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1、PCR技术在乙肝方面的应用技术在乙肝方面的应用The application of PCR technique in HBVThe application of PCR technique in HBV 涿州市医院检验科 刘鹏年Hepatitis B Virus乙型肝炎的病原体乙型肝炎的病原体在全世界广泛流行，估计全球半数以上人在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被口已被HBVHBV感染过。感染过。中国：乙肝高发区，人群中国：乙肝高发区，人群HBsAgHBsAg的检出率的检出率达达9.8%9.8%乙型肝炎病毒感染的现状乙型肝炎病毒感染的现状全球约有全球约有3.53.5亿人感染乙型肝炎病毒，
2、中国有亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.21.2亿人感染，其中每年约有亿人感染，其中每年约有1-2%1-2%会出现肝硬化或会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)(HBV)感染引起的。感染引起的。全世界乙肝携带者达全世界乙肝携带者达5 5亿之多，我国是乙肝携带亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的者高于人群的1010。急性乙肝中有。急性乙肝中有20%20%会转为会转为慢性，进而可能发展为肝硬化和肝癌，因此，准慢性，进而可能发展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极
3、为重要。确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长度3.2kb 目前感染人类最小的DNA病毒 部分双链环状DNA。 HBV基基 因因 及及 编编 码码 蛋蛋 白白Hepatitis B Virus 乙肝的实验室诊断乙肝的实验室诊断（一）生化学检查（一）生化学检查（二）（二）HBV血清学检查血清学检查（三）（三）HBVDNA、基因型和变异检查、基因型和变异检查生化学检查生化学检查ALTALT和和ASTAST血清胆红素血清胆红素凝血酶原时间（凝血酶原时间（PT）及）及PTA胆碱酯酶胆碱酯酶血清白蛋白血清白蛋白甲胎蛋白（甲胎蛋
4、白（AFP）生化检测的局限性生化检测的局限性敏感度有限敏感度有限代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储备能力备能力关于关于“胆酶分离胆酶分离”现象现象HBV血清学检查血清学检查项目：项目：HBsAg、抗抗-HBs、HBeAg、抗抗-HBe、抗抗-HBc以及抗以及抗-HBcIgM方法方法ELISA(enzyme-linkedELISA(enzyme-linkedimmunosorbentimmunosorbent assayassay，最常用，定性最常用，定性最常用，定性最常用，定性) )发光免疫分析发光免疫分析发光免疫分析发光免疫分析( (定量定量定量定量)
5、)HBsAgHBsAg 感染的标志感染的标志感染的标志感染的标志Anti-Anti-HBsHBs 既往感染既往感染既往感染既往感染/ /接种疫苗接种疫苗接种疫苗接种疫苗Anti-Anti-HBcHBc IgMIgM 急性感染标志急性感染标志急性感染标志急性感染标志Anti-Anti-HBcHBc IgGIgG 既往或慢性感染既往或慢性感染既往或慢性感染既往或慢性感染HBeAgHBeAg 急性病毒复制，有传染性急性病毒复制，有传染性急性病毒复制，有传染性急性病毒复制，有传染性 Anti-Anti-HBeHBe 病毒不再复制病毒不再复制病毒不再复制病毒不再复制HBV-DNAHBV-DNA 急急急急
6、性性性性病病病病毒毒毒毒复复复复制制制制，比比比比HBeAgHBeAg更更更更准准准准确确确确；主要用于监测治疗反应主要用于监测治疗反应主要用于监测治疗反应主要用于监测治疗反应血清学检测的临床意义HBsAgHBsAg 抗抗抗抗- -HBsHBs HBeAgHBeAg 抗抗抗抗- -HBeHBe 抗抗抗抗- -HBcHBc 临床意义临床意义临床意义临床意义 急性或慢性感染急性或慢性感染(大三阳大三阳)+-+-+乙肝后期或慢性感染乙肝后期或慢性感染(小三阳小三阳)-+-潜伏期或急性乙肝早期潜伏期或急性乙肝早期-+痊愈或恢复期痊愈或恢复期,有免疫力有免疫力-+-痊愈痊愈,有免疫力有免疫力疫苗接种或曾
7、经感染过疫苗接种或曾经感染过,有免疫力有免疫力血清学检测的局限性血清学检测的局限性HBV具有具有“检测窗口期检测窗口期”假阴性结果假阴性结果无法检测突变株及抗体无法检测突变株及抗体SymptomsHBeAganti-HBeIgG anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100Acute HBV Infection with RecoveryTypical Serologic CourseWeeksafterExposureTitreIgM anti-HBcIgG anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgC
8、hronic(Years)anti-HBe048 12 16 20 24 28 32 3652YearsWeeksafterExposureTitreProgression to Chronic HBV InfectionTypical Serologic CoursePCR技术检测HBV DNAPCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应于于于于19831983年由美国年由美国年由美国年由美国CetusCetus公司的公司的公司的公司的K.MullisK.Mullis建立建立建立建立，并，并，并，并和定点突变的发明者和定点突变的发明者和定点突变的发明者和定点突变的发明者M.
