFPYFP的荧光。两个发色基的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的团之间的能量转换效率与它们之间

113、的空间距离的6 6次方成反比，次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质例如要研究两种蛋白质a a和和b b间的相互作用，可以根间的相互作用，可以根据据FRETFRET原理构建一融合蛋白。原理构建一融合蛋白。l 这种融合蛋白由三部分组成：这种融合蛋白由三部分组成：CFPCFP、蛋白质、蛋白质b b、 YFPYFP。l 用用CFPCFP吸收波长吸收波长433nm433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质蛋白质a a与与b b没有发生相互作用时，没有发生相互作用时，CFPCFP与与YFPYFP相距很远不能发相距很远不能

114、发生荧光共振能量转移，因而检测到的是生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFPCFP的发射波长为的发射波长为476nm476nm的荧光；但当蛋白质的荧光；但当蛋白质a a与与b b发生相互作用时，由于蛋白发生相互作用时，由于蛋白质质b b受蛋白质受蛋白质a a作用而发生构象变化，使作用而发生构象变化，使CFPCFP与与YFPYFP充分靠近发充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFPYFP的发射波长为的发射波长为527nm527nm的荧光。的荧光。 l Reiko Reiko OnukiOnuki等人利用等人利用FRETFRET技术研究了技术研究了Ca

115、spase8Caspase8与与BidBid蛋白之间的相互作用，蛋白之间的相互作用，Caspase8Caspase8活化后作用活化后作用BidBid蛋蛋白，使其裂解成两个片段，然后羧基片段转移到线粒白，使其裂解成两个片段，然后羧基片段转移到线粒体使其释放细胞色素体使其释放细胞色素C C诱发细胞凋亡。诱发细胞凋亡。l 研究者将研究者将BidBid蛋白两端分别与蛋白两端分别与CFPCFP与与YFPYFP融合，精心融合，精心设计使其在没有被裂解前刚好可以发生设计使其在没有被裂解前刚好可以发生FRETFRET，当，当BidBid蛋白被裂解后蛋白被裂解后FRETFRET效应自然消失。所以是一种很好的效应

116、自然消失。所以是一种很好的检测检测Caspase8Caspase8酶活性方法。酶活性方法。l 而且当而且当BidBid蛋白与蛋白与CFPCFP与与YFPYFP融合之后仍能行使正常融合之后仍能行使正常的功能，当融合物在细胞内被裂解后，连接的功能，当融合物在细胞内被裂解后，连接CFPCFP的片的片段转移到线粒体，通过段转移到线粒体，通过CFPCFP荧光可以很清楚的观测到荧光可以很清楚的观测到其在细胞内的定位。其在细胞内的定位。 双色荧光互补实验双色荧光互补实验（bimolecular fluorescence complementationbimolecular fluorescence comp

117、lementation，BiFcBiFc）l 是由是由 HuHu 等在等在 2002 2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术. . l 该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用相互作用. .l 其后发展出的其后发展出的多色荧光互补技术多色荧光互补技术 (multicolor (multicolor

118、BiFCBiFC) )，不仅，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较间产生相互作用的强弱进行比较. . l 目前，该技术已用于转录因子，目前，该技术已用于转录因子，G G 蛋白蛋白 亚基的二聚体亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上化等方面的研究工作上. .l BiFcBiFc原理原理 GFPGFP家族（家族（GFPGFP，CFPCFP，YFPYFP，BFPBFP）有一重要性质）有一重要性质循

119、环排循环排列。列。GFPGFP、YFPYFP、CFPCFP和和 BFPBFP都是由都是由 238 238 个氨基酸组成的单体个氨基酸组成的单体蛋白质蛋白质, , 荧光的产生主要归功于分子内第荧光的产生主要归功于分子内第 6565、6666、67 67 位丝位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸自环化形成生色团的功效。氨酸、酪氨酸、甘氨酸自环化形成生色团的功效。 晶体结构显示晶体结构显示, ,蛋白质中央是一个圆桶形结构，由蛋白质中央是一个圆桶形结构，由 11 11 个围个围绕中心绕中心螺旋的反平行螺旋的反平行折叠组成折叠组成. . 荧光基团的形成就是从荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由这个螺旋开始

120、的，桶的顶部由3 3 个短的垂直片段覆盖，底部个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内于大空腔内. . 研究发现单独表达的研究发现单独表达的GFPGFP的两个的两个片层在之间的距离靠近片层在之间的距离靠近时，展现出与时，展现出与GFPGFP完整蛋白同样的荧光活性，这也就是完整蛋白同样的荧光活性，这也就是BiFcBiFc的基本原理：将两个的基本原理：将两个GFPGFP的的betabeta层分别与待检测的蛋白融合，层分别与待检测的蛋白融合，如果两个蛋白结合，这两个如果两个蛋白结合，这两个GFPGFP片

