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1、第四章第四章细菌的分型及其检测技术细菌的分型及其检测技术邵丽军邵丽军1严选课件表型分型技术表型分型技术基因分型技术基因分型技术色谱与质谱技术色谱与质谱技术细菌自动化鉴定技术细菌自动化鉴定技术血清学分型、生物化学分型、血清学分型、生物化学分型、噬菌体分型、细菌素分型、耐噬菌体分型、细菌素分型、耐药谱分型药谱分型等等质粒图谱分析、聚合酶链式反应质粒图谱分析、聚合酶链式反应技术、核糖体分析、染色体酶切技术、核糖体分析、染色体酶切物脉冲场凝胶电泳分型、序列分物脉冲场凝胶电泳分型、序列分型、多位点序列分型技术等。型、多位点序列分型技术等。细细菌菌分分型型气相色谱法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱法、毛
2、细管电泳技术、飞行质毛细管电泳技术、飞行质谱技术等。谱技术等。自动细菌鉴定和药自动细菌鉴定和药敏分析系统。敏分析系统。2严选课件主要内容主要内容第一节第一节细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术第二节第二节细菌素分型技术细菌素分型技术第三节第三节细菌的药物敏感试验与分型细菌的药物敏感试验与分型第四节第四节分子生物学分型技术分子生物学分型技术第五节第五节色谱和质谱技术在细菌学检色谱和质谱技术在细菌学检验中的应用验中的应用第六节第六节细菌的自动化鉴定技术细菌的自动化鉴定技术3严选课件第一节第一节细菌噬菌体分型技术细菌噬菌体分型技术l一、概述一、概述l二、细菌噬菌体分型的一般原则二、细菌噬菌体分型的一
3、般原则l三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术l四、细菌的噬菌体分型技术四、细菌的噬菌体分型技术l五、噬菌体分型优缺点（自学）五、噬菌体分型优缺点（自学）4严选课件l噬菌体噬菌体(bacteriophage;phage)l是一类能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体等是一类能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体等微生物的病毒，属于专性细胞内寄生的微生物。微生物的病毒，属于专性细胞内寄生的微生物。l自然界分布广泛，凡有细菌的场所，均可能存自然界分布广泛，凡有细菌的场所，均可能存在相应的噬菌体。在相应的噬菌体。一、概述一、概述5严选课件噬菌体的基本形态噬菌体的基本形态蝌蚪形蝌蚪形微球
4、形（无微球形（无尾）尾）细杆形（无头）细杆形（无头）噬菌体噬菌体6严选课件根据与宿主菌的关系分类根据与宿主菌的关系分类毒性噬菌体毒性噬菌体(virulent phage):(virulent phage):温和噬菌体温和噬菌体(temperate phage):(temperate phage):7严选课件8严选课件l液体培养基中液体培养基中l固体培养基上固体培养基上l噬菌体在细菌鉴定与分型方面的应用噬菌体在细菌鉴定与分型方面的应用噬菌体与宿主菌共培养噬菌体与宿主菌共培养澄清澄清噬斑噬斑噬菌体的作用具有种特异性，一种噬菌体噬菌体的作用具有种特异性，一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌；只能
5、裂解一种或与该种相近的细菌；噬菌斑的形态、大小和透亮度的不同，可噬菌斑的形态、大小和透亮度的不同，可用于鉴定细菌的型别。用于鉴定细菌的型别。9严选课件l(1)细菌型别与分型噬菌体裂解细菌型别与分型噬菌体裂解特异性稳定，特异性稳定，分型分型结果结果重复重复性好。性好。l(2)噬菌体噬菌体具有具有较高分型效率较高分型效率，能够区分菌株间的细，能够区分菌株间的细微差别，微差别，能满足流行病学研究的需要。能满足流行病学研究的需要。l(3)操作操作方法简便易行方法简便易行，实验耗时短，结果记录简明。实验耗时短，结果记录简明。l(4)方法应能标准化方法应能标准化，以利结果的比较。，以利结果的比较。l(5)
6、所用噬所用噬菌体应易于获得较高效价菌体应易于获得较高效价，能较长时间保存，能较长时间保存，噬斑清晰、大小适中，使之便于观察噬斑清晰、大小适中，使之便于观察和和准确准确记录记录。二、细菌噬菌体分型的一般原则二、细菌噬菌体分型的一般原则10严选课件l（一）噬菌体分离（一）噬菌体分离三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术制备菌悬液制备菌悬液噬菌体富集培养噬菌体富集培养制备裂解液制备裂解液噬菌体确证试验噬菌体确证试验接种适量样品，接种适量样品，12-24h离心，上清过滤除菌，离心，上清过滤除菌，滤液无菌试验滤液无菌试验平板均匀涂布一层菌液，干燥后，平板均匀涂布一层菌液，干燥后