9、SmithM.SmithM.SmithM.Smith一起荣获一起荣获一起荣获一起荣获1993199319931993年度诺贝尔化学奖，年度诺贝尔化学奖，年度诺贝尔化学奖，年度诺贝尔化学奖，为生命科学领为生命科学领为生命科学领为生命科学领域的研究开创了崭新时代。域的研究开创了崭新时代。域的研究开创了崭新时代。域的研究开创了崭新时代。PCR概念 PCRPCR（PolymeraseChainReactionPolymeraseChainReaction）即聚合酶链即聚合酶链即聚合酶链即聚合酶链式反应，是指在式反应，是指在式反应，是指在式反应，是指在DNADNA聚合酶催化下，以母链聚合酶催化下，以母链
10、聚合酶催化下，以母链聚合酶催化下，以母链DNADNA为模板，为模板，为模板，为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板体外复制出与母链模板体外复制出与母链模板体外复制出与母链模板DNADNA互补的子链互补的子链互补的子链互补的子链DNADNA的过程。是一的过程。是一的过程。是一的过程。是一项项项项DNA体外合成放大体外合成放大技术，能快速特异地在体外技术，能快速特异地在体外技术，能快速特异地在体外技术，能快速特
11、异地在体外扩增任何目的扩增任何目的扩增任何目的扩增任何目的DNADNA。PCR反应的特点特异性强特异性强特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 指数增长指数增长指数增长指数增长，从从从从pg (10pg (10-12-12) )可扩增至可扩增至可扩增至可扩增至 m m m mg (10g (10-6-6) )水平水平水平水平 简便、快速简便、快速简便、快速简便、快速 2 2小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增对标本的纯
12、度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 DNA DNA 粗制品及总粗制品及总粗制品及总粗制品及总RNARNA均可作为扩增模板均可作为扩增模板均可作为扩增模板均可作为扩增模板 PCR反应过程DNA的体外复制包括的体外复制包括3个步骤：个步骤：变性（变性（denaturation）:94 C C30s退火（退火（annealing）:55 C C 30s延伸（延伸（extension）:72 C C30-60s3个步骤作为个步骤作为PCR的一个循环，每当完成的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。
13、产物量以指数形式增长。 普通普通普通普通 PCRPCRPCRPCR 技术的缺点技术的缺点技术的缺点技术的缺点 普通普通普通普通PCRPCRPCRPCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周临床检测技术虽然解决了检出率低、周临床检测技术虽然解决了检出率低、周临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。导临床实践。导临床实践。导临床实践。 因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在1997199719971997
14、年行文禁止将普通年行文禁止将普通年行文禁止将普通年行文禁止将普通PCRPCRPCRPCR技术用于临床诊断。技术用于临床诊断。技术用于临床诊断。技术用于临床诊断。 定量定量PCR的特点的特点 采采采采用用用用闭闭闭闭管管管管检检检检测测测测，不不不不需需需需PCRPCR后后后后处处处处理理理理，并并并并采采采采用用用用dUTPdUTP-UNG-UNG酶酶酶酶的的的的防防防防污污污污染染染染系系系系统统统统，扩扩扩扩增增增增和和和和检检检检测测测测一一一一次次次次同同同同时时时时完完完完成成成成。不不不不需需需需开开开开盖盖盖盖，不不不不产产产产生生生生污污污污染染染染。 避避避避免免免免了了了了
15、假假假假阳阳阳阳性。性。性。性。 探针与被检探针与被检探针与被检探针与被检DNADNA序列特异杂交，序列特异杂交，序列特异杂交，序列特异杂交， 增强了特异性。增强了特异性。增强了特异性。增强了特异性。定量定量PCR的特点的特点可可可可定定定定量量量量结结结结果果果果，准准准准确确确确灵灵灵灵敏敏敏敏地地地地反反反反应应应应了了了了病病病病原原原原体体体体的的的的感感感感染和治疗恢复情况。染和治疗恢复情况。染和治疗恢复情况。染和治疗恢复情况。光光光光谱谱谱谱分分分分析析析析仪仪仪仪直直直直读读读读结结结结果果果果，自自自自动动动动分分分分析析析析， 增增增增强强强强了了了了灵灵灵灵敏性和客观性。
16、敏性和客观性。敏性和客观性。敏性和客观性。HBV DNA检测方法的比较 斑点杂交斑点杂交 PCR PCR 定量定量PCRPCR敏感性敏感性敏感性敏感性 低低低低 较高较高较高较高 高高高高特异性特异性特异性特异性 高高高高 稍低稍低稍低稍低 高高高高重复性重复性重复性重复性 好好好好 稍差稍差稍差稍差 好好好好定量范围定量范围定量范围定量范围 4 6 64 6 64 6 64 6 6简便简便简便简便 较繁琐较繁琐较繁琐较繁琐 简便简便简便简便 简便简便简便简便安全性安全性安全性安全性 好好好好 稍差稍差稍差稍差 好好好好设备设备设备设备 便宜便宜便宜便宜 稍贵稍贵稍贵稍贵 昂贵昂贵昂贵昂贵技术
