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1、中国汉族人食管鳞状细胞癌中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究易感基因定位研究 周福有周福有周福有周福有 王立东王立东王立东王立东 河南省河南省河南省河南省食管癌重点开放实验室食管癌重点开放实验室食管癌重点开放实验室食管癌重点开放实验室2010.10.31 2010.10.31 2010.10.31 2010.10.31 中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究河南省河南省林县、安阳、林县、安阳、新乡等新乡等显著的地域分布差异显著的地域分布差异 食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，每年死亡食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，每年死亡3030万人，也是中国万人，也是中国最常见的恶性肿瘤
2、，排在中国恶性肿瘤死因的第四位最常见的恶性肿瘤，排在中国恶性肿瘤死因的第四位 有显著的地域分布特征，高低发区发病率相差高达有显著的地域分布特征，高低发区发病率相差高达500500倍倍中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究杨氏家族杨氏家族家庭成员家庭成员:23, :23, 食管癌患者食管癌患者:15(65%):15(65%)明显的家族聚集现象明显的家族聚集现象中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究高癌家族高癌家族 林县林县 19651965年年高癌家族高癌家族 林县林县 20072007年年环境因素复杂环境因素复杂中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究遗传因素明显遗传因素明显中国汉族人食管
3、鳞状细胞癌易感基因定位研究食管癌的病因尚不清楚食管癌的病因尚不清楚遗传因素？环境因素？环境因素？问题：遗传因素和环境因素究竟孰重孰轻？问题：遗传因素和环境因素究竟孰重孰轻？ 相互之间如何起作用？相互之间如何起作用？中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究遗传遗传食食管管癌癌遗传和环境共同作用遗传和环境共同作用GeneAGeneBGeneCGeneAGeneBGeneC环境环境相互作用相互作用中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究与遗传相关的疾病分类与遗传相关的疾病分类遗传病遗传病BECDA单基因疾病单基因疾病多基因疾病多基因疾病体细胞遗传病体细胞遗传病线粒体疾病线粒体疾病染色体疾病染色体疾病
4、中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究单基因遗传病单基因遗传病单基因遗传病是指单一基因突变引起的疾病符合孟德尔遗传方式，所以称孟德尔式遗传病中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究多基因遗传病多基因遗传病 多基因遗传病是由多基因遗传病是由多个微效基因多个微效基因与与环境因素环境因素共同作共同作用用所致所致, 遗传方式不遵循孟德尔遗传模式遗传方式不遵循孟德尔遗传模式癌症癌症糖尿病糖尿病高血压高血压冠心病冠心病精神分裂症精神分裂症 中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究20032003年年19531953年年遗传学研究的三大里程碑遗传学研究的三大里程碑人类基因组研究第一次浪潮人类基因组研究第一
5、次浪潮20052005年年中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究n多国参与的合作项目多国参与的合作项目n构建不同人群的高密度构建不同人群的高密度SNPSNP图谱图谱n确立确立SNPSNP在人群中的常见分布和传递模式在人群中的常见分布和传递模式n每每10001000个个碱碱基基对对中中有有1 1个个SNP,SNP,个个体体遗遗传传信信息息有有99.9%99.9%是是相相同同，差差异异0.1%0.1%。发现与这些差异可以了解常见疾病相关基因。发现与这些差异可以了解常见疾病相关基因n为为揭揭示示人人类类的的遗遗传传机机制制，发发现现常常见见疾疾病病相相关关基基因因提提供供方方向向；为为发现复杂疾病
6、易感基因提供基础数据、研究策略和先进技术发现复杂疾病易感基因提供基础数据、研究策略和先进技术人类基因组单体型图计划人类基因组单体型图计划（HapMapHapMap计划）计划）中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究 GWASGWAS基于基于“常见疾病，常见突变常见疾病，常见突变”学说，通过整个学说，通过整个人类基因组来寻找常见遗传变异的可见性状间关系的研人类基因组来寻找常见遗传变异的可见性状间关系的研究方法究方法全基因组关联分析全基因组关联分析(GWAS)?(GWAS)?中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究GWASGWAS原理原理 ATGCAAGCTGATCGATCGATCGCGACCAT