121、段会接近而在激发光下发片段会接近而在激发光下发出荧光。出荧光。 这里要指出的一点是，这里要指出的一点是，GFPGFP、YFPYFP、CFPCFP之间区别的氨基酸之间区别的氨基酸位点都位于第一片层上，因而可以将不同的片层一与不同蛋位点都位于第一片层上，因而可以将不同的片层一与不同蛋白融合，而目标蛋白与片层二融合，这样可以检测目标蛋白白融合，而目标蛋白与片层二融合，这样可以检测目标蛋白在不同时间，不同条件下与不同蛋白的结合情况。在不同时间，不同条件下与不同蛋白的结合情况。l主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术l其基本原理是，在细胞裂解液中加入

122、感兴趣蛋白的抗体，孵其基本原理是，在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的育后再加入与抗体特异结合的,结合于结合于Pansobin珠上的金黄色葡珠上的金黄色葡萄球菌蛋白萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白目的蛋白兴趣蛋白兴趣蛋白抗兴趣抗兴趣蛋白抗体蛋白抗体SPA|Pansobin”，因为，因为SPA|Pansobin比较大，这样比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，

123、复合物四组分又被分开。然后经复合物四组分又被分开。然后经Westernblotting法，用抗体检法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。l这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测

124、目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。不到结果，方法本身具有冒险性。免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术 lPull-downPull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素白（生物素- -、PolyHisPolyHis- -或或GST-GST-），从细胞裂解液中钓出与），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。之相互作用的蛋白。l通过通过Pull-downPull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋

125、白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。体系中检测出蛋白相互作用关系。pull-down技术技术谷胱苷肽谷胱苷肽-S-S-转移酶沉淀试验转移酶沉淀试验(GST-pull down(GST-pull down）原理）原理GSTXY谷胱甘谷胱甘肽肽-琼脂糖球珠琼脂糖球珠细胞裂解物细胞裂解物 tube4下孵育下孵育2h2h GST融合蛋白融合蛋白GSTXY+l蛋白质芯片技术术是继基因芯片蛋白质芯片技术术是继基因芯片(Gene Chip)(Gene Chip)技术之后的技术之后的新一代生物芯片技术。是一种高通

126、量、微型化和自动化的蛋白新一代生物芯片技术。是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术，它不需要进行蛋白质分离，只是利用抗体或其它质分析技术，它不需要进行蛋白质分离，只是利用抗体或其它类型亲和探针构成的芯片进行检测，可以同时检测几千种蛋白类型亲和探针构成的芯片进行检测，可以同时检测几千种蛋白质，效率非常高。质，效率非常高。l是指以蛋白质分子作为配基，将其固定在固相载体的表面是指以蛋白质分子作为配基，将其固定在固相载体的表面, ,形成的蛋白质微阵列形成的蛋白质微阵列(Protein (Protein microarraymicroarray) ) 。一个蛋白质芯。一个蛋白质芯片可以容纳一个蛋白

127、质家族所有成员或一种蛋白质的所有变异片可以容纳一个蛋白质家族所有成员或一种蛋白质的所有变异体。根据检测目的不同，作为配基蛋白质分子可以是酶、受体、体。根据检测目的不同，作为配基蛋白质分子可以是酶、受体、抗原、抗体或抗体片断等。抗原、抗体或抗体片断等。l蛋白质芯片技术主要包括蛋白质微阵列的构建、样品的制蛋白质芯片技术主要包括蛋白质微阵列的构建、样品的制备、芯片生化反应、信号检测及分析。备、芯片生化反应、信号检测及分析。蛋白质芯片蛋白质芯片(Protein Chip)(Protein Chip)l实验时，将带有特殊标记的蛋白质分子与芯片反应，探实验时，将带有特殊标记的蛋白质分子与芯片反应，探针捕获

128、样品中的待测蛋白质并与之结合，然后通过检测器对标针捕获样品中的待测蛋白质并与之结合，然后通过检测器对标记物进行检测，计算机分析出待测样品的结果。目前记物进行检测，计算机分析出待测样品的结果。目前,对吸附到对吸附到芯片表面的靶蛋白的检测主要有两种方式：蛋白质标记法和直芯片表面的靶蛋白的检测主要有两种方式：蛋白质标记法和直接检测法。接检测法。l前者将样品中的蛋白质预先用荧光物质或同位素等标记前者将样品中的蛋白质预先用荧光物质或同位素等标记,结结合到芯片上的蛋白质就会发出特定的信号，用合到芯片上的蛋白质就会发出特定的信号，用CD(Charge-coupleddevice)照相技术及激光扫描系统等对信

