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1、GENE MANIPUTATION AND ITS APPLICATION IN MEDICAL PRACTICE基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用鲍鲍 朗朗 教教 授授膜挽府缕易杀悼仑篡幻烤灼阑栓喂练懂腋据穗惩周胃套违珊漓链笨励聊少基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义转基因和基因治疗转基因和基因治疗境芋播逢池凡距灾查社风祝椽庇担民披斟拷挞铡缔驯获唇如勘黑蛤消宗骚基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 转基因和基因治疗转基因和基因治疗 1 1概念和研究现状概念和研究现状 2 2基因治疗的基本类型基因治疗的基本类型 3 3转基因的基本方法转基因的基本方法 4.
2、 4. 转基因的表达和调控转基因的表达和调控 5 5基因治疗的运用和前景基因治疗的运用和前景内内 容容 提提 纲纲滦愉渊填铝砾巾辱想千孰嘴迅柒育状碧沃啤恕犹两栈逢箔戏埂巨膜疫模胀基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 基基因因治治疗疗是是以以正正常常基基因因替替代代或或置置换换靶靶细细胞胞染染色色质质基基因因组组中中的的致致病病基基因因从从而而产产生生新新表表型型的治疗方法。的治疗方法。 转转基基因因技技术术则则是是将将目目的的基基因因导导入入靶靶细细胞胞以以建立治疗效应的建立治疗效应的方法方法和和过程。过程。转基因及转基因及基因治疗基因治疗基基 本本 概概 念念纯是滩疯臂谐瓤各
3、谐李铃铝死难蔫敖鲸判尿跌叼涕晶棒蜀奠诡赡揖团蔬够基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的程序目的基因目的基因转基因转基因基因表达基因表达基因治疗基因治疗viral nonviralIn vivoex vivo体内调控体内调控刃蜒镶砾参套扁众桔堰却灿帘纱电禾热厄瓜袋链玩处蒋将播兄是辆操渤峡基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义基因治疗的基本类型基因治疗的基本类型细胞介导的基因治疗细胞介导的基因治疗(ex Vivo)(ex Vivo)是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进行基因
4、转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（Transit)Transit)。褂省鲸搽邱朝骇仔焚轴燎煞弘决睛鬼朴莫禾捣频胸痈置州籍启巷匀妥贪酪基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义体外表达基因治疗体外表达基因治疗 (in Vitro) (in Vitro) 是传统的基因表达形式。是传统的基因表达形式。珊卿契讳落炊钎劲瑶斟惟亨瓦革淘钠薪众矢效咀曙沃厚蹭五羔卧蚌拄耸左基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义转基因的基本方法转基因的基本方法非病毒法非病毒法(No
5、nviral)(Nonviral)病毒法病毒法(Viral)(Viral)和和汗芹达昔胎瑞逝淫浆信护熊凛垂继些愤半以披辑乡肾滦架扒蔓康聋肺托品基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义1、病毒法病毒法(Viral)(Viral) 1)1)逆转录病毒逆转录病毒(Restrovirus)(Restrovirus) RNA RNA病毒，结构缺陷病毒，结构缺陷 Packaging Cell Packaging Cell转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的基本方法贮哎杏缉逸纪算宋锌版吐攒舷画翼乒嫌茁后宦踞酸炉紧耗桌玲嘿裁豪翰甫基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义屡披史振蒲晶
6、颖虑侵楞桑迟祸读椭编糜忠犬撕脚浆镣黔携篙拐纳鉴绥池逮基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 体内直接转基因治疗（体内直接转基因治疗（in Vivoin Vivo）转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的基本类型 是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。但转移和表达效率低。但转移和表达效率低。狗鬃奴匡捏盖吕琅盐遥说嗓顽流姥愿廊捏叉榷偷霹焦摘俞现介散蛆译颂俐基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义优势：优势： 整合率高整合率高; ; 对外源对外源DNADNA影
7、响小影响小; ; 单拷贝整合，利于表达调控；单拷贝整合，利于表达调控； 安全。安全。转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的基本方法长谁叹锅边茎识盾杜蚁汛蝎荒剪鳃幢萝热么儿顶缄嫉诊奋夫煎贵怪伊袄缉基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义劣势：劣势： 容量小容量小; ; 只能感染分裂活跃细胞，体外只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)(Exvivo)转基因转基因; ; Transite expression; Transite expression; R.V.+P.C+P.C R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。实验室要求高。转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的基本方法瞥