7、，表层布表层布5-7点点，滴加滤液，一点，滴加滤液，一点生理盐水，培养观察噬斑生理盐水，培养观察噬斑11严选课件l（二）噬菌体纯化（二）噬菌体纯化稀释裂解液稀释裂解液制备噬菌体与制备噬菌体与敏感菌混合管敏感菌混合管培养培养纯化纯化10-1至至10-55个稀释度的噬菌体各个稀释度的噬菌体各0.1ml+0.2ml对数菌液，对数菌液，5min选取噬斑较分散的平板，挑取典选取噬斑较分散的平板，挑取典型噬斑，接种至含菌体培养液中型噬斑，接种至含菌体培养液中过夜增殖噬菌体。分离纯化单斑过夜增殖噬菌体。分离纯化单斑3次，至平板噬斑形态大小一致次，至平板噬斑形态大小一致制备底层琼脂平板制备底层琼脂平板制备上层
8、琼脂平板制备上层琼脂平板各稀释度混合管各稀释度混合管+3ml半固体半固体培养基，均匀覆盖平板表层培养基，均匀覆盖平板表层12严选课件l（三）噬菌体的增殖、保存（三）噬菌体的增殖、保存1、噬菌体增殖、噬菌体增殖2、去除菌体、去除菌体3、噬菌体的保存、噬菌体的保存液体增殖法：定时加入对数期菌体液体增殖法：定时加入对数期菌体固体增殖法：同时加大菌体和噬菌体的浓度固体增殖法：同时加大菌体和噬菌体的浓度细菌滤器法和三氯甲烷法细菌滤器法和三氯甲烷法冷藏保存：无需防腐剂，分装后冷藏保存：无需防腐剂，分装后7d，不宜超过，不宜超过4w冷冻干燥：冷冻干燥：2年年13严选课件l（四）噬菌体的效价和裂解谱的测定（四
9、）噬菌体的效价和裂解谱的测定1、噬菌体效价的测定、噬菌体效价的测定噬菌体效价：噬菌体效价：是指是指1ml液体中所含的活噬菌体液体中所含的活噬菌体的数量。用噬斑形成单位（的数量。用噬斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）表示。）表示。单位：单位：PFU/ml;测定方法：测定方法：双层琼脂平板法双层琼脂平板法14严选课件2、常规试验稀释度测定、常规试验稀释度测定噬菌体的常规试验稀释度噬菌体的常规试验稀释度(routinetestdilution,RTD)：是将噬菌体进行是将噬菌体进行10倍系列稀释，各稀释度噬菌体溶液点倍系列稀释，各稀释度噬菌体溶液点在宿主菌涂布的斑点上，经培养后
10、，能产生仅次于融合性在宿主菌涂布的斑点上，经培养后，能产生仅次于融合性裂解（裂解（CL）的最高稀释度。）的最高稀释度。RTD测定意义：测定意义：高浓度噬菌体会对宿主菌产生裂解外观，高浓度噬菌体会对宿主菌产生裂解外观，为避免噬菌体对细菌这种非特异性破坏，使分型噬菌体显为避免噬菌体对细菌这种非特异性破坏，使分型噬菌体显示最高的特异性，将噬菌体间的交叉反应降到最低，建议示最高的特异性，将噬菌体间的交叉反应降到最低，建议使用使用RTD或称为临界试验稀释。或称为临界试验稀释。RTD与与PFU关系，关系，均是噬菌体效价的计量单位。受噬斑均是噬菌体效价的计量单位。受噬斑大小的影响，一般的大小的影响，一般的R
11、TD约含约含1X106pfu/ml15严选课件3、裂解谱、裂解谱裂解谱裂解谱是指一种噬菌体的作用范围。即确定该噬菌体在是指一种噬菌体的作用范围。即确定该噬菌体在种内或属内的广谱性，在种外或属外的交叉反应性。种内或属内的广谱性，在种外或属外的交叉反应性。裂解模式裂解模式是指各种细菌培养物被几种噬菌体作用而出现是指各种细菌培养物被几种噬菌体作用而出现的特殊的反应模式，不同的细菌，可呈现不同的反应模式。的特殊的反应模式，不同的细菌，可呈现不同的反应模式。裂解谱和裂解模式一般用噬菌体原液进行试验，效价在裂解谱和裂解模式一般用噬菌体原液进行试验，效价在103105RTD或或1091011PFU/ml之间
12、。分型试验一般用之间。分型试验一般用1RTD的噬菌体。的噬菌体。16严选课件制备菌悬液制备菌悬液菌液涂布平板菌液涂布平板选点滴加不选点滴加不同噬菌体同噬菌体不能混有杂菌不能混有杂菌直接涂布或双层直接涂布或双层琼脂平板琼脂平板斑点滴定的结果记录如下斑点滴定的结果记录如下:融合性溶解程度融合性溶解程度:融合性溶解融合性溶解(CL)、次融合性溶解次融合性溶解(CL)、半融合性溶解、半融合性溶解(SCL)、次半融合性溶解、次半融合性溶解(SCL)、融、融合性不透明溶解，中心混浊，菌苔厚合性不透明溶解，中心混浊，菌苔厚(OL)。单个噬斑单个噬斑:大大(L)即即1.5mm、正常、正常(N)约约1.0mm、
