《从特定的细胞中分离与核糖体结合的mRNA》由会员分享，可在线阅读，更多相关《从特定的细胞中分离与核糖体结合的mRNA（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、从特定的细胞中分离从特定的细胞中分离与核糖体结合的与核糖体结合的mRNAmRNA核酸的分离与纯化技术是生物化学和分子生核酸的分离与纯化技术是生物化学和分子生物学中的一项基本技术。其中，物学中的一项基本技术。其中，RNA，尤其，尤其是是mRNA的制备与分析，在了解基因表达方的制备与分析，在了解基因表达方面是分子生物学的研究的关键步骤。面是分子生物学的研究的关键步骤。大部分真核大部分真核mRNA分子的分子的3端存在一个端存在一个2030个多聚腺苷酸残基个多聚腺苷酸残基poly（A），可以用磁），可以用磁珠法或者寡聚（珠法或者寡聚（dT）的纤维素亲和而纯化。）的纤维素亲和而纯化。孔子说：温故而知新孔
2、子说：温故而知新-mRNA-mRNA分子的分离分子的分离亲和素亲和素磁珠磁珠mRNA的的polyAOligoT生物素生物素磁珠法磁珠法寡聚寡聚dT纤维素柱层析法纤维素柱层析法总总RNA寡寡聚聚dT纤纤维维素素柱柱高盐缓冲液高盐缓冲液寡寡聚聚dT纤纤维维素素柱柱带带polyA尾尾的的mRNA带带polyA尾尾的的mRNA降低盐浓度降低盐浓度目目录录1摘要简介23实验材料和方法实验过程及结果45讨论一一 摘要摘要基因表达谱技术可以分析来自器官，基因表达谱技术可以分析来自器官，组织和细胞的转录产物。然而，由于组织和细胞的转录产物。然而，由于器官和组织是由各种类型的细胞组成，器官和组织是由各种类型的细
3、胞组成，且有各自的基因表达模式，因此这些且有各自的基因表达模式，因此这些方法受到了限制。方法受到了限制。为了鉴定复杂组织中某一细胞类型的为了鉴定复杂组织中某一细胞类型的转录组，研究人员用物理方法，原位转录组，研究人员用物理方法，原位杂交或者免疫组织化学的方法分离不杂交或者免疫组织化学的方法分离不同类型的细胞，但都有一定的局限性。同类型的细胞，但都有一定的局限性。 本文我们描述一种快速有效地分离体内任何细胞类型中与本文我们描述一种快速有效地分离体内任何细胞类型中与核糖体结合的核糖体结合的mRNA转录组的方法。转录组的方法。我们建立了一个小鼠系我们建立了一个小鼠系-RiboTag（Tag Ribo
4、somes） ，带有一个带有一个Rpl22等位基因，该基因等位基因，该基因C端的一个野生型外显子端的一个野生型外显子4的左右各有一个的左右各有一个Lox P位点，其后还有一个带有位点，其后还有一个带有3个血凝个血凝素（素（HA）抗原决定簇拷贝的外显子）抗原决定簇拷贝的外显子4。当当RiboTag小鼠小鼠与与Cre重组酶表达小鼠重组酶表达小鼠杂交后，杂交后，Cre 重组酶重组酶能够激活用抗原决定簇标记的核糖体蛋白质能够激活用抗原决定簇标记的核糖体蛋白质Rpl22HA的表的表达，并一起翻译为多聚核糖体达，并一起翻译为多聚核糖体。在特定细胞类型中，多聚核糖体与单克隆抗在特定细胞类型中，多聚核糖体与单
5、克隆抗体（抗原为体（抗原为HA）的免疫沉淀反应就能够分）的免疫沉淀反应就能够分离与核糖体结合的离与核糖体结合的mRNA转录组。转录组。大脑内特定的神经元大脑内特定的神经元睾丸内的支持细胞睾丸内的支持细胞CreCre重组酶表达小鼠重组酶表达小鼠二二 简介简介利用转基因技术使抗原决定簇标签表达或利利用转基因技术使抗原决定簇标签表达或利用绿色荧光蛋白（用绿色荧光蛋白（GFP）等报告基因克服）等报告基因克服了在分析复杂组织中特定细胞类型的转录了在分析复杂组织中特定细胞类型的转录组中遇到的困难，因此研究者可以鉴定感组中遇到的困难，因此研究者可以鉴定感兴趣的细胞。兴趣的细胞。用人工解剖，荧光激活细胞分类术