129、号进行检测照相技术及激光扫描系统等对信号进行检测l后者以质谱技术为基础后者以质谱技术为基础,采用表面增强激光解吸离子化采用表面增强激光解吸离子化-飞飞行时间行时间-质谱质谱(SELDI-TOF-MS)技术，使靶蛋白离子化技术，使靶蛋白离子化,以分以分析蛋白质的分子量和相对含量。析蛋白质的分子量和相对含量。l点样制备蛋白分子微阵列点样制备蛋白分子微阵列l载体表面蛋白的固定载体表面蛋白的固定l蛋白芯片与样品反应。探针蛋白芯片与样品反应。探针可以与相应的目的分子特异性可以与相应的目的分子特异性的结合，带有荧光的报告分子的结合，带有荧光的报告分子与目的分子特异性的结合。与目的分子特异性的结合。l反应结

130、果的检测反应结果的检测蛋白芯片的制备及使用步骤蛋白芯片的制备及使用步骤 l蛋白质芯片与质谱联合应用于蛋白质组研究领域，具有高蛋白质芯片与质谱联合应用于蛋白质组研究领域，具有高通量、微型化、集成化、平行性检测等特点，逐渐应用于疾病通量、微型化、集成化、平行性检测等特点，逐渐应用于疾病检测、新药筛选等诸多领域，尤其成为肿瘤检测、分级、疗效检测、新药筛选等诸多领域，尤其成为肿瘤检测、分级、疗效及预后判定、寻找药物治疗特异性靶目标的关键技术。及预后判定、寻找药物治疗特异性靶目标的关键技术。l与与DNA芯片比较，蛋白质芯片存在许多不足，还应该在以芯片比较，蛋白质芯片存在许多不足，还应该在以下几方面进行研

131、究：增加芯片蛋白质的种类和数量；加速探针下几方面进行研究：增加芯片蛋白质的种类和数量；加速探针蛋白质的制备和纯化研究；寻找更好的探针固定技术；研究新蛋白质的制备和纯化研究；寻找更好的探针固定技术；研究新的检测仪器和方法，提高检测灵敏度；开发高度集成化生产的的检测仪器和方法，提高检测灵敏度；开发高度集成化生产的制备系统，便于推广应用。制备系统，便于推广应用。l近年来近年来, , 美国美国CiphergenCiphergen公司发明了公司发明了SELDI (surface SELDI (surface enhanced laser enhanced laser desorptiondesorpti

132、on/ionization)/ionization)蛋白芯片技术蛋白芯片技术, , 它将它将蛋白质分离与质谱分析集于一体蛋白质分离与质谱分析集于一体, , 实现了一步分离与鉴定。实现了一步分离与鉴定。lSELDISELDI芯片技术是利用系统设计的具有不同化学表面修饰的芯片技术是利用系统设计的具有不同化学表面修饰的芯片芯片, , 使之能选择性地富集一组蛋白质使之能选择性地富集一组蛋白质, , 在添加能量吸收分子以在添加能量吸收分子以后后, , 送入阅读机送入阅读机, , 以以MALDI MALDI 飞行时间质谱检测和测定被富集到飞行时间质谱检测和测定被富集到8 8 -24-24个样品点上的所有蛋

133、白质。蛋白质芯片系统通过测定蛋白质个样品点上的所有蛋白质。蛋白质芯片系统通过测定蛋白质分子的飞行时间分子的飞行时间, , 检测并且迅速计算出蛋白质的分子量。检测并且迅速计算出蛋白质的分子量。l该系统可以识别小于该系统可以识别小于1 1 kDakDa的多肽的多肽, , 直至直至500 500 kDakDa以上的蛋白以上的蛋白质。对一个样本的分析在几十分钟就可以完成质。对一个样本的分析在几十分钟就可以完成, , 处理的信息量远处理的信息量远远大于二维电泳。对于低丰度蛋白远大于二维电泳。对于低丰度蛋白, , 只要与表面探针结合只要与表面探针结合, , 就可就可以检测到。以检测到。 表面增强激光解吸附