13、小、小(S)0.11.0mm、细小、细小(m) 0.1mm、微小、微小()。细小和微小均。细小和微小均仅能用放大镜观察。仅能用放大镜观察。噬斑的数量噬斑的数量:05(-)、620()、140(+)、4160(+)、61120(+)、120(+)。四、细菌噬菌体分型技术四、细菌噬菌体分型技术17严选课件第二节第二节细菌素分型技术细菌素分型技术l细菌素细菌素(bacteriocin)l是某些细菌是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质仅对，这种物质仅对与产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌与产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌本身不敏感。如大肠菌素、绿脓菌素
14、、蜡样芽胞杆菌本身不敏感。如大肠菌素、绿脓菌素、蜡样芽胞杆菌素等。素等。l抗生素抗生素l抗菌素是细菌、真菌等微生物在生长过程中为了生存抗菌素是细菌、真菌等微生物在生长过程中为了生存竞争需要竞争需要而产生的化学物质而产生的化学物质,这种物质可保证其自身生这种物质可保证其自身生存存,同时还可杀灭或抑制其它微生物。细菌产生的有多同时还可杀灭或抑制其它微生物。细菌产生的有多粘菌素、抗菌肽等。粘菌素、抗菌肽等。一、概述一、概述18严选课件l细菌素特点细菌素特点抗菌范围很窄，在治疗上应用价值不大，但可抗菌范围很窄，在治疗上应用价值不大，但可进行细菌分型和流行病学调查。进行细菌分型和流行病学调查。l细菌素分
15、型方法细菌素分型方法利用不同型别的细菌素产生菌测定试验菌的细利用不同型别的细菌素产生菌测定试验菌的细菌素敏感模式（检测未知菌）菌素敏感模式（检测未知菌）利用已知对不同型别细菌素敏感的菌株作为指利用已知对不同型别细菌素敏感的菌株作为指示菌，测定试验菌产生细菌素的模式示菌，测定试验菌产生细菌素的模式19严选课件l（一）待测菌对细菌素敏感模式分型试验方法（一）待测菌对细菌素敏感模式分型试验方法（绿脓菌素为例）（绿脓菌素为例）绿脓菌素制备绿脓菌素制备绿脓菌素敏感试验绿脓菌素敏感试验细菌素分型试验细菌素分型试验有清晰抑菌圈，圈内无菌落者为完全抑菌有清晰抑菌圈，圈内无菌落者为完全抑菌;抑菌圈中尚有部分菌落
16、为不完全抑菌抑菌圈中尚有部分菌落为不完全抑菌;无抑无抑菌圈表示该菌对此种绿脓菌素不敏感。菌圈表示该菌对此种绿脓菌素不敏感。二、细菌素分型方法二、细菌素分型方法待测菌铺满平板，干燥后加细菌待测菌铺满平板，干燥后加细菌素标准品，观察抑菌圈。素标准品，观察抑菌圈。20严选课件l（二）平板交叉划线分型法（二）平板交叉划线分型法适用于细菌素产生量不多的细菌适用于细菌素产生量不多的细菌已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h无菌水冲洗掉菌苔，放置无菌水冲洗掉菌苔，放置2cm*2cm滤纸片，滴滤纸片，滴加三氯甲烷，灭菌加三氯甲烷，灭菌多种待测菌株与原产细菌素菌株成
17、垂直交叉划线多种待测菌株与原产细菌素菌株成垂直交叉划线接种，培养接种，培养24-48h，观察交叉点上是否有菌生，观察交叉点上是否有菌生长，判定待测菌菌型。长，判定待测菌菌型。21严选课件l（三）待检菌产生细菌素对指示菌敏感模式分型（三）待检菌产生细菌素对指示菌敏感模式分型方法方法方法同平板交叉划线分型法方法同平板交叉划线分型法已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h无菌水冲洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸灭菌无菌水冲洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸灭菌多种细菌素敏感的指示菌依次垂直交叉划线接种，多种细菌素敏感的指示菌依次垂直交叉划线接种，培养培养24-48h，观察交叉点
18、菌生长情况，观察交叉点菌生长情况，判定产判定产生细菌素试验菌菌型。生细菌素试验菌菌型。22严选课件l一、概述一、概述l二、纸片扩散法二、纸片扩散法l三、稀释法三、稀释法l四、结核分枝杆菌药敏试验四、结核分枝杆菌药敏试验第三节第三节细菌的药物敏感试验与分型细菌的药物敏感试验与分型23严选课件l细菌的药物敏感试验细菌的药物敏感试验(drugsusceptibilitytest)l是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验，是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验，简称药敏试验。简称药敏试验。l药敏试验方法药敏试验方法l纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法（纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯
19、度法（E-试验法）试验法）、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方法等。、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方法等。一、概述一、概述24严选课件l（一）基本原理：（一）基本原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。菌圈。抑菌
20、圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。愈小。二、纸片扩散法（二、纸片扩散法（K-B法）法）25严选课件( (二二) )培养基和抗菌药物纸片培养基和抗菌药物纸片1抗菌药物纸片：商品化，选择直径为6.35mm，吸水量为20l的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封贮存于超低温冰箱。2培养基：水解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4保存。26严选课件1. 在琼脂平板
21、上挑取形态相同的菌落在琼脂平板上挑取形态相同的菌落45个，接种于个，接种于35mLM-H肉汤中，肉汤中，36培养培养48h，与标准比浊管比较，与标准比浊管比较，可用肉汤或生理盐水稀释至与可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相麦氏标准比浊管浊度相同同2.在在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密）琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密），待干，待干3. 镊子灭菌冷却后，夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平镊子灭菌冷却后，夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域
22、，即两纸片间距不小于板的不同区域，即两纸片间距不小于24 mm，纸片距平板，纸片距平板边缘不小于边缘不小于15mm。 36温箱培养温箱培养1618h观察结果。观察结果。（三）试验步骤三）试验步骤27严选课件28严选课件（四）结果判断和报告（四）结果判断和报告 用精确度为用精确度为1mm1mm的游的游标卡尺量取抑菌圈直径。标卡尺量取抑菌圈直径。根据标准，作出根据标准，作出“敏感敏感”、“耐药耐药”或或“中介中介”的判的判断。断。几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度481513141210IU庆大霉素大霉素GEN0.582314221315IU红
23、霉素霉素ERY0.12921282010IU青霉素青霉素GP-G敏感敏感耐耐药敏感敏感中介中介耐耐药相相应的的MIC（g/ml）抑菌抑菌环直径（直径（mm）纸片片含含药量量抗生素抗生素代号代号29严选课件“敏感敏感”（sensitive，S）：）：表示表示测试菌可被测定药物测试菌可被测定药物常常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制抑制；“耐药耐药”（resistant，R）：）：表示测试菌不能被在体内表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无临床治疗无效效。“中介中介”（intermediat
24、e，I）：）：表示测试菌对常规用药表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高使用高于正常给药量有疗效于正常给药量有疗效。30严选课件（五）质量控制（五）质量控制采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做药敏采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做药敏试验，试验，质控菌株的抑菌圈在允许范围内，结果可质控菌株的抑菌圈在允许范围内，结果可信。信。目的：目的：检查试验条件（如培养基、含药纸片和接检查试验条件（如培养基、含药纸片和接种菌量）、操作技术等是否合格种菌量）、操作技术等是否合格质控标准菌株：质控标准菌株：大肠杆菌大肠杆菌ATCC 2