17、要求技术要求技术要求技术要求 低低低低 高高高高 高高高高检测价格检测价格检测价格检测价格 低低低低 中中中中 高高高高为什么建议每个病人都要进行HBV DNA检测？ HBV DNA检测的临床意义 诊断方面：诊断方面： HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据 HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV复制的标志复制的标志 HBV DNAHBV DNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志HBV DNA检测的临床意义 对对HBV-MHBV-M起补充作用：起补充作用： HBeAgHBeAg()/ ()/ 抗抗HBeHBe()()乙型肝炎乙型肝炎 （前（
18、前C C区变异）区变异） HBsAgHBsAg()()乙型肝炎乙型肝炎 （S S区变异）区变异） 低水平感染低水平感染 单项抗单项抗HBcHBc()()乙型肝炎乙型肝炎 HBV基基 因因 及及 编编 码码 蛋蛋 白白HBV DNA检测的临床意义 疗效判断：疗效判断： HBV HBV DNADNA是是目目前前判判断断乙乙肝肝抗抗病病毒毒药药物疗效最敏感的指标物疗效最敏感的指标 预后判断预后判断 HBV DNAHBV DNA水平与病情有一定的关系水平与病情有一定的关系 HBV-MHBV-MHBV-MHBV-M与与与与HBV DNAHBV DNAHBV DNAHBV DNA关系关系关系关系 广东广东
19、广东广东 四川四川四川四川 湖南湖南湖南湖南 解放军解放军解放军解放军 南方医院南方医院南方医院南方医院 “ “ 大三阳大三阳大三阳大三阳” ” 86.286.2 85.0 87.3 94.38 93.485.0 87.3 94.38 93.4“ “小三阳小三阳小三阳小三阳” ” 35.1 20.3 25.6 27.3 23.835.1 20.3 25.6 27.3 23.8“ “ 小二阳小二阳小二阳小二阳” ” 40.7 27.6 48.8 38.56 30.540.7 27.6 48.8 38.56 30.5 抗抗抗抗HBcHBc 11.5 10.8 11.5 10.8 19.319.3
20、抗抗抗抗HBsHBs 3.6 0 9.7 0 3.6 0 9.7 0 三抗体阳三抗体阳三抗体阳三抗体阳 5.0 1.1 10.05.0 1.1 10.0 全阴全阴全阴全阴 0 4.00 4.0调查总例数调查总例数调查总例数调查总例数 1474 2828 814 838 7731474 2828 814 838 773HBV DNAHBV DNA阳性率阳性率阳性率阳性率HBV DNA检测的临床意义调调查查表表明明并并不不是是所所有有“大大三三阳阳”的的病病人人都都处处于于HBV复复制制期期，具具有有传传染染性性；也也不不是是所所有有“小小三三阳阳”的的病病人人HBV都都无无复复制制。因因此此，要
21、要准准确确知知道道HBV是是否否处处于于复复制制状状态态，最最准准确确的的方方法法还还是是通通过过检测检测HBVDNA来决定。来决定。HBV-DNA定量检测的临床应用定量检测的临床应用慢性乙肝诊断治疗监测和疗效评价跟踪随访预后判断HBV-DNA定量定量 慢性乙肝的诊断慢性乙肝的诊断HBsAg阳性六个月以上ALT持续升高或反复升高HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）HBV-DNA定量定量 慢性乙肝的治疗监测慢性乙肝的治疗监测治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA）治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，
22、对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效HBV-DNA定量定量 治疗后的随访治疗后的随访无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每36个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。HBV拉米夫定耐药拉米夫定耐药虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个
23、月之内出现HBV-DNA和ALT反弹YMDD变异变异YMDD 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸。如发生YMDD变异，则其中的蛋氨酸（M）突变为异亮氨酸（isoleucine，I）或缬氨酸（valine，V）形成YIDD变异株或YVDD变异株 。YMDD位于HBV多聚酶的关键功能区。YMDD变异检测变异检测采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案HBV 拉米夫定耐药突变检测原理Primer FPrimer FPrimer F
