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1、一、体细胞杂交的概念概念：体细胞杂交，即原生质体融合，将两个不同亲本的原生质体，概念：体细胞杂交，即原生质体融合，将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A + BA + B）。）。几种不同的表述：几种不同的表述：体细胞杂交：体细胞杂交：Somatichybridization细胞融合：细胞融合：Cellfusion原生质体融合：原生质体融合：Protoplastfusion无性杂交：无性杂交：asexualhybridization超性杂交：超性杂交：Parasexualhybridization超
2、性融合：超性融合：Parasexualfusion细胞操作：细胞操作：Cellmanipulation细胞工程（细胞工程（Cellengineering）体细胞杂交与有性杂交的异同体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容比较内容体细胞杂交体细胞杂交有性杂交有性杂交时间时间无季节限制无季节限制花期限制，特别花期限制，特别是母本的花期是母本的花期亲缘关系亲缘关系一定程度上可以一定程度上可以克服有性克服有性/嫁接不嫁接不亲和性亲和性受亲和性影响受亲和性影响结果结果细胞核、细胞质细胞核、细胞质均可以重组、倍均可以重组、倍性增加性增加双受精，一般无双受精，一般无细胞质重组，倍细胞质重组，倍性不改变性不改变+
3、体细胞杂交体细胞杂交有性杂交有性杂交PossibleResultofFusionofTwoGeneticallyDifferentProtoplasts=chloroplast=nucleusFusionheterokaryoncybridcybridhybridhybrid=mitochondria原生质体融合的有关名词原生质体融合的有关名词-Il对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%）l非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（胞质杂种（cytoplasmichybrid,Cy
4、brid）：）：细细胞质重组，细胞核胞质重组，细胞核未重组未重组l对称融合（对称融合（symmetricfusion）也称标准融合（也称标准融合（Standardfusion）l非对称融合（非对称融合（asymmetricfusion）：）：融合前对一方进行融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分处理，使其染色体丢失一部分原生质体融合的有关名词原生质体融合的有关名词-IIl供供-受体融合：受体融合：Donor-recipientfusionl体配融合（体配融合（gameto-somaticfusion）（）（性性细胞与体细胞细胞与体细胞融合）融合）l亚原生质体亚原生质体-原生质体融合：原生质
5、体融合：Subprotoplast-protoplastfusion小原生质体：小原生质体：Miniprotoplast微原生质体：微原生质体：Microprotoplast胞质体：胞质体：Cytoplastl胞质体胞质体-原生质体融合原生质体融合:Cytoplast-protoplastfusion发展历程发展历程l70年代，技术建立和完善优化年代，技术建立和完善优化1972年获得烟草种间体细胞杂种年获得烟草种间体细胞杂种1975年高年高Ca高高pH加加PEG融合方法，电融合法融合方法，电融合法大量成功报道，不少为异想天开的实验大量成功报道，不少为异想天开的实验l80年代初，由模式植物转向农
6、作物年代初，由模式植物转向农作物/经济作物，对称融合到经济作物，对称融合到非对称融合，创造新种质的技术手段非对称融合，创造新种质的技术手段l80年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道l90年代至今，成为一种育种手段年代至今，成为一种育种手段19601960年，年，KockingKocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；19711971年，年，TakebeTakebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；19721972年，年，CarlsonCarlso
7、n首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；植物体细胞杂种；19741974年，年，KaoKao将聚乙二醇（将聚乙二醇（PEGPEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；了相应的融合技术；19781978年，年，MelchersMelchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄马铃薯）；获得第一个属间体细胞杂种（番茄马铃薯）；19811981年，年，ZimmermanZimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987198
8、7年，年，SchweigerSchweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。建立了单对原生质体电融合技术程序。植物体细胞杂交的几个重要进展植物体细胞杂交的几个重要进展理论上，任何细胞都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资理论上，任何细胞都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统