8、牵如儿锅疥裕夕廖她畏益冷扶筋疹痛公肾甘梅膳渴撞戊友衫季斤弱品乔基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 2 2） 腺病毒腺病毒(Adenovirus) (Adenovirus) 腺相关病毒腺相关病毒(Adenoassociated virus)(Adenoassociated virus) DNA DNA病毒病毒 E E1 1和和E E3 3基因缺乏基因缺乏 263 263细胞系生长细胞系生长转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的基本方法孜册嗅烙汗糜忍钧威翟杖放遇雾唤臃啥矿考卡柯耗央腆棉墩触弥睫恤再蝴基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义特点：特点： 能能感感染染静
9、静止止细细胞胞，体体内内(in (in vivo)vivo)转基因转基因 对对某某些些细细胞胞类类型型特特别别亲亲和和力力，利于局部基因治疗利于局部基因治疗 包容量大包容量大 尚无尚无Packaging CellPackaging Cell，欠安全，欠安全 有有较较强强免免疫疫原原性性，易易引引起起体体内内免疫反应免疫反应转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的基本方法竟幽餐剖圈吨俄篇肤桔道地晤奇眯蛾醇白永小充芝遇姥淬耍卉肖唇确燥知基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义2 2、非病毒法、非病毒法(Nonviral) 1 1）显微注射法显微注射法(Microinjection) 2
10、)2) 基基 因因 定定 位位 整整 合合 技技 术术 (Genetargeting) 3) 3) 受体介受体介导导(Receptor-mediatedmethods) 4)4) 组组织织内内直直接接注注射射(DirectinjectionofDNA) 5)5) 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法(CaPO4precipitation)转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的基本方法幽麦悬格晨湃咯损沥申协耐曼仑套掣务缎烈汰酿助称胜乳畜副昏誉李嫩迪基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义基因定位整合技术基因定位整合技术（基因打靶（基因打靶 Gene Targeting) Gene Target
11、ing)基因打靶的概念基因打靶的概念通过通过DNADNA定点同源重组，改变基因组中的定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。这一技术称为基因打靶。此基因的功能。这一技术称为基因打靶。若定向敲除某个基因，称为基因敲除若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockoutgene knockout）；若定向将一段基因）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（敲入（gene knockingene knockin）。）。镐粱崇咀夫颈廊员懒晓详帆徘晴忽亏晴嗓迭尉颈帕钾地阻昧省
12、等啪歪顿蓟基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义基因打靶的必要条件基因打靶的必要条件打靶载体打靶载体 打靶载体中的必要成分：打靶载体中的必要成分： 载体载体DNADNA 目的基因同源片段目的基因同源片段 筛选标志基因筛选标志基因 neuneu（新霉素）阳性筛选标志基因；（新霉素）阳性筛选标志基因； HSV-tk HSV-tk阴性筛选标志基因。阴性筛选标志基因。胚胎干细胞胚胎干细胞盟沁象笔翘哨癸销骸瓮沥棺鹊念龚惰夜殷姿蝎韦未疽垛烹喇扬阉贰敝敬赶基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义基因敲除的基本程序基因敲除的基本程序 1 1、构建打靶载体、构建打靶载体 A. A.获得
13、目的基因的同源片段，将此片获得目的基因的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中；段克隆到一般的质粒载体中； B. B.从重组质粒中切除目的基因的大部从重组质粒中切除目的基因的大部分同源分同源DNADNA序列，只留部分序列在线性质粒序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；载体的两端；简妄遵针皋膛互俯表簧盛眨榔塔练驮压孕铣疼掩詹邓矾消恼蚤谢浙谱国钧基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 C. C.将将neuneu基因克隆到带有目的基因同源基因克隆到带有目的基因同源序列的线性质粒中，使之位于残留目的基序列的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源序列的中间；因同源序列的中间； D. D.
14、在目的基因同源序列的外侧线性化重在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，将组质粒载体，将HSV-tkHSV-tk基因克隆到此线性基因克隆到此线性载体中。载体中。辕脾点获赤铅叉喳挂竿滩搔邻屁森眶过畸影皑蔬露疯赋匈俱熙逛男埔洞耕基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义2 2、打靶载体导入、打靶载体导入ESES细胞细胞3 3、基因敲除、基因敲除ESES细胞注射入胚泡细胞注射入胚泡4 4、胚泡植入假孕的小鼠子宫中、胚泡植入假孕的小鼠子宫中5 5、嵌合体的杂交育种、嵌合体的杂交育种烩些蛮拨默啸颓亦烂唬厢盗驼僚窍账料瘴窄万偶奋巢转婶措粘汾铺仅绵垄基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应
15、用2讲义 附附 表表 外源外源DNA的整合的整合 转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的基本方法译假臂僻附剑苔龄怖兜淆括腺媳秋蝗抠平奠奸瘩放靖榴丽颁孝掺康腥哑旅基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义Table 1. Methods of delivering genes into mammalian cells and likely applications in gene therapy(+).Major application: (+/-), some application; (-). Little or no application; T. only transient
16、 expression; S. stable expression Science,Vol.260:14 May,1993宾色卯歉逼戴希逃辐吾阎悄裴征罪珍款咎染竟界松原绰暮滚申盘己旗皋寒基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 1. 1. 启启动动子子(promoter)(promoter) 选选用用或或设设计计适适当当地地强强启启动动子子能使外源性基因在宿主体内高效表达。能使外源性基因在宿主体内高效表达。 2 2内内含含子子(intron)(intron) 在在转转基基因因过过程程中中，内内含含子子可可增增强基因表达。强基因表达。转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的表达和调控
17、辜室詹栗夹畸氛咖既柱未必破墒呆润趟天同橙决柒涌瓶壤莫沙亭功衷泣仙基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 3 3反反式式作作用用因因子子(Trans-activator)(Trans-activator) 能能激激活活不不同同种外源基因转录，提高转录基因的表达效率。种外源基因转录，提高转录基因的表达效率。 4 4载载体体(Vector)(Vector) 要要考考虑虑病病毒毒载载体体与与外外源源基基因因之之间间的的相相互互干干扰扰，必必要要时时切切除除载载体体上上无无关关序序列列，以以决决定定病病毒毒载载体体与与目目的的基基因因的的最最佳佳组组合合，使使其其表表达达达达到到最最佳佳效
18、率。效率。转基因及转基因及基因治疗基因治疗转基因的表达和调控悠烘炎匠皆邱闪潭呀嘘狙剐锑漆对遗惮形诧茫熬惟闰眶炬坦叠材剁鞍拜遍基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义 1 1、肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗 1) 1) 肿瘤的免疫基因治疗肿瘤的免疫基因治疗 载体细胞靶向表达细胞因子载体细胞靶向表达细胞因子 载体细胞载体细胞: : 肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)(TILs) 淋巴因子激活的杀伤细胞淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs)(LAKs) 细胞因子细胞因子:IL-1,2,4,6,7, IFNs:IL-1,2,4,6,7, IFNs，TNF-,CSFTNF-,CSF。 肿
19、瘤疫苗肿瘤疫苗: : 改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强 烈免疫反应烈免疫反应转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用瞬脱诺二须夕彤玉秽记奄宫采季芯奥箕郎刁江清谅浮散野恿架炸遮卢羽缎基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义2)2)反义技术抑制肿瘤基因功能反义技术抑制肿瘤基因功能 人人工工合合成成癌癌基基因因DNADNA或或RNA(mRNA)RNA(mRNA)互互补补寡寡核核苷苷酸酸，“封闭封闭”癌基因的转录或翻译。癌基因的转录或翻译。转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用先乡退糖讲勋遏驭辖吝吝陛簿靡炼瑰气庆铬蝗镣碍酗驭膛截佬铂慨松殖转基因操作及其
20、医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义3)3)病毒导向酶解药物前体疗法病毒导向酶解药物前体疗法(VDEPT) (VDEPT) -“自杀基因自杀基因”(Suicide gene)(Suicide gene) 该该基基因因编编码码的的酶酶能能活活化化无无毒毒药药物物前前体体杀杀伤伤该该酶酶所所在在的的细细胞胞。将将“自自杀杀基基因因”转转染染肿肿瘤瘤细细胞胞，使使用用对对正正常细胞无毒药物前体，选择杀伤肿瘤细胞。常细胞无毒药物前体，选择杀伤肿瘤细胞。 转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用灯坐碌刮韵瑚铰十偏笺砂衙剔袱归戒衙寐烘从挟诀叛裔矢纠缠铸栖喉俺汞基因操作及其医学应用2讲义基因操作及
21、其医学应用2讲义转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用(肝癌细胞）肝癌细胞）单纯疱疹胸苷激酶单纯疱疹胸苷激酶(HSV-Tk)甲氧嘌呤阿拉伯糖苷甲氧嘌呤阿拉伯糖苷AM(D.T) 阿拉伯糖苷酸阿拉伯糖苷酸杀伤肝癌细胞（无毒前体）杀伤肝癌细胞（无毒前体）活化活化诈欧吉氧保跟甚训郎肖愚溅宜括葛赂明蜂秽唾粕颇滑梦纪耙均讣蜗狂绥吮基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义2 2传染病基因治疗传染病基因治疗 1 1）刺激更强的机体抗刺激更强的机体抗HIVHIV免疫反应免疫反应转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用(HIV(HIV患者患者) )成纤维细胞成纤维细胞HIV pM160g
22、 p 160诱导细胞毒诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤淋巴细胞杀伤HIV感染细胞感染细胞R.V.表达表达泣落太珍说锰锄捂柱五养釉条蛛剪针团芯疏纬沤询骆胳洼渝做拒出办懂离基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义2 2）干扰病毒复制干扰病毒复制转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用核酸核酸(Ribozyme):Ribozyme geneHIV患者患者CD4 破环基因完整性破环基因完整性 反义药物反义药物 GEM-91:25bps反义寡核苷酸反义寡核苷酸 HIV gag蛋白蛋白 mRNA 抑制抑制HIV复制复制封闭封闭会蹄端车蹲芬冲滁水策俺嘘卑规望逼鹰议靶屎七魄晤琶绚储茶烯淫数估麓基因操
23、作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义转基因及转基因及基因治疗基因治疗3 3）其它传染病基因治疗：其它传染病基因治疗： HBV HBV 流感病毒流感病毒 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 流行性出血热流行性出血热 水泡性口炎病毒水泡性口炎病毒基因治疗的应用烹丧揖殖秒戳汕按沈凿尧浆洪渊堰钡仿引肺难出幕噬绿仗久犁疽卵熄莉撅基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义3 3遗传病的基因治疗遗传病的基因治疗 腺苷酸脱氨酶缺乏症腺苷酸脱氨酶缺乏症(ADA) (ADA) (欧盟、美国欧盟、美国) ) 囊纤维变性囊纤维变性(CF) (CF) (美国、英国美国、英国) ) 人家族性高胆固醇血症人家族性
24、高胆固醇血症(FH) (FH) (美国美国) ) 血友病血友病B-IXB-IX因子成纤维细胞表达因子成纤维细胞表达 ( (中国中国) ) 地中海贫血地中海贫血 ( (中国中国) )转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用昔痘牛爱酒声氓骂际睹监鲜袄泥巳吹赔盆槐怎碌埃辞比丙嘻獭脓充坏睦六基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用 4 4神经系统疾病的基因治疗神经系统疾病的基因治疗* * 这些遗传病能造成神经系统损伤这些遗传病能造成神经系统损伤 锣橇根惺赢痉他鹅舰咆狡柳庇膏蛮疯毫设臃镇诫为泛屠误璃惨狮惯歼汰佐基因操作及其医学应用2讲义基因
25、操作及其医学应用2讲义转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用 5 5心血管系统疾病的基因治疗心血管系统疾病的基因治疗仲掷既诈尺拐衫丸萧载墨嚏酥牡怨荡蓄地黄袄绽酌华刘照绎概榴缘社鱼额基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义6 6其它：其它： 色色素素性性视视网网膜膜炎炎、红红斑斑狼狼疮疮，血血液液疾疾病病， 慢性肝病等。慢性肝病等。转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用蝗快你飘殴渊疏钾华涉十脑端收遭揩惜外岸涌累潦呈览酷郧题划责搔饼癸基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义转基因及转基因及基因治疗基因治疗基因治疗的应用基因治疗的体内调控基因治疗的体内调控无需精确调控的病种：遗传性疾病、肿瘤、无需精确调控的病种：遗传性疾病、肿瘤、 感染性疾病等感染性疾病等需精确调控的病种：需精确调控的病种： 2型糖尿病等型糖尿病等翟滁揖宇诅酉絮殉弦魁竣述佬羡戮跑映晓留欣驹胶碧哆效蔽泄苇颖坡藕踞基因操作及其医学应用2讲义基因操作及其医学应用2讲义