25、5922ATCC 25922、粪肠球菌、粪肠球菌ATCC 29212ATCC 29212、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC 25923ATCC 25923等等31严选课件稀释法稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制细菌生长是体外定量测定抗菌药物抑制细菌生长活性的方法，所获结果比较准确，常被用作校活性的方法，所获结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。正其他方法的标准。原理是原理是用一系列不同浓度的药物与等量细菌作用一系列不同浓度的药物与等量细菌作用，找出能抑制细菌生长的最低浓度或杀灭细用，找出能抑制细菌生长的最低浓度或杀灭细菌的最低浓度，其结果用菌的最低浓度，其结果用最小抑菌浓度最小抑菌浓度
26、(MIC)或或最小杀菌浓度最小杀菌浓度(MBC)表示表示P101。分为分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。肉汤稀释法和琼脂稀释法。三、稀释法三、稀释法32严选课件肉汤稀释法肉汤稀释法123456789101133严选课件123456789101134严选课件123456789101135严选课件特殊性：特殊性：结核分枝杆菌生长缓慢，在细菌生长之前药结核分枝杆菌生长缓慢，在细菌生长之前药物已扩散而无法影响细菌的生长。物已扩散而无法影响细菌的生长。方法：绝对浓度法、比例法、放射测量法等方法：绝对浓度法、比例法、放射测量法等。绝对浓度法绝对浓度法:是是我国我国实验室普遍使用方法。将浓度递减实验室普遍使用方法
27、。将浓度递减的药物与等量培养基混合制成含药培养基，不含药培的药物与等量培养基混合制成含药培养基，不含药培养基为对照，分别接种待测菌和标准菌，培养养基为对照，分别接种待测菌和标准菌，培养4w，菌，菌落数多于落数多于20个为阳性（据此判定个为阳性（据此判定MIC）。受试菌与标）。受试菌与标准菌准菌MIC的菌落数比值的菌落数比值2判为敏感，判为敏感，8为耐药。为耐药。比例法：比例法：WHO、国际防痨和肺病联合会推荐、国际防痨和肺病联合会推荐的标准方的标准方法。将不同稀释度的待测菌接种于相同浓度的含药培法。将不同稀释度的待测菌接种于相同浓度的含药培养基，检测耐药性。养基，检测耐药性。四、结核分枝杆菌药
28、敏试验四、结核分枝杆菌药敏试验36严选课件l一、核糖体分型一、核糖体分型l二、脉冲场凝胶电泳分型二、脉冲场凝胶电泳分型l三、序列分型三、序列分型l四、多位点序列分型技术四、多位点序列分型技术第四节第四节分子生物学分型技术分子生物学分型技术37严选课件实质：实质：核酸探针杂交分型技术。核酸探针杂交分型技术。核糖体核糖体RNA（rRNA）基因最为保守，在基因组上存）基因最为保守，在基因组上存在多个拷贝，以在多个拷贝，以rRNA基因片段为探针，检出含有基因片段为探针，检出含有rRNA基因的基因的DNA片段，通过分型杂交后的片段，通过分型杂交后的rRNA指纹指纹图，进行菌种分型和近源菌株的鉴定。图，进
29、行菌种分型和近源菌株的鉴定。原理：原理：样本样本DNA经酶切消化，凝胶电泳分离片段，转经酶切消化，凝胶电泳分离片段，转印到膜上进行印到膜上进行Southern印迹杂交分析。以印迹杂交分析。以rRNA基因基因片段为探针，杂交产生菌株特异性的片段为探针，杂交产生菌株特异性的DNA指纹图，与指纹图，与平行样本或数据库进行比对达到分型目的。平行样本或数据库进行比对达到分型目的。一、核糖体分型一、核糖体分型38严选课件39严选课件l实验过程实验过程探针的设计：一般以探针的设计：一般以16SrRNA和和23SrRNA作为探针，现已商品化作为探针，现已商品化菌体的分离培养与菌体的分离培养与DNA提取提取菌体