9、，体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。发生重组，从而产生新的核外遗传系统。根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大方式：大方式：对称融合（对称融合（symmetricfusion）即两个完整的）即两个完整的细胞原生质体融合。细胞原生质体融合。非对称融合（非对称融合（asymmetricfusion）利用物理或）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融化学方法使某亲本的核或细胞质
10、失活后再进行融合。合。用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：大类：物理方法常采用射线处理，如物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，射线、射线等，使细胞核失活；使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂：核失活碘乙酰胺化学处理目前常用的试剂：核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活罗丹；质失活罗丹明（明（R6G，它是一种亲脂染料，能够抑制线，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。二、原生质体融合二、原生质体融合融合方法融合方法原生质体融合过程原生
11、质体融合过程影响原生质体融合的因素影响原生质体融合的因素 融合方法融合方法PEG融合电融合Polyethyleneglycol（PEG）Electrofusion,Electricallyinducedfusion1.PEG诱导融合法诱导融合法PEG诱导融合的特点：优点是融合成本低，勿需特殊诱导融合的特点：优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。PEG作用机理：作用机理：Kao等认为，由于等认为，由于PEG分子具有轻微分子具
12、有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果使原生质体发生粘连进而促进原生质体融桥，其结果使原生质体发生粘连进而促进原生质体融合；另外，合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。体的核、细胞器发生融合成为可能。融合液：融合液：CaCl22H2O810mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇0.51.0molpH5.6诱导液：融合液诱导液：融合液PE
13、G2045稀释液：稀释液：A液（液（g/100ml）pH6.0B液液(g/100ml)pH10.5葡萄糖葡萄糖7.21甘氨酸甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169P1P2P1P2混合静止混合静止1min.融融合合融合液融合液加入加入PEG稀稀释释洗洗涤涤加入稀释液加入稀释液加入培养基加入培养基培培养养选选择择2 2电融合法电融合法 Electrofusion,Electricallyinducedfusion 与与PEGPEG融合相比，电融合有三大优点：融合相比，电融合有三大优点： 不存在对细胞的毒害问题；不存在对细胞的毒害问题； 融合效率高；融合效率高； 融合技术操作简
14、便。融合技术操作简便。Electrofusion:AhighfrequencyACfieldisappliedbetween2electrodesimmersedinthesuspensionofprotoplasts-thisinduceschargesontheprotoplastsandcausesthemtoarrangethemselvesinlinesbetweentheelectrodestoformpearl-chain.Theyarethensubjecttoahighvoltagedischargewhichcausestheirmembranestofusewhereth
15、eyareincontact.电融合仪的结构特点：电融合仪的结构特点：交变电场部分交变电场部分高频直流电击部分高频直流电击部分电融合的基本过程：电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高
16、频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起并圆球化。细胞融合在一起并圆球化。 关于融合参数：交流电压关于融合参数：交流电压 交变电场的振幅频率交变电场的振幅频率 交变电场的处理时间交变电场的处理时间 直流高频电压直流高频电压 脉冲宽度脉冲宽度 脉冲次数脉冲次数 原生质体的融合过程膜的融合膜的融合细胞质融合细胞质融合 发生发生膜融合后的数小时膜融合后的数小时 核融合核融合 融合可能发生在细胞间期，也可能发生融合可能发生在细胞间期，也可能发生在第一次同步分裂过程中在第一次同步分裂过程中 影响原生质体融合的因素影响原生质体融合