134、离子化飞行时间质谱表面增强激光解吸附离子化飞行时间质谱(surface-enhancedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry,SELDI-TOFMS)lSELDISELDI蛋白质芯片系统能提供大量的不同化学吸附表面蛋白质芯片系统能提供大量的不同化学吸附表面, , 可以从复杂的蛋白质混合物中特异获取某类蛋白质可以从复杂的蛋白质混合物中特异获取某类蛋白质, , 而且在而且在一定程度上可以调节蛋白质的数量范围。一定程度上可以调节蛋白质的数量范围。l化学表面包括一系列的经典化学层析和专门的亲和吸附化学表面包括一系列的经典化学层析

135、和专门的亲和吸附表面。经典化学层析包括正相的多数蛋白结合表面表面。经典化学层析包括正相的多数蛋白结合表面; ; 反相吸反相吸附的疏水表面附的疏水表面; ; 正负离子交换表面正负离子交换表面; ; 吸附结合金属蛋白的结吸附结合金属蛋白的结合金属亲和吸附表面合金属亲和吸附表面(IMAC)(IMAC)等。专门的蛋白质也能被结合在等。专门的蛋白质也能被结合在预先活化的芯片表面预先活化的芯片表面, , 使得研究可以进行抗原使得研究可以进行抗原- -抗体、抗体、DNA-DNA-蛋白质和受体结合的研究。蛋白质和受体结合的研究。 表面增强激光解吸附离子化飞行时间质谱表面增强激光解吸附离子化飞行时间质谱(sur

136、face-enhancedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry,SELDI-TOFMS)lRigaut等首次采用串联亲和纯化技术研究了蛋白间的相互等首次采用串联亲和纯化技术研究了蛋白间的相互作用，串联亲和纯化是在目的蛋白的作用，串联亲和纯化是在目的蛋白的C端或端或N端增加一个标端增加一个标签，也就是构建一个融合蛋白，这个蛋白在细胞中表达以后，签，也就是构建一个融合蛋白，这个蛋白在细胞中表达以后，提取细胞的蛋白溶液，经过两次过柱和洗脱以后，就得到一个提取细胞的蛋白溶液，经过两次过柱和洗脱以后，就得到一个结合着与目的蛋白相互

137、作用蛋白的蛋白复合体。再用结合着与目的蛋白相互作用蛋白的蛋白复合体。再用SDSPAGE胶将这些蛋白分离开，通过质谱进行鉴定，与其他融合胶将这些蛋白分离开，通过质谱进行鉴定，与其他融合标签方法的最大不同是该方法选用了两个连续的标签而不是通标签方法的最大不同是该方法选用了两个连续的标签而不是通常意义上的一个。常意义上的一个。l标签共分三部分：蛋白标签共分三部分：蛋白A、CBP(calmodulinbindingpeptide，钙调素结合多肽，钙调素结合多肽)和中间连接的和中间连接的TEV酶识别的酶切位酶识别的酶切位点。点。串联亲和纯化串联亲和纯化 (tandemaffinitypurificati

138、on，TAP)l带有带有TAP标签的融合蛋白在细胞中表达与内源相互作用蛋白标签的融合蛋白在细胞中表达与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经形成复合物，细胞裂解后经IgG偶联的层析柱纯化，蛋白偶联的层析柱纯化，蛋白A与与IgG特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为了特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为了除去与柱填料非特异结合的蛋白，用除去与柱填料非特异结合的蛋白，用TEV酶切割分离蛋白酶切割分离蛋白A标签，标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化，靶蛋白上的析柱进行第二次

139、纯化，靶蛋白上的CBP标签可与钙调素结合；在标签可与钙调素结合；在加入过量螯合剂加入过量螯合剂EGTA后后CBP与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化，复合体得到分离纯化，l该方法的优点：该方法的优点：(1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体；靶蛋白的复合体；(2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；(3)TAP采用两步亲和采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性。纯化，提高了纯化产物的特异性

140、。串联亲和纯化串联亲和纯化 (tandemaffinitypurification，TAP)第八章蛋白质组学研究第八章蛋白质组学研究第一节概述第一节概述第二节常规双向电泳质谱路线第二节常规双向电泳质谱路线第三节蛋白质组学技术进展第三节蛋白质组学技术进展第四节亚细胞蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学第四节亚细胞蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学磷酸化蛋白质组学磷酸化蛋白质组学phosphoproteomicsl蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见的一种蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见的一种共价修饰方式，在许多生物效应中起着开关的作用，共价修饰方式，在许多生物效应中起着开关的作用，是基因表达和蛋白质合