30、菌体DNA酶切及电泳酶切及电泳Southern印迹杂交印迹杂交全自动微生物核糖体基因分型系统。全自动微生物核糖体基因分型系统。优点是高效简便、快速、以标准化；缺点是费优点是高效简便、快速、以标准化；缺点是费用高。用高。40严选课件l脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术）技术是细菌分型较是细菌分型较灵敏的方法，通过检测染色体上所有酶切位点灵敏的方法，通过检测染色体上所有酶切位点的变化，反映全部基因的相关性，提供可靠的的变化，反映全部基因的相关性，提供可靠的基因分型依据。基因分型依据。l优点：优点：重复性好，分辨力强，是基因分型的重复性好，分辨力强，是基因分型的“金标准金标准”，在识别和
31、追踪医院感染暴发和流行在识别和追踪医院感染暴发和流行上具有实用价值。上具有实用价值。l与普通凝胶电泳区别：与普通凝胶电泳区别：普通电泳分离普通电泳分离DNA分子分子的上限是的上限是50Kb，而，而PFGE能分离能分离10-800kb的的DNA片段。片段。二、脉冲场凝胶电泳分型二、脉冲场凝胶电泳分型41严选课件lPFGE分型原理分型原理是将细菌包埋于凝胶块中，用是将细菌包埋于凝胶块中，用溶菌酶和蛋白酶溶菌酶和蛋白酶K消化菌体和蛋白质，释放完消化菌体和蛋白质，释放完整的染色体整的染色体DNA，采用稀有切点酶酶切，采用稀有切点酶酶切DNA，产生有限数目的高分子量限制性片段。在特，产生有限数目的高分子
32、量限制性片段。在特定的电泳系统中，定时改变电场方向，反复循定的电泳系统中，定时改变电场方向，反复循环，使环，使DNA在凝胶网孔中呈曲线泳动而得到在凝胶网孔中呈曲线泳动而得到分离，形成特定的电泳条带图谱。不同菌株的分离，形成特定的电泳条带图谱。不同菌株的电泳图谱具有高度特异性，染色后目测形成的电泳图谱具有高度特异性，染色后目测形成的片段条带，而识别特异的菌株。片段条带，而识别特异的菌株。42严选课件43严选课件l操作步骤操作步骤细细菌菌菌菌株株的的培培养养结结果果处处理理凝凝胶胶块块制制备备菌菌体体裂裂解解胶胶块块洗洗涤涤脉脉冲冲式式电电泳泳酶酶切切44严选课件45严选课件46严选课件原理：原理
33、：通对待测菌的全基因序列进行分析，与通对待测菌的全基因序列进行分析，与GENEBANK中的已知序列进行比较，实现分中的已知序列进行比较，实现分型。型。方法：方法：Sanger双脱氧链终止法、化学修饰法、双脱氧链终止法、化学修饰法、自动测序技术自动测序技术三、序列分型三、序列分型47严选课件l定义：定义：是高通量测序技术和群体遗传学结合的是高通量测序技术和群体遗传学结合的产物，通过测序技术揭示保守基因的等位基因产物，通过测序技术揭示保守基因的等位基因突变，实现对病原菌的分型与鉴定。突变，实现对病原菌的分型与鉴定。l特点：特点：简便易行，重复性好，且可通过网络实简便易行，重复性好，且可通过网络实现
34、实验室间数据共享和比较。现实验室间数据共享和比较。多位点序列分型技术（多位点序列分型技术（MLST）48严选课件原理原理49严选课件分析方法分析方法50严选课件步骤步骤51严选课件MLST和和PFGE分型技术比较分型技术比较52严选课件l色谱法或称层析法色谱法或称层析法是一种物理或物理化学的分离是一种物理或物理化学的分离分析方法，是多组分混合物分离分析的最重要分分析方法，是多组分混合物分离分析的最重要分析方法。析方法。l在所有色谱体系中都包含两大部分，即在所有色谱体系中都包含两大部分，即流动相和流动相和固定相固定相，以液体为流动相者称为，以液体为流动相者称为液相色谱液相色谱(LC)，以气体为流
35、动相者称为以气体为流动相者称为气相色谱气相色谱(GC)。l色谱和质谱通过对细菌色谱和质谱通过对细菌代谢组和蛋白质组分析代谢组和蛋白质组分析，进行细菌鉴定。进行细菌鉴定。第五节第五节色谱和质谱技术在细菌学检色谱和质谱技术在细菌学检验中的应用验中的应用53严选课件l气相色谱法可分为气相色谱法可分为气气-液色谱液色谱(GLC)和气和气-固色谱固色谱(GSC)。前者是分配色谱，后者是吸附色谱。前者是分配色谱，后者是吸附色谱。l特点：特点：高分离效能（短时间同时分离测定复杂组分混合物）高分离效能（短时间同时分离测定复杂组分混合物）高选择性（能分离分析性能极为相似的物质）高选择性（能分离分析性能极为相似的
36、物质）高灵敏度（痕量分析高灵敏度（痕量分析10-11-10-13g，甚至一个细菌代谢物），甚至一个细菌代谢物）高分离速度（一个分析周期几分钟至十几分钟）高分离速度（一个分析周期几分钟至十几分钟）定量结果准确定量结果准确易于自动化易于自动化应用范围广应用范围广一、气相色谱法在细菌学研究中的应用一、气相色谱法在细菌学研究中的应用54严选课件l气相色谱法与传统实验方法区别：气相色谱法与传统实验方法区别：不需细菌分离不需细菌分离培养过程，通过对细菌组成成分和分解代谢产物培养过程，通过对细菌组成成分和分解代谢产物分析，鉴定细菌科、属、种、株。鉴定时不需活分析，鉴定细菌科、属、种、株。鉴定时不需活菌。菌。