24、ProbeProbeProbePrimer HBVPrimer YIDDPrimer YVDDHBV检测检测I突变检测突变检测V突变检测突变检测什么时候开始检测什么时候开始检测YMDD变异变异拉米夫定治疗过程中拉米夫定治疗过程中拉米夫定治疗过程中拉米夫定治疗过程中YMDDYMDDYMDDYMDD变异情况变异情况变异情况变异情况 治疗时间治疗时间 HBV DNAHBV DNA大于大于10104 4copies/mlcopies/ml例数例数 YMDDYMDD变异例数变异例数* * 6 6 6 6个月个月个月个月 6 6 6 61 1 1 1（17%17%17%17%）612612612612个月
25、个月个月个月2626262614141414（54%54%54%54%）1224122412241224个月个月个月个月3838383826262626（68%68%68%68%）2436243624362436个月个月个月个月3838383838383838（100%100%100%100%） * * * * 各组之间两两比较均有显著差异（各组之间两两比较均有显著差异（各组之间两两比较均有显著差异（各组之间两两比较均有显著差异（P0.05P0.05P0.05P0.05）。）。）。）。YMDD变异株的动态变化变异株的动态变化YMDD变异株的动态变化变异株的动态变化YMDD检测应用方法检测应用方
26、法对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异）治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次慢性乙肝的基因分型慢性乙肝的基因分型乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为AH八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比基因型C对干扰素治疗更敏感共价闭合环状DNA (cccDNA)检测HBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才能算
27、真正有效HBV cccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标HBV基基 因因 及及 编编 码码 蛋蛋 白白阿德福韦治疗乙型肝炎阿德福韦阿德福韦阿德福韦阿德福韦为为为为5-5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明可明可明可明显抑制显抑制显抑制显抑制HBVDNAHBVDNA复制复制复制复制 HBeAgHBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，阳性慢性乙型肝炎患者，阳性慢性乙型肝炎患者，阳性慢性乙型肝炎患者，1 1、2 2、3 3年时的年时的年时的年时的耐药发生率分别为耐药发生率分别为耐药发生率分别为耐药发生率分别为0%0%、1.6%1.6
28、%、3.1%3.1%HBeAgHBeAg阴性者阴性者阴性者阴性者1 1、2 2、3 3年的耐药发生率分别为年的耐药发生率分别为年的耐药发生率分别为年的耐药发生率分别为0%0%、3.0%3.0%、5.9%11%5.9%11%1896突变的诊疗意义G1896AG1896A点突变，形成终止密码子点突变，形成终止密码子点突变，形成终止密码子点突变，形成终止密码子 (TAG)(TAG)，不表不表不表不表达达达达HBeAgHBeAg；由于由于由于由于e e抗原不能合成，血清中检测不到抗原不能合成，血清中检测不到抗原不能合成，血清中检测不到抗原不能合成，血清中检测不到HBeAgHBeAg，但乙肝病毒仍处于复
29、制状态；但乙肝病毒仍处于复制状态；但乙肝病毒仍处于复制状态；但乙肝病毒仍处于复制状态；此类此类此类此类HBeAgHBeAg阴性乙肝患者更容易发生严重的肝阴性乙肝患者更容易发生严重的肝阴性乙肝患者更容易发生严重的肝阴性乙肝患者更容易发生严重的肝脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。基因检测在乙肝诊疗各阶段的应用药物治疗方案的确定药物治疗方案的确定（用药：干扰素、拉米夫定、（用药：干扰素、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦）阿德福韦、恩替卡韦）药物治疗药物治疗（疗效评价）（疗效评价）前前C C区区18961896位点突变检测位点突变检测跟踪随访跟踪随访乙乙 肝肝 病病 毒毒 定定 量检测量检测确确诊诊病毒学病毒学分析分析乙肝病毒分型检测乙肝病毒分型检测拉米夫定耐药检测拉米夫定耐药检测阿德福韦耐药检测阿德福韦耐药检测共价闭合环状共价闭合环状DNA(cccDNA)检测检测恩替卡韦耐药检测恩替卡韦耐药检测谢谢