7、GCAGCACCTGACTGCATGCAAGCTGTTCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGC病例病例对照对照原理：原理：在一定人群中，某个等位基因或在一定人群中，某个等位基因或基因型在病例和对照组中存在差基因型在病例和对照组中存在差异，说明它与疾病有关联性异，说明它与疾病有关联性病例病例对照对照中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究n在病例中等位基因C C的频率明显高于对照 提示：等位基因C C与疾病存在一定关联性55%35%45%65%30.25%30.25%12.25%12.25%20.25%20.25%42.25%42.25%45.5%45.5%49.5%49
8、.5%GWASGWAS举例举例 中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究全基因组关联分析全基因组关联分析GenomewideassociationstudyGenomewideassociationstudyGWAS优势优势中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究GWASGWAS癌症研究癌症研究(NG,2008-)(NG,2008-)已完成或正进行：乳腺、前列腺、肺、结直肠癌、已完成或正进行：乳腺、前列腺、肺、结直肠癌、 黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胰腺、膀胱、肾脏、黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胰腺、膀胱、肾脏、 卵巢癌和造血系统肿瘤等卵巢癌和造血系统肿瘤等食管癌：日本食管癌：日本1 1篇小样
9、本文章篇小样本文章尚无中国汉族人食管癌尚无中国汉族人食管癌GWASGWAS资料资料中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究“863”863”计划将对威胁我国人口健康计划将对威胁我国人口健康的的5 5类常见重大疾病：精神疾病、类常见重大疾病：精神疾病、高血压、糖尿病、食管癌和肺癌高血压、糖尿病、食管癌和肺癌 进行全基因组关联分析研究。进行全基因组关联分析研究。中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究选择选择tagSNPstagSNPs标记单体型标记单体型在病例在病例- -对照人群间对照人群间比较比较SNPsSNPs等位基因频率等位基因频率全基因组关联统计全基因组关联统计分析，得出有意义的分析，得
10、出有意义的SNPsSNPs另外选择独立的病例另外选择独立的病例- -对照人群对照人群对初筛阶段的结果进行验证对初筛阶段的结果进行验证GWASGWAS技术路线技术路线HapMapHapMap计划计划初筛阶段初筛阶段重复验证阶段重复验证阶段利用芯片对所有利用芯片对所有tagSNPstagSNPs进行基因分型进行基因分型中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究研究对象研究对象中国汉族人群全部21496例初筛2810例（病例1077例/对照1733例）验证18686例（病例7673例/对照11013例）中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究入组标准入组标准1.资料详实完整2.病例/对照为同一地区3.
11、自愿参加4.病例组无治疗史5.病例组病理证实6.食管癌分期按UICC2007标准7.对照组三代亲属中无食管癌病例8.对照组经内镜检查除外早期食管癌9.不符合以上标准予以除外中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究资料及血样收集资料及血样收集45家医院：全国范围，华北为主问卷调查：统一格式采集外周静脉血食管癌食管癌GWAS合作研究研讨会合作研究研讨会 2009.4.5-6安阳安阳中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究DNADNA提取及标化提取及标化QIAGEN（德国）基因组DNA提取试剂盒按标准程序提取每份血样的DNA准确测定每份待标化DNA的浓度初筛浓度：50ng/l，OD值1.8-2.0验
12、证浓度：15ng-20ng/l，OD值1.7-2.0中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究基因分型和质控基因分型和质控初筛：IlluminaHuman610-Quad芯片验证：SequenomiPLEX芯片具体步骤：（6 6）清洁芯片）清洁芯片（7 7）染色）染色（8 8）芯片扫描）芯片扫描（9 9）数据质控）数据质控（1）制备）制备MSA1板板（2）片段化）片段化（3）沉淀）沉淀（4）重悬）重悬（5）杂交）杂交中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究优优势势技技术术：综综合合了了BeadArrayBeadArray高高密密度度微微阵阵列列技技术术和和GoldenGateGoldenGate
13、多通道位点特异性延伸扩增检测方案多通道位点特异性延伸扩增检测方案通通量量：一一次次分分型型的的SNPSNP位位点点达达到到5555万万6060万万, ,同同时时可可以定制自己感兴趣的位点以定制自己感兴趣的位点IlluminaIllumina分型芯片分型芯片中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究统计学分析统计学分析数据质控：计算样本得率、SNP得率、最小等位基因频率、哈迪温伯格遗传平衡吻合度检验对质控后的数据用Plink1.03软件分析Cochran-Armitage趋势检验：计算P值、优势比（OR）和95%可信区间（95%CI）中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究初初筛筛50万个SNPS