37、55严选课件l气相色谱法鉴定细菌的途径：气相色谱法鉴定细菌的途径：分析细菌细胞裂解产物分析细菌细胞裂解产物分析细菌细胞的酸性或碱性条件下的水解物分析细菌细胞的酸性或碱性条件下的水解物分析培养物中的挥发性产物，如气体、酸、醇分析培养物中的挥发性产物，如气体、酸、醇分析培养物中的代谢产物分析培养物中的代谢产物分析细菌培养基质降解代谢产物分析细菌培养基质降解代谢产物分析细菌在血清、临床标本或生物制品中的活力分析细菌在血清、临床标本或生物制品中的活力56严选课件l气相色谱法在细菌学检验中的应用：气相色谱法在细菌学检验中的应用：分析细菌细胞成分分析细菌细胞成分（如分析菌体脂肪酸，鉴定菌体亲缘关系）（如分
38、析菌体脂肪酸，鉴定菌体亲缘关系）分析细菌在体外培养物中的代谢产物分析细菌在体外培养物中的代谢产物（如厌氧菌产生的短链（如厌氧菌产生的短链脂肪酸色谱图、需氧菌的有机酸色谱图等）脂肪酸色谱图、需氧菌的有机酸色谱图等）临床标本中检出和鉴定细菌（临床标本中检出和鉴定细菌（如检测脑脊液中的乳酸，对细菌如检测脑脊液中的乳酸，对细菌性脑膜炎做出明确诊断等）性脑膜炎做出明确诊断等）热裂解气相色谱法鉴定细菌热裂解气相色谱法鉴定细菌（将样品干燥高温裂解，碎（将样品干燥高温裂解，碎片色谱图鉴定微生物，如沙门菌属十种血清型鉴别）片色谱图鉴定微生物，如沙门菌属十种血清型鉴别）高分辨气相色谱法分析冷冻条件下细菌的挥发性有
39、机产高分辨气相色谱法分析冷冻条件下细菌的挥发性有机产物物（鉴定引起冷冻品腐败的微生物）（鉴定引起冷冻品腐败的微生物）57严选课件l液相色谱法基于混合物中各组分对液相色谱法基于混合物中各组分对固定相和流动固定相和流动相亲和力的差异分离组分相亲和力的差异分离组分的。的。二、液相色谱法在细菌学研究中的应用二、液相色谱法在细菌学研究中的应用58严选课件59严选课件分类分类l1、按吸附力分、按吸附力分为吸附色谱、分配色谱、离子为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱和离子色谱等交换色谱、凝胶渗透色谱和离子色谱等l2、按固定相分、按固定相分液固色谱、液液色谱和键合相液固色谱、液液色谱和键合相色谱（
40、正常相色谱法和反相液相色谱）。色谱（正常相色谱法和反相液相色谱）。60严选课件l反相高效色谱法反相高效色谱法根据菌种间根据菌种间某些特征大分子某些特征大分子的的结构、大小、电荷分布等方面存在的固有差异结构、大小、电荷分布等方面存在的固有差异对菌体进行快速鉴别对菌体进行快速鉴别（如对分枝杆菌细胞壁脂质中（如对分枝杆菌细胞壁脂质中分枝菌酸进行分析，根据色谱图鉴别菌种）。分枝菌酸进行分析，根据色谱图鉴别菌种）。l变性高效液相色谱技术（变性高效液相色谱技术（DHPLC）：）：近年来发近年来发展起来的一种快速、灵敏、准确、高通量展起来的一种快速、灵敏、准确、高通量筛选筛选DNA序序列变异的基因检测技术，
41、列变异的基因检测技术，被广泛应用于临床基因诊断、被广泛应用于临床基因诊断、突变检测、分型鉴别等诊断检测中，也适合于大批量突变检测、分型鉴别等诊断检测中，也适合于大批量检测环境或食品样品中的致病微生物的靶基因。检测环境或食品样品中的致病微生物的靶基因。61严选课件l毛细管电泳毛细管电泳(CE)(CE)，又叫高效毛细管电泳或毛细又叫高效毛细管电泳或毛细管分离法，是八十年代问世的一种管分离法，是八十年代问世的一种高效的液相高效的液相分离方法分离方法，是，是经典电泳技术和现代微柱分离相经典电泳技术和现代微柱分离相结合结合的产物。即以毛细管为分离通道，以高压的产物。即以毛细管为分离通道，以高压直流电场为
42、驱动力，根据样品各组分迁移速度直流电场为驱动力，根据样品各组分迁移速度和分配上的差异而进行分离。和分配上的差异而进行分离。三、毛细管电泳在细菌学研究中的应用三、毛细管电泳在细菌学研究中的应用62严选课件l传统电泳分析：传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。无法与其他分析相比。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：1、采用了内径在、采用了内径在25100m，外径，外径300400m的的毛细管毛细管，使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效