141、成的重要调控者，几乎参与生是基因表达和蛋白质合成的重要调控者，几乎参与生命活动的所有过程。命活动的所有过程。l在哺乳动物细胞中，有在哺乳动物细胞中，有1/31/3以上的蛋白质发生磷酸以上的蛋白质发生磷酸化修饰，脊椎动物基因组中，有化修饰，脊椎动物基因组中，有5%5%的基因编码蛋白激的基因编码蛋白激酶和磷酸酯酶。在人体内控制蛋白质磷酸化作用的蛋酶和磷酸酯酶。在人体内控制蛋白质磷酸化作用的蛋白激酶和磷酸酶将近白激酶和磷酸酶将近1 0001 000种。种。l 真核细胞的蛋白质磷酸化位点主要发生在丝氨酸、真核细胞的蛋白质磷酸化位点主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链的羟基上，但是蛋白质发生苏氨酸和

142、酪氨酸残基侧链的羟基上，但是蛋白质发生磷酸化在结构序列上没有统一的的模序。磷酸化在结构序列上没有统一的的模序。l生物体内能被磷酸化修饰的蛋白质组成磷酸化蛋白生物体内能被磷酸化修饰的蛋白质组成磷酸化蛋白质组。质组。l 磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术之一。白质组学研究的关键技术之一。l检测蛋白质的磷酸化需要在两个层面上进行分析。检测蛋白质的磷酸化需要在两个层面上进行分析。首先是鉴定该蛋白质是磷酸化蛋白首先是鉴定该蛋白质是磷酸化蛋白然后确认其磷酸化位点和数目然后确认其磷酸化位点和数目l 细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化，即使蛋

143、白质细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化，即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平，该蛋白质的磷酸化部的表达量处于相对较高的水平，该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难，一般一个发生磷酸化的蛋白质其分的分析也很困难，一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量的磷酸化的部分仅占其总量的1010。磷酸化蛋白质检测方法磷酸化蛋白质检测方法1.32P放射性标记放射性标记l最经典的磷酸化蛋白质检测方法最经典的磷酸化蛋白质检测方法l体内代谢培养用体内代谢培养用32P标记磷酸盐作为磷酸基团供体，标记磷酸盐作为磷酸基团供体，被被32 P标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离，用放标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分

144、离，用放射自显影等方法检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物射自显影等方法检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物用用二维磷酸肽作图法二维磷酸肽作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水解肽段经酸类型。磷蛋白水解肽段经HPLC分离，通过监测放射分离，通过监测放射性活度收集到磷酸肽，用性活度收集到磷酸肽，用Edman测序或串联质谱分析都测序或串联质谱分析都可以确定磷酸化位点。可以确定磷酸化位点。l需要有足够量的磷蛋白用于分析。需要有足够量的磷蛋白用于分析。二维二维磷酸多肽谱图磷酸多肽谱图(2DPP)(2DPP)l在在2DPP图谱中，多肽在薄层纤维板上进行电泳图谱中，

145、多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一块板上进行薄层色谱是第一相，在同一块板上进行薄层色谱(TCL)为第二为第二相。分离得到的磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测。相。分离得到的磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测。l此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷酸此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷酸化状态的重要信息，包括：化状态的重要信息，包括：(1)磷酸化位点的最大数磷酸化位点的最大数目；目；(2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸化的相对化学计量；酸化的相对化学计量；(3)电泳和电泳和TCL的正交分离提的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性的相对状态。供

146、了磷酸肽之间亲水性的相对状态。l2DPP图谱产生的提纯的磷酸化肽，提取后可直图谱产生的提纯的磷酸化肽，提取后可直接用于接用于MS分析。分析。2.免疫印记和免疫沉淀免疫印记和免疫沉淀l将蛋白质电泳分离后通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸将蛋白质电泳分离后通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反应化蛋白质的免疫印迹反应(Westernblotting)来检出磷来检出磷酸化蛋白质是较常用的方法。酸化蛋白质是较常用的方法。l在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化。磷酸化。l已经有商品化

147、的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体，其中抗体，其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，也最，也最为常用。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小，为常用。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小，抗原抗体结合位点有空间障碍，所以抗体的结合力较抗原抗体结合位点有空间障碍，所以抗体的结合力较差。差。nKim等研究了辐射诱导纤维肉瘤细胞系及其耐热等研究了辐射诱导纤维肉瘤细胞系及其耐热衍生物在热休克刺激下的酪氨酸磷酸化蛋白质表达衍生物在热休克刺激下的酪氨酸磷酸化蛋白质表达谱的变化，发现有谱的变化，发现有93个蛋白质的磷酸化程度随热休个蛋白