17、的因素原生质体质量对细胞融合起着至关重要的作用，原生质体质量对细胞融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件高质量的原生质体是细胞融合的首要条件融合方法融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当融合参数，包括各种融合液都应选择适当 三、杂种细胞的发育动态三、杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定及体细胞杂种鉴定杂种细胞的发育动态杂种细胞的发育动态杂种细胞选择系统杂种细胞选择系统与体细胞杂种植株鉴定与体细胞杂种植株鉴定体细胞杂种的特点体细胞杂种的特点体细胞杂种后代的遗传体细胞杂种后代的遗传 杂种细胞的发育动态杂种细胞的发育动态核融合核融合核重组核重组细胞器重组细胞器重组部分核物质
18、或细胞器丢失部分核物质或细胞器丢失核分裂的非同步性核分裂的非同步性 杂种细胞选择系统与杂种植杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定株鉴定1 1杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统 外观选择：质体、细外观选择：质体、细胞体积等胞体积等 互补选择：抗生素、互补选择：抗生素、营养缺陷型等营养缺陷型等 荧光标记选择：亲本荧光标记选择：亲本标记不同荧光标记不同荧光2 2体细胞杂种鉴定体细胞杂种鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、染色体原位杂交染色体原位杂交生化鉴定：同功酶鉴定生化鉴定：
19、同功酶鉴定分子鉴定：分子鉴定：RFLPRFLP、RAPDRAPD、SSRSSR等分子标记等分子标记形形态态鉴鉴定定和和同同功功酶酶鉴鉴定定染色体原位杂交染色体原位杂交GISH、FISHRAPD标记鉴定标记鉴定5101100670bp75025050020001000bp1234567891011121314体细胞杂种的遗传1 1细胞分裂与染色体丢失细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中会有两种结果：一是细胞分裂几次后即停止程中会有两种结果：一是细胞分裂几次后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本生长从而导致死亡；
20、二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。的细胞核部分或全部丢失。 减数分裂时染色体配对异常：环形、染色体桥等。减数分裂时染色体配对异常：环形、染色体桥等。2 2基因转移与性状表达基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常在后代中某些性状得以表达，有时由于基通常在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。因的重组也可能产生双亲均没有的新性状
21、。 3 3体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。遗传物质的重组等。 4 4体细胞杂种的核质遗传体细胞杂种的核质遗传1 1）核遗传：双亲之和，少数有重组和丢失）核遗传：双亲之和，少数有重组和丢失2 2）线粒体遗传：往往有重组，柑橘上例外，仅来自线粒体遗传：往往有重组，柑橘上例外，仅来自愈伤组织亲本愈伤组织亲本3 3）叶绿体遗传：随机分离
22、，也有共存现象）叶绿体遗传：随机分离，也有共存现象四、体细胞杂交技术的应用获得新物种获得新物种获得新种质和新品种获得新种质和新品种转移细胞质基因控制性状转移细胞质基因控制性状体细胞杂交技术展望体细胞杂交技术展望体细胞杂交技术的应用体细胞杂交技术的应用l克服生殖障碍，创造新种质；克服生殖障碍，创造新种质；l转移有益性状，改良作物品质；转移有益性状，改良作物品质；l转移部分染色体，创造非对称杂种；转移部分染色体，创造非对称杂种；l转移胞质基因组，创造胞质杂种；转移胞质基因组，创造胞质杂种；l作为育种中间材料（作为育种中间材料（bridgematerial），），进一进一步用于作物改良。步用于作物改
23、良。杂种组合杂种组合新属新属萝卜萝卜Raphanus sativus（2n=18）+甘蓝甘蓝Brassica oleracea（2n=18）Raphanobrassica甘蓝甘蓝Brassica oleracea（2n=18）+Moricandia arvensis（2n=27,28）Moricandiobrassica芝麻菜芝麻菜Eruca sativa（2n=22）+甘蓝型油菜甘蓝型油菜Brassica napus（2n=38）Erucobrassica二行芥二行芥Diplotaxis muralis（2n=42）+甘蓝型油菜甘蓝型油菜Brassica napus（2n=38）Diplot
24、axobrassica烟草烟草Nicotiana tabacum（2n=24）+番茄番茄Lycopersicon esculentum（2n=24）Nicotiopersicon马铃薯马铃薯Solanum tuberosum（2n=24）+番茄番茄Lycopersicon esculentum（2n=24）Solanopersicon曼陀罗曼陀罗Datura innoxia（2n=48）+颠茄颠茄Atropa belladona（2n=24）Daturotropa水稻水稻Oryza sativa（2n=24）+稻稗稻稗Echinochloa oryzicola（2n=24）Oryzochloa