6、用人工解剖，荧光激活细胞分类术（FACS）或者激光捕获显微切割技术）或者激光捕获显微切割技术（LCM）可以从复杂的器官中分离这些标）可以从复杂的器官中分离这些标记的细胞。记的细胞。原理原理-荧光染色或标记被检细胞悬液，使单细胞液流快速通过仪器的激荧光染色或标记被检细胞悬液，使单细胞液流快速通过仪器的激光器照射分析区，被检细胞产生的不同荧光信号转变为电脉冲，分别输入光器照射分析区，被检细胞产生的不同荧光信号转变为电脉冲，分别输入计算机内，并显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群体中不同类型细胞计算机内，并显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群体中不同类型细胞的有关数据的有关数据 。缺点缺点-各种细胞
7、类型之间的三维关系将被破坏，还将导致基因表达的改各种细胞类型之间的三维关系将被破坏，还将导致基因表达的改变。变。荧光激活细胞分类术荧光激活细胞分类术（FACS）原理原理-通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜乙烯乙酸乙烯酯乙烯乙酸乙烯酯EVA）膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。）膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。缺点缺点-为使细胞离开它原来的环境为使细胞离开它原来的环境 ，要对组织进行切片，处理，要对组织进行切片，处理，脱水等复杂的操作。脱水等复杂的操作。激光捕获显微切割技术（激光捕获显微切割技术（LCM） mRNA转录组可以通过免
8、疫沉淀反应从多聚转录组可以通过免疫沉淀反应从多聚核糖体中分离出来，然后用定量的核糖体中分离出来，然后用定量的RT-PCR或微阵列等标准基因识别技术分析。或微阵列等标准基因识别技术分析。 优优点点表达表达Cre重组酶小鼠的易获取性重组酶小鼠的易获取性 用抗原决定簇标记的核糖体蛋白质亚基的易检测性用抗原决定簇标记的核糖体蛋白质亚基的易检测性三三 实验材料和方法实验材料和方法 RiboTag小鼠小鼠 表达表达Cre 重组酶小鼠重组酶小鼠 pBluescript KS+质粒质粒 HA序列序列 各种限制性内切酶各种限制性内切酶 胚胎干细胞胚胎干细胞 HA抗体和抗体和c-myc抗体抗体Western Bl
9、ot Analysis蔗糖密度梯度分析蔗糖密度梯度分析免疫组织化学免疫组织化学多聚核糖体的免疫沉淀多聚核糖体的免疫沉淀反应反应RNA完整性的分析完整性的分析qRT-PCR分析分析Northern Blot AnalysisSouthern Blot Analysis四四 实验过程及结果实验过程及结果用于表位附加的核糖体蛋白的选择和靶载体的设计用于表位附加的核糖体蛋白的选择和靶载体的设计Rpl22HA蛋白质蛋白质在小鼠组织中的表达在小鼠组织中的表达Rpl22HA蛋白质整合到多聚核糖体蛋白质整合到多聚核糖体Rpl22HA C末端的末端的HA标签用于免疫沉淀多聚核糖体标签用于免疫沉淀多聚核糖体核糖体
10、结合的核糖体结合的mRNA与非核糖体结合的与非核糖体结合的mRNA的辨别的辨别特定细胞转录产物的富集特定细胞转录产物的富集 用于表位附加的核糖体蛋用于表位附加的核糖体蛋白质的选择和靶载体的设计白质的选择和靶载体的设计核糖体由大约核糖体由大约80个蛋白质组成。当检测用绿色荧个蛋白质组成。当检测用绿色荧光蛋白（光蛋白（GFP）标记的大型酵母和哺乳动物蛋白）标记的大型酵母和哺乳动物蛋白质的质的C末端时，在适当的细胞区室发现了末端时，在适当的细胞区室发现了4个核糖个核糖体蛋白质亚基（体蛋白质亚基（RPS17，RPS25，RPL22和和RPL36）。）。我们选择标记我们选择标记Rpl22基因，该基因是从
11、细菌人工染基因，该基因是从细菌人工染色体（色体（bacterial artificial chromosome，BAC ）中分离得来的，为）中分离得来的，为9.8kb。这个靶基因包含。这个靶基因包含2个个外显子外显子4，第一个为野生型外显子，第一个为野生型外显子4，左右两边各，左右两边各有一个有一个loxP位点，第二个外显子位点，第二个外显子4被被HA标记标记。 细菌人工染色体细菌人工染色体（BAC）用于用于 DNA片段克隆的载体系统一直是分子生物学片段克隆的载体系统一直是分子生物学中不可或缺的重要工具。中不可或缺的重要工具。质粒质粒系统容量小系统容量小(15 kb)，只适用于一般基因的克，只
12、适用于一般基因的克隆，很少用于隆，很少用于DNA文库文库(DNA library)的构建，尤的构建，尤其是真核生物的文库构建。其是真核生物的文库构建。粘粒粘粒容量虽有所增大容量虽有所增大(45 kb)，但对于一些较大的，但对于一些较大的基因簇基因簇(gene cluster)的研究仍然无能为力。的研究仍然无能为力。酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificialchromosom, YAC)系统容量很大系统容量很大(可至数可至数Mb)，已被广泛应用，已被广泛应用于于DNA文库的构建和基因簇研究，但其文库的构建和基因簇研究，但其易于发生易于发生重组，缺乏稳定性及制备工艺的繁琐重组，
13、缺乏稳定性及制备工艺的繁琐局限了它的局限了它的使用。使用。补充补充120世纪世纪90年代发展起来的年代发展起来的细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC) 是是一种以一种以F质粒（质粒（F-plasmid）为基础建构而成）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的左右大小的DNA片段，最多可保存片段，最多可保存300kb个个碱基对。碱基对。它具有它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作容量大、遗传特性稳定、易于操作等等优点。在基因文库构建和基因功能分析等优点。在基因文库构建和基因功
14、能分析等方面有广泛的应用。方面有广泛的应用。补充补充2 定位重组系统定位重组系统目前，选择标记基因被广泛应用于细胞的遗目前，选择标记基因被广泛应用于细胞的遗传转化，用于区分转化和非转化细胞，但传转化，用于区分转化和非转化细胞，但当筛选完成后，选择标记基因不再有用，当筛选完成后，选择标记基因不再有用，将之从转基因细胞中去除有以下几个优点：将之从转基因细胞中去除有以下几个优点：大大提高了转基因生物的安全性大大提高了转基因生物的安全性 为多基因转化使用同一选择标记基因提供了可能性为多基因转化使用同一选择标记基因提供了可能性降低了对转入的目的基因进行表达结果分析的复杂性降低了对转入的目的基因进行表达结
15、果分析的复杂性减少了转入的外源减少了转入的外源DNADNA的序列，提高了基因组的稳定性的序列，提高了基因组的稳定性定位重组系统是由单个多肽酶识别特定的定位重组系统是由单个多肽酶识别特定的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。序列而发生重组的遗传操作系统。每种重组系统都主要由两部分组成：重组酶每种重组系统都主要由两部分组成：重组酶和特异性识别位点。和特异性识别位点。Cre/LoxPCre/LoxP重组系统重组系统FLP/FRTFLP/FRT重组系统重组系统最常用的两种定位重组系统最常用的两种定位重组系统Cre/LoxPCre/LoxP重组系统重组系统 Cre重组酶重组酶 (cause recomb
16、ination)：由大肠杆菌噬菌：由大肠杆菌噬菌体体P1的的Cre基因编码，由基因编码，由343个氨基酸组成，它不仅个氨基酸组成，它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA序列，如：序列，如：LoxP位点，引起重组。位点，引起重组。Lox P位点位点（Locus of crossing over in P1)：是：是Cre重组酶作用的特异性重组位点，由重组酶作用的特异性重组位点，由34 bp组成。组成。ATAACTTCGTATATATTGAAGCATATTATACGAAGTTATATATGCTTCAATAATGTATGCTACATACG53
17、13 bp的反向重复顺序13 bp的反向重复顺序8bp的间隔区域Cre/LoxPCre/LoxP系统条件性敲除基因系统条件性敲除基因 在胚胎干细胞在胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)中通中通过置换型载体进行同源重组，过置换型载体进行同源重组，向靶基因位点两侧引入两向靶基因位点两侧引入两个同向排列的个同向排列的Lox P位点位点。将该。将该ES细胞打人假孕母鼠中，细胞打人假孕母鼠中，发育成发育成“floxed小鼠小鼠”。 利用原核注射的方法获得转基因利用原核注射的方法获得转基因“Cre小鼠小鼠”。此。此转基因小鼠在特定的启动子下表达转基因小鼠在特定的启动子下表达
18、Cre重组酶。重组酶。 “Cre小鼠小鼠”跟跟“floxed小鼠小鼠”交配，交配，Cre重组酶重组酶会切掉会切掉Lox P位点之间的靶基因和第位点之间的靶基因和第1个个Lox P位点位点，从，从而达到靶基因的失活或敲除。而达到靶基因的失活或敲除。FLP/FRTFLP/FRT重组系统重组系统来自于啤酒酵母细胞核内来自于啤酒酵母细胞核内2 2m m质粒的质粒的FLP/FRT FLP/FRT 重组系统同样由两部分组成：重组系统同样由两部分组成： 重组酶重组酶FLPFLP FRT FRT位点位点重组酶重组酶FLPFLP可催化同一分子上两个同向可催化同一分子上两个同向FRTFRT位位点间点间DNADNA
19、片段的切除。片段的切除。补充补充3 表位附加标记表位附加标记表位表位(epitope)：即指抗原决定部位或指抗原决定：即指抗原决定部位或指抗原决定基；基；表位附加标记表位附加标记(epitope tag)：将附加的抗原表位：将附加的抗原表位融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白及利用免疫可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白及利用免疫荧光技术对标记蛋白进行亚细胞定位。荧光技术对标记蛋白进行亚细胞定位。HA标记标记一般由一般由9个氨基酸个氨基酸组成，它来源于流感病毒组成，它来源于流感病毒的血凝素的血凝素(hemaggluti
20、nin, HA)。c-myc标记标记由十多个氨基由十多个氨基酸组成的，它来自人类酸组成的，它来自人类c-myc原癌基因。原癌基因。靶载体的构建靶载体的构建BAC9.8kb EcoRI/BamHI 片段（包含片段（包含Rpl22基因基因的外显子的外显子3和和4）pBluescript KS+质粒质粒XbaI/XhoIpBluescript KS+质粒质粒在在 XbaI/XhoI片段的片段的3端产生一端产生一个个BamHI位点位点pBluescript KS+质粒质粒AatIIKlenow 酶补平酶补平亚克隆亚克隆克隆克隆PCR再亚克隆再亚克隆BamHI限制性酶切位点限制性酶切位点1.7kb Sa
21、l I/Cla I片段片段3HA序列序列BamHI限制性酶切位点限制性酶切位点BamHI限制性酶切位点限制性酶切位点BamHI限制性酶切位点限制性酶切位点HindIII/ApaI片段片段 LoxPNeoLoxPKlenow 酶酶LoxPNeoLoxP外显子外显子4 Cre 重组酶重组酶补平补平LoxPNeoLoxP外显子外显子4产生产生第一个第一个pBluescript KS+质粒质粒NotI/ApaI双酶切分离出双酶