148、质的磷酸化程度随热休克恢复时间发生显著变化，鉴定出的克恢复时间发生显著变化，鉴定出的81个蛋白质具个蛋白质具有广泛的细胞功能，作者认为这提示热休克应答可有广泛的细胞功能，作者认为这提示热休克应答可以通过多种蛋白质的磷酸化而被调节。以通过多种蛋白质的磷酸化而被调节。举例举例nOtto等利用等利用2DBACSDSPAGE、抗酪氨酸磷酸、抗酪氨酸磷酸化特异抗体进行免疫印迹、胶内酶解以及质谱分析技化特异抗体进行免疫印迹、胶内酶解以及质谱分析技术鉴定得到了术鉴定得到了8种与核膜相关的酪氨酸磷酸化蛋白。种与核膜相关的酪氨酸磷酸化蛋白。n由于磷酸化蛋白质含量很低，如果用免疫沉淀对磷由于磷酸化蛋白质含量很低，

149、如果用免疫沉淀对磷酸化蛋白质先进行富集，这样可以降低非磷酸化蛋白酸化蛋白质先进行富集，这样可以降低非磷酸化蛋白质的干扰，提高检测的准确性。质的干扰，提高检测的准确性。举例举例l ProQ Diamond ProQ Diamond 是是 Molecular ProbesMolecular Probes公司近年新推公司近年新推出的一种磷酸化蛋白质的荧光染料。出的一种磷酸化蛋白质的荧光染料。l 通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二维凝胶通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质，对非磷酸化蛋白质的反应电泳胶上分离的磷酸化蛋白质，对非磷酸化蛋白质的反应性很低，荧光强度

150、会随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现性很低，荧光强度会随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现出量的变化。出量的变化。l 该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染料配合使用，该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染料配合使用，同时展示出胶上的总蛋白谱和磷酸化蛋白谱，染料与质谱同时展示出胶上的总蛋白谱和磷酸化蛋白谱，染料与质谱兼容，胶上的蛋白质点可以通过胶上酶切进行质谱鉴定。兼容，胶上的蛋白质点可以通过胶上酶切进行质谱鉴定。l 对于磷酸化程度不同的磷蛋白检测的灵敏度是不同的，对于磷酸化程度不同的磷蛋白检测的灵敏度是不同的，对于有对于有5 5个磷酸化位点的个磷酸化位点的 酪蛋白可以检测到酪蛋白可以检测到1-2 1-2

151、ngng的量，的量，有一个磷酸化位点的胃蛋白酶可以检测到有一个磷酸化位点的胃蛋白酶可以检测到8 8 ngng的量。的量。3. 3. 磷酸化蛋白质的荧光检测磷酸化蛋白质的荧光检测（1 1）以）以MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS为基础的方法为基础的方法l 磷酸酶法磷酸酶法 磷酸化蛋白质酶解肽段用磷酸酶水解，失去一个磷酸化蛋白质酶解肽段用磷酸酶水解，失去一个HPO3 HPO3 分子，相应肽段质量减少分子，相应肽段质量减少80 80 DaDa，分析磷酸酶作用，分析磷酸酶作用前后肽谱的差异，可确定磷酸化肽段及磷酸化位点的数前后肽谱的差异，可确定磷酸化肽段及磷酸化位点的数目，酶解还可以直接

152、在目，酶解还可以直接在MALDIMSMALDIMS的样品靶上进行。的样品靶上进行。质谱技术识别磷酸肽及磷酸化位点确定质谱技术识别磷酸肽及磷酸化位点确定（ 2）以串联质谱以串联质谱(tandem mass spectrometry(tandem mass spectrometry，MSMSMS) MS) 为基础的方法为基础的方法l通过串联质谱仪的多种检测方式，分析含磷酸基通过串联质谱仪的多种检测方式，分析含磷酸基团的肽段产生的特征离子，可直接从肽混合物中寻团的肽段产生的特征离子，可直接从肽混合物中寻找到磷酸肽。磷酸肽经碰撞诱导解离找到磷酸肽。磷酸肽经碰撞诱导解离(collisioninduced

153、dissociation，CID)后会产生磷酸基团的特异后会产生磷酸基团的特异性片段，丢失性片段，丢失80Da(HPO3)和和98Da(H2PO4)的子离子，的子离子，检测所产生的全部碎片离子，根据碎片离子质量数检测所产生的全部碎片离子，根据碎片离子质量数来推断肽段序列和磷酸化位点。来推断肽段序列和磷酸化位点。l该法优点是高效液相色谱或毛细管电泳可直接与该法优点是高效液相色谱或毛细管电泳可直接与电喷雾串联质谱（电喷雾串联质谱（ESIMSMS)连接，这样可以连接，这样可以降低样品的复杂性和简化肽降低样品的复杂性和简化肽t昆合物的质谱峰。昆合物的质谱峰。l用稳定同位素，如用稳定同位素，如15N标记

