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1、孔雀石绿的分析孔雀石绿 ： 化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式C23H25ClN2，又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、维多利亚绿或中国绿,属三苯甲烷类,用于制陶、纺织、皮革、食品着色剂和细胞染剂,目前多用于抗真菌感染和杀灭寄生虫,在水产领域一般用于鱼类防治水霉病,烂鳃病以及寄生虫等,由于其性价比高,曾一度在水产养殖业中广泛应用。 但各种毒理学实验表明,MG具有高毒、高残留、“三致”等毒副作用,其在水产领域的应用已为世界各国所禁止。近年来发现孔雀石绿(MG)特别是其代谢产物无色孔雀石绿(LMG)在水产动物体有明显的蓄积残留现象,而其化学官能团三苯甲烷是一类致癌物质 无色孔雀石绿(LMG)的结构式
2、:孔雀石绿(MG)的结构式：孔雀石绿的检测方法目前孔雀石绿的检测以理化检测法和免疫学检测法为主。一、理化检测法u薄层层析法u分光光度法u气相色谱法( GC)u高效液相色谱法( HPLC)u液相色谱质谱串联检测法( LC-MS) u气相色谱质谱联用法( GC-MS)二、免疫学检测主要用酶联免疫检测法。国内孔雀石绿检测标准 理化检测方法适用于专业检测和实验室使用，,但难以满足现场快速检测和基层样品初筛的要求。近年来发展迅速的免疫分析法(IA)集免疫反应、有机合成、酶催化等先进技术于一身,具备快速准确,成本低廉等特点,可以满足现场初筛,快速判定的要求。 酶联免疫检测法建立小分子免疫分析技术,关键点有
3、3个: u人工抗原合成和抗体制备。u酶和抗体标记物的备。u检测技术方法学的建立。 LMG是小分子质,在免疫学上称半抗原,必须要同大分子载体偶联后才能免疫动物制备抗体。无色孔雀石绿的修饰无色孔雀石绿的衍生化反应途径一、免疫原及包被抗原的制备 利用重氮化法将无色孔雀石绿修饰物与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)交联,制成免疫原及包被抗原二、多克隆抗体的制备 将免疫原(LMG-BSA)与福氏完全佐剂以11混溶,对两只新西兰大白兔进行多次免疫(第一次动物免疫将免疫原与福氏完全佐剂混溶,之后的动物免疫将免疫原与福氏不完全佐剂混溶),经5次免疫后,制得多克隆抗体。三、间接酶联免疫吸附分析法步骤u
4、用包被抗原(LMG-OVA)包被酶标板,200L/孔， 4过夜。u用PBST缓冲液洗板3次, 300L/孔，加入1%Casein进行封阻，室温放置1h,洗板。u加入抗体,标液(或样品稀释液)各100L/孔,室温孵育1h。包被在酶标板上的固定抗原(LMG-OVA)和添加的标液中的LMG游离抗原与竞争抗体的结合位点。PBS洗涤扣干3次，游离的抗原抗体复合物被洗涤去除。u加入用PBS稀释的山羊抗兔 IgG2辣根过氧化物酶偶合物(GaRIgG-HRP), 200L/孔,室温1h。形成抗原-抗体-酶标二抗的复合物固定在酶标二抗上，洗板, 。PBS洗涤扣干3次，游离的酶标二抗被洗涤除去。u加入TMB底物溶液200L/孔,显色,避光反应,在微量振荡器上振摇约1520min。u加入5%硫酸,80L/孔,终止反应。结果处理： 用酶标仪于450nm处测定各孔溶液的吸光度(A)。标准溶液中无色孔雀石绿的浓度越大,吸光度越小。以AlogC作图得到测定无色孔雀石绿的标准曲线,从图中可以算出检出限(DL)和IC50值。IC50值越小,灵敏度越高。待测样品中无色孔雀石绿的浓度可根据其相应的吸光度从标准曲线中求出。