14、病例病例10771077病例病例 937 对照对照17331733对照对照 692趋势检验趋势检验进入初筛进入初筛去除不匹配者去除不匹配者8080个个SNPSNPS S1818个个SNPSNPS S22个个SNPSNPS S中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究全基因组曼哈顿图全基因组曼哈顿图（937937病例病例/692/692对照）对照）中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究选选点点中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究选选点点中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究1818个个SNPSNPS S 2 2个个SNPSNPS S病例病例 76737673例例/ /对照对照1101311
15、013例例 rs2274223 rs13042395验验 证证中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究研究了在目标SNP和基因位点处相关区域的重组和链锁不平衡类型两个易感基因分别定位phospholipaseCepsilon1(PLCE1),10q23chromosome20openingreadingframe54(C20orf54),20p13基因定位基因定位中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究两个易感基因和肿瘤密切相关两个易感基因和肿瘤密切相关PLCE1（磷脂酶基因亚运型）对多种恶性肿瘤的发生、发展、转移有促进作用C20orf54（核黄素转运基因）调节人类核黄素的转运，而核黄素缺乏是
16、增加食管鳞状细胞癌发生的重要风险因子中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究PLCE1PLCE1蛋白表达在蛋白表达在不同病变组织差异显著不同病变组织差异显著0 0101020203030404050506060707080809090正常组织正常组织食管鳞癌食管鳞癌癌前病变癌前病变% %P P=2.08E-13=2.08E-13阳性阳性阴性阴性中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究结果提示结果提示 免疫组化发现随食管癌变过程的进展，即正常癌前病变浸润癌各级组织中PLCE1PLCE1蛋白阳性表达率逐渐升高进一步提示：PLCE1PLCE1的遗传变异在食管癌变过程中起重要作用，PLCE1PLCE1
17、可能是中国汉族人食管鳞状细胞癌的致病基因中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究食管癌变各阶段免疫组化染色食管癌变各阶段免疫组化染色DYSDYSNORNORCISCISSCCSCC中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究王立东，周福有，等王立东，周福有，等中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究ADH1BADH1B位于位于4q21-234q21-23ALDH2ALDH2位于位于12q2412q24两个基因都与酒精代谢有关两个基因都与酒精代谢有关日本日本食管鳞癌食管鳞癌GWAS结果结果增加食管鳞癌发病风险增加食管鳞癌发病风险中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究下一步工作计划下一步工作计划增加
18、样本量，再筛出几个易感基因将所发现的易感基因在世界各地样品进行验证，找出种族差异进行现场研究，用于食管癌早筛相关功能研究，靶向药物的研制中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究GWASGWAS临床应用临床应用GWASGWAS重复验证重复验证明确基因和基因产物明确基因和基因产物确定功能确定功能开发基因靶向治疗药物开发基因靶向治疗药物开展个体化治疗开展个体化治疗开发诊断试剂开发诊断试剂为临床诊断服务为临床诊断服务设计预防干预手设计预防干预手段，证实基因对段，证实基因对疾病的作用疾病的作用为疾病预防为疾病预防提供指导提供指导中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究未来的发展未来的发展后后GWAS时代时代l基因与基因、基因与环境的交互作用l测序：全基因组、候选区域l基因表达研究l蛋白产物：结构、功能l动物模型研究：基因敲除、基因导入中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究未来未来临床与基础相结合临床与基础相结合临床研究临床研究基础研究基础研究苏通斜拉桥苏通斜拉桥中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究 谢谢谢谢! !祝大家工作顺利身体健康！祝大家工作顺利身体健康！中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究