43、应，使电场电压可以很高电压可以很高2、采用了、采用了高达数千伏的电压高达数千伏的电压，电场推动力大，使柱效远高，电场推动力大，使柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，米，1 1、CECE技术要点技术要点63严选课件2 2、CECE原理原理l毛细管电泳中，带电粒子的运动受到两种作用：毛细管电泳中，带电粒子的运动受到两种作用：电泳电泳和电渗和电渗。电泳电泳是指溶液中带电粒子是指溶液中带电粒子(离子、胶团离子、胶团)在电场中定向在电场中定向移动的现象，是驱动毛细管中电解质运动的一种作用移动的现象，是驱动毛细管中电解质运动的一种作用力。力。电渗电渗是
44、在电场的作用下，毛细管中的溶液表层聚集的是在电场的作用下，毛细管中的溶液表层聚集的正电荷向负极运动的现象。正电荷向负极运动的现象。64严选课件3 3、高效毛、高效毛细管电泳细管电泳分离模式分离模式 毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)(CZE)1 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CZE) (CZE) 2胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MEKCMEKC）3 毛细管等速电泳毛细管等速电泳（CITFCITF）5毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦(CIEF)(CIEF)4毛细管电色谱毛细管电色谱（CECCEC）665严选课件4 4、高效毛细管电泳的特点、高效毛细管电泳的特点1. 1. 仪器简单、易自动
45、化仪器简单、易自动化l电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2. 2. 分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高l在在3.1min3.1min内分离内分离3636种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1min4.1min内分离了内分离了2424种阳离子；种阳离子；柱效常常可达柱效常常可达10105 5-10-106 6理论塔极数理论塔极数/ /米米；3. 3. 操作方便、消耗少操作方便、消耗少l进样量极少，进样量极少，每次进样的体积仅为每次进样的体积仅为10nL10nL4. 4. 应用范围极广应用范围极广l分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等分子生物学、医
46、学、药学、化学、环境保护、材料等66严选课件5 5、CECE在微在微生物研究领生物研究领域的域的应用应用微生物分离与检测微生物分离与检测细菌的鉴定与分型细菌的鉴定与分型不同种类微生物的点迁移不同种类微生物的点迁移速率不同，可直接分析样速率不同，可直接分析样品，用量少速度快品，用量少速度快可以分出仅有可以分出仅有1个碱基差别个碱基差别的的DNA，分离快速高效。，分离快速高效。67严选课件l原理原理数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成
47、检索本。通过对未赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。中每个生化反应出现的频率总和。第六节第六节细菌的自动化鉴定技术细菌的自动化鉴定技术68严选课件自动化细菌鉴自动化细菌鉴定系统局限性定系统局限性 数据库资料不完数据库资料不完整影响鉴定种类整影响鉴定种类数据库要经常更新数据库要经常更新
48、背景资料不完整背景资料不完整影响准确性影响准确性结果需核对结果需核对设备试剂费用高设备试剂费用高69严选课件重要知识点重要知识点l细菌噬菌体分型原则；常规试验稀释定义及测细菌噬菌体分型原则；常规试验稀释定义及测定意义定意义l细菌素分型方法细菌素分型方法l药敏试验方法；纸片扩散法原理及结果判断；药敏试验方法；纸片扩散法原理及结果判断；稀释法分类；稀释法分类；MBC和和MIC定义；结核分枝杆菌定义；结核分枝杆菌药敏试验特殊性及试验方法药敏试验特殊性及试验方法lRT技术原理；技术原理；PFGE原理、原理、MLST定义原理；定义原理；l气相色谱应用的优势；气相色谱应用的优势；GC和和CE在细菌学检验在细菌学检验中应用；中应用；CE原理；原理；CE与与HPLC差异；差异；l细菌自动化鉴定技术的原理及局限性细菌自动化鉴定技术的原理及局限性70严选课件