154、一种细胞蛋白质，与另外不同处理标记一种细胞蛋白质，与另外不同处理的细胞蛋白质的细胞蛋白质(14N标记标记)混合，提取细胞蛋白，分离磷酸化蛋白质，混合，提取细胞蛋白，分离磷酸化蛋白质，酶解、提取肽段，用质谱分析。通过比较酶解、提取肽段，用质谱分析。通过比较“15N和和14N”的峰值可以的峰值可以确定相应的磷酸化肽的含量。确定相应的磷酸化肽的含量。l谱峰谱峰15N14N同位素丰度比可以体现出两种来源蛋白质表达同位素丰度比可以体现出两种来源蛋白质表达量的相对水平，如果蛋白质表达完全一致，则所有肽段量的相对水平，如果蛋白质表达完全一致，则所有肽段15N14N丰度比将在一个平均值范围以内。而如果两种来源

155、蛋白质的丰度比将在一个平均值范围以内。而如果两种来源蛋白质的磷酸化程度不同，其含磷肽段与相应未磷酸化肽段的磷酸化程度不同，其含磷肽段与相应未磷酸化肽段的15N14N丰丰度比就会与平均值不同，根据其比值来进行磷酸化程度的相对定度比就会与平均值不同，根据其比值来进行磷酸化程度的相对定量。量。l这一方法需要在标记培养基中培养细胞，有可能培养基的差异这一方法需要在标记培养基中培养细胞，有可能培养基的差异本身就造成蛋白质表达量的变化，而且目标蛋白质需要纯化、分本身就造成蛋白质表达量的变化，而且目标蛋白质需要纯化、分离，所以还不能用于大规模的蛋白质定量分析。离，所以还不能用于大规模的蛋白质定量分析。磷酸化

156、蛋白质的定量分析方法磷酸化蛋白质的定量分析方法1稳定同位素标记法稳定同位素标记法l使磷酸肽或磷蛋白发生使磷酸肽或磷蛋白发生-消除，同时用亲核试剂攻消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应，对两种不同细胞来源击形成的双键并发生加成反应，对两种不同细胞来源的磷酸肽或磷蛋白使用不同的亲核试剂。的磷酸肽或磷蛋白使用不同的亲核试剂。l区别在于，其中一种试剂上的氢原子由氘代替，再区别在于，其中一种试剂上的氢原子由氘代替，再在亲核试剂上连接一个亲和纯化标签，如生物素在亲核试剂上连接一个亲和纯化标签，如生物素(biotin)。l将两种细胞来源的磷酸肽或磷蛋白混合，利用亲和将两种细胞来源的磷酸肽或磷蛋白

157、混合，利用亲和素对生物素的高亲和力作用对目标蛋白质进行富集，素对生物素的高亲和力作用对目标蛋白质进行富集，酶解后进行质谱分析。酶解后进行质谱分析。l由于掺人了不同的亲核试剂，在质谱图中，磷酸肽由于掺人了不同的亲核试剂，在质谱图中，磷酸肽表现为一对峰，根据二者丰度比进行两种细胞来源蛋表现为一对峰，根据二者丰度比进行两种细胞来源蛋白质的相对定量。白质的相对定量。2.磷酸肽同位素亲和标签法磷酸肽同位素亲和标签法(phosphoproteinisotope-codedafinitytag，PhIAT)l对两个样本分别采用不同的甲酯化试剂对两个样本分别采用不同的甲酯化试剂(甲醇和氘甲醇和氘代醇代醇)，用

158、亲和色谱将磷酸肽富集后进行，用亲和色谱将磷酸肽富集后进行LcMS分析，分析，通过分析成对磷酸肽的丰度比进行磷酸肽的定量研究。通过分析成对磷酸肽的丰度比进行磷酸肽的定量研究。l应用该方法分析了体外培养的肺癌细胞系，比较了应用该方法分析了体外培养的肺癌细胞系，比较了在不同培养条件下的磷酸肽量的变化，列出了在不同培养条件下的磷酸肽量的变化，列出了3O多多个磷酸肽的表达差异。该方法的缺点在于即使应用专个磷酸肽的表达差异。该方法的缺点在于即使应用专门的软件分析，分析难度也很大。门的软件分析，分析难度也很大。3.亲和色谱结合同位素标记法亲和色谱结合同位素标记法 由于在实际生物样本中蛋白质磷酸化的化学计由于

