《DNA的粗提取与鉴定(上课)解读》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA的粗提取与鉴定(上课)解读（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、5.1 DNA5.1 DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言的粗提取而言就是要就是要利用利用DNA与与RNA、蛋白质和脂质等在物理、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。，去除其他成分。提取提取DNA的方法的方法一、提取生物大分子的基本思路一、提取生物大分子的基本思路 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。溶液中溶解度不同。1 1、DN
2、A的溶解性的溶解性溶解度NaCl浓度浓度0.14mol/L曲线解读：曲线解读：1 1、在、在NaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 mol/L时，时，DNA的溶解的溶解 度随度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；溶液浓度的增加而逐渐降低；2 2、在、在0.14 mol/L时，时，DNA溶解度溶解度最小最小；3 3、当、当NaCl溶液浓度继续增加时，溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又的溶解度又 逐渐增大。逐渐增大。 （1） 利用该特点，选择适当的盐浓利用该特点，选择适当的盐浓度就能使度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。或者相反，以达到分离
3、的目的。 （2） DNA不溶于酒精，但细胞中某不溶于酒精，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将以将DNA与蛋白质进一步地分离。与蛋白质进一步地分离。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性3、DNA的鉴定原理 本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：一是一是因为鸡血细胞核的因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；含量丰富，材料易得；二是二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作
4、繁琐，历时较长。操作繁琐，历时较长。 为什么用鸡血细胞做实验材料？为什么用鸡血细胞做实验材料？能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？ 不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实，在实验中很难提取到。验中很难提取到。1 1、制备鸡血细胞液、制备鸡血细胞液 2 2、破碎细胞，释放、破碎细胞，释放DNA 3 3、溶解细胞核内的、溶解细胞核内的DNA 4 4、DNA的析出的析出提取提取 5 5、DNA的初步纯化的初步纯化提纯提纯 6 6、DNA的鉴定的
5、鉴定 提提取取DNA的的具具体体步步骤骤1 1、制备鸡血细胞液、制备鸡血细胞液 取质量浓度为取质量浓度为0.1 0.1 g/mL的的柠檬酸钠柠檬酸钠溶液溶液100 mL，置于，置于500 mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180 mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置置于冰箱内，静置1 1d，使血细胞自行沉淀。用吸管，使血细胞自行沉淀。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。 柠檬酸钠可
6、防柠檬酸钠可防止血液凝固止血液凝固2 2、破碎细胞，释放、破碎细胞，释放DNA 向鸡血细胞液中加入向鸡血细胞液中加入蒸馏水蒸馏水，并且搅拌，从，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎也不能太快太猛，防止打碎DNA。 释放出来的大量释放出来的大量DNA和和RNA往往与蛋白质结往往与蛋白质结合在一起，应用合在一起，应用3 34 4层纱布进行过滤，除去一些层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。颗粒较大的杂质。 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一
7、种低渗液体，蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂破裂( (细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂) )，从而释放出，从而释放出DNA。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有核蛋白、多糖和可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。等杂质。 3 3、溶解细胞核内的、溶解细胞核内的DNA 在浓度较高的在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，溶液中核蛋白容易解聚，游离出的游离出的DNA溶解在溶
8、液中。在溶液中加入两倍溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为体积的浓度为2 mol/L的的NaCl溶液，搅拌溶液，搅拌1 min。注。注意应沿一个方向搅拌，使意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。充分溶解。如果使用植物材料，必须研磨充分。如果使用植物材料，必须研磨充分。 研磨不充分会使细胞核内的研磨不充分会使细胞核内的DNA释放释放不完全，提取的不完全，提取的DNA量变少，影响实验结量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。定不显示蓝色等。 4 4、DNA的析出的析出提取提取 将溶液中的将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤
9、与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。是实验成败的关键。 加加蒸馏水蒸馏水降低降低NaCl溶液浓度，使溶液浓度，使DNA析出。析出。 实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠分子的附着和缠绕。同时绕。同时应注意控制加水量应注意控制加水量，使，使NaCl溶液的始终浓度溶液的始终浓度为为0.10.2 mol/L。加水太多、溶液过稀，会使。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。分子又重新溶解。 为什么反复地溶解与析出为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？，能够去除
10、杂质？ 1 1、用高盐浓度的溶液溶解、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去，能除去在高盐中不能溶解的杂质在高盐中不能溶解的杂质； 2 2、用低盐浓度使、用低盐浓度使DNA析出，能除去析出，能除去溶解溶解在低盐溶液中的杂质。在低盐溶液中的杂质。 因此，通过反复溶解与析出因此，通过反复溶解与析出DNA，就能，就能够除去与够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。溶解度不同的多种杂质。 5 5、DNA的初步纯化的初步纯化提纯提纯 如果提取的如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，
11、常常使制取的会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制粗制品不能显示出品不能显示出DNA的本色的本色白色白色。为了增进实验效果，需要对为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯。粗制品进行简单的提纯。6 6、DNA的鉴定的鉴定 二苯胺法：二苯胺法： DNA与与二苯胺二苯胺沸水浴呈现蓝色。鉴沸水浴呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，定时溶液蓝色的深浅，与溶液中与溶液中DNA含量含量的多少有关。的多少有关。 提取提取DNA的的第一步是材料的选取第一步是材料的选取，其目的是一，其目的是一定要选取定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失
12、而造成检测的困难；验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二第二步是步是DNA的释放和溶解，的释放和溶解，这一步是实验成功与否的这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；全部溶解；第三步第三步是是DNA的纯化，的纯化，即根据即根据DNA的溶解特性、对酶及高的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂与杂质分开；质分开；最后一步是对最后一步是对DNA进行鉴定进行鉴定，这是对整个，这是对整个实验的结果的检测。实验的结果的检测。 提取提取DNA的实验操作主要步骤的目的的实验操作主要步骤的目的过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 目的目的: :获得含核物质的滤液获得含核物质的滤液 过滤含粘稠物的过滤含粘稠物的0.140.14mol/LNaCl溶液溶液 目的目的: :获取纱布上的粘稠物获取纱布上的粘稠物 过滤溶解有过滤溶解有DNA的的2 2mol/LNaCl溶液溶液 目的目的: :得到含得到含DNA的滤液的滤液 本实验中有三次过滤本实验中有三次过滤 , ,分别有什么作用分别有什么作用? ?