25、通过原生质体融合获得的属间体细胞杂种通过原生质体融合获得的属间体细胞杂种 体细胞杂种体细胞杂种性状性状抗性抗性Nicotiana tabacum+N.nesophila烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）Solamun tuberosum+S.chacoense马铃薯马铃薯X病毒（病毒（potatovirusX，PVX）N.tabacum+N.nesophila烟草角蠕虫（烟草角蠕虫（tobaccohornworm）S.tuberosum+S.brevidens马铃薯卷叶病毒（马铃薯卷叶病毒（potatoleafrollvirus，PLRV），晚疫），晚疫
26、病（病（lateblight），马铃薯），马铃薯Y病毒（病毒（potatovirusY，PVY）S.circalifolium+S.tuberosum疫霉属（疫霉属（Phytophthora）S.melongena+S.sanitwongsei青枯假单胞菌（青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum）S.tuberosum+Smersonii耐霜冻（耐霜冻（frosttolerance）Brassica.napus+B.nigra十字花科黑胫菌（十字花科黑胫菌（Phoma lingam）B.oleracea+Sinapis alba甘蓝长尾交链孢霉（甘蓝长尾交链孢霉（Alt
27、ernaria brassiceae）B.napus+Sinapis alba甘蓝长尾交链孢霉（甘蓝长尾交链孢霉（Alternaria brassiceae）Citrus sinensis+Poncirus trifoliata脚腐病（脚腐病（Phytophthora）Lycopersicon esculentum+L.peruvianum烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（TMV），斑萎病毒（），斑萎病毒（spottedwiltvirus），），coldtolerance原生质体融合转移的一些遗传性状原生质体融合转移的一些遗传性状农艺性状（通过胞质杂种转移）农艺性状（通过胞质杂种转移）N.tabac
28、um+N.sylvestris链霉素抗性（链霉素抗性（Streptomycinresistance）三嗪抗性（三嗪抗性（Triazineresistance）S.nigrum+S.tuberosum三嗪抗性（三嗪抗性（Triazineresistance）B.nigra+B.napus潮霉素抗性（潮霉素抗性（hygromycinresistance）N.tabacum+ N.sylvestris细胞质雄性不育（细胞质雄性不育（CMS）B.campestris +B.napus细胞质雄性不育（细胞质雄性不育（CMS）B.napus+B.campestris+Raphanus sativa细胞质雄
29、性不育（细胞质雄性不育（CMS）和三嗪抗性）和三嗪抗性（Triazineresistance）L.esculentum+Solanum acaule细胞质雄性不育（细胞质雄性不育（CMS）B.napus+B.tournefortii细胞质雄性不育（细胞质雄性不育（CMS）柑橘体细胞杂交策略柑橘体细胞杂交策略StrategiesforProtoplastFusioninCitrusScion+ScionRootstock+Rootstock Citrus+OtherGenera2X+4X2X+2X:2XcybridorasymmetricSHX+2X:seedless3X(Japan,Franc
30、e)针对柑橘育种实践，我国针对柑橘育种实践，我国HZAUHZAU已获得已获得4040余例柑橘余例柑橘属间、种间体细胞杂种属间、种间体细胞杂种/ /胞质杂种；胞质杂种；典型组合：柑橘典型组合：柑橘 + + 金柑、红桔金柑、红桔 + + 枳、柑橘枳、柑橘 + + 九九里香、柑橘里香、柑橘 + + 黄皮、脐橙黄皮、脐橙 + + 葡萄柚、温州蜜柑葡萄柚、温州蜜柑 + + 杂种柚等；杂种柚等；世界共获得世界共获得250250例以上，中国（例以上，中国（4040）、美国）、美国（120120）、日本（）、日本（2020）、法国（）、法国（1515）、意大利）、意大利（5 5）、西班牙（）、西班牙（1010
31、）、巴西（）、巴西（1515）、以色列）、以色列（5 5）等国。）等国。世界柑橘体细胞杂种创造概况世界柑橘体细胞杂种创造概况KobayashiSetal.JJapanSocHortSci,1995,64:283-289柑橘体细胞杂种的应用柑橘体细胞杂种的应用l与二倍体有性杂交，培育三倍体；与二倍体有性杂交，培育三倍体；l进行二倍体柚瘪籽果实生产；进行二倍体柚瘪籽果实生产；l直接作为二倍体、四倍体鲜食品种；直接作为二倍体、四倍体鲜食品种；l砧木育种；砧木育种；l基础理论研究的理想材料基础理论研究的理想材料以异源四倍体为父本培育三倍体的优点以异源四倍体为父本培育三倍体的优点l亲本来源广泛，目前全世
32、界亲本来源广泛，目前全世界200余例；余例；l花粉育性比同源四倍体高；花粉育性比同源四倍体高；l通过倍性杂交获得的三倍体为三亲杂种，遗传基通过倍性杂交获得的三倍体为三亲杂种，遗传基础更为广泛，有利于筛选优质、多抗柑橘类型。础更为广泛，有利于筛选优质、多抗柑橘类型。本章思考题本章思考题l概念：概念：原生质体、原生质体融合原生质体、原生质体融合/体细胞杂交等有关体细胞杂交等有关名词名词l简答题：简答题：l原生质体培养方法及各自特点？原生质体培养方法及各自特点？lPEG融合与电融合各有何特点？电融合的原理是什么融合与电融合各有何特点？电融合的原理是什么？l植物体细胞杂种如何筛选和鉴定？植物体细胞杂种如何筛选和鉴定？l植物体细胞杂种在育种上的应用有哪些？植物体细胞杂种在育种上的应用有哪些？