159、在实际生物样本中蛋白质磷酸化的化学计量值较低，磷酸肽本身所具的负电性又使其在质谱量值较低，磷酸肽本身所具的负电性又使其在质谱分析时信号受抑制，磷酸肽信号丰度会比其相应未分析时信号受抑制，磷酸肽信号丰度会比其相应未磷酸化肽段的丰度要低，所以往往需要对磷酸肽进磷酸化肽段的丰度要低，所以往往需要对磷酸肽进行选择性分离或富集。行选择性分离或富集。磷酸肽的富集技术磷酸肽的富集技术l 最初用于纯化含组氨酸的蛋白质。最初用于纯化含组氨酸的蛋白质。l 19861986年年MuszylnskaMuszylnska等发现固相化的铁螯合离子对等发现固相化的铁螯合离子对磷蛋白和磷酸化氨基酸有高选择性的结合能力，现磷蛋

160、白和磷酸化氨基酸有高选择性的结合能力，现在在IMACIMAC也常被用来选择性富集磷酸肽。也常被用来选择性富集磷酸肽。l ClaverolClaverol等在研究人等在研究人20S20S蛋白酶体蛋白质组成分蛋白酶体蛋白质组成分时用时用IMACIMAC柱提取到双向电泳分离的其一个亚基的一柱提取到双向电泳分离的其一个亚基的一段磷酸肽，并最终确定了磷酸化位点。段磷酸肽，并最终确定了磷酸化位点。1.固相金属亲和色谱固相金属亲和色谱immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)l IMACIMAC柱填料的基本构成是：色谱填料一交联剂一金柱填料的基本构成是：色谱填料

161、一交联剂一金属螯合剂。属螯合剂。l 色谱填料与金属螯合剂亚氨基二乙酸或次氮基三醋酸色谱填料与金属螯合剂亚氨基二乙酸或次氮基三醋酸交联成为固定相，常用的金属离子交联成为固定相，常用的金属离子FeFe3+3+、GaGa3+3+或或CuCu2+2+等被等被螯合到固定相上。螯合到固定相上。l 磷酸基团与固相化的金属离子通过静电作用吸附，磷酸基团与固相化的金属离子通过静电作用吸附，可选择性地亲和提取磷酸肽，在碱性环境下或有磷酸盐可选择性地亲和提取磷酸肽，在碱性环境下或有磷酸盐存在时，这种相互作用被破坏从而使磷酸肽被洗脱。存在时，这种相互作用被破坏从而使磷酸肽被洗脱。l 肽混合物中如果含有一些带较多酸性残

162、基的肽段，肽混合物中如果含有一些带较多酸性残基的肽段，其酸性残基侧链上的羧基也容易与金属离子发生静电作其酸性残基侧链上的羧基也容易与金属离子发生静电作用导致非特异性吸附，所以要确保上样时样品处在酸性用导致非特异性吸附，所以要确保上样时样品处在酸性溶液中。溶液中。2.磷酸基团亲和取代磷酸基团亲和取代l将磷酸肽上的磷酸基团用另一种亲和配基取代，再将磷酸肽上的磷酸基团用另一种亲和配基取代，再用亲和提取的方法从混合物中分离富集磷酸肽，是近用亲和提取的方法从混合物中分离富集磷酸肽，是近几年出现的一种新技术。几年出现的一种新技术。l主要有两种取代方式：一种是使磷酸基团在碱性条主要有两种取代方式：一种是使磷

163、酸基团在碱性条件下发生件下发生消除反应生成双键，再用巯基乙醇通过加成消除反应生成双键，再用巯基乙醇通过加成反应取代磷酸基团的位置，最后通过交联剂在巯基上反应取代磷酸基团的位置，最后通过交联剂在巯基上连接生物素，并用亲和素色谱柱分离，这种方法只适连接生物素，并用亲和素色谱柱分离，这种方法只适合于磷酸化丝氨酸和苏氨酸的取代。合于磷酸化丝氨酸和苏氨酸的取代。l另一种是通过化学反应在磷酸基团上连接一个半胱另一种是通过化学反应在磷酸基团上连接一个半胱胺基团胺基团(cysteamine)，修饰的磷酸肽用固相化的碘乙，修饰的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝胶亲和提取酰凝胶亲和提取，这种方法适合各种磷酸氨基酸的取，这种方法适合各种磷酸氨基酸的取代。代。l这两种磷酸基团的亲和取代方法都需要进行化学反这两种磷酸基团的亲和取代方法都需要进行化学反应。为了避免副反应的影响，都需要对蛋白质中的一应。为了避免副反应的影响，都需要对蛋白质中的一些活性基团进行保护，整个反应体系比较复杂。些活性基团进行保护，整个反应体系比较复杂。前景和展望前景和展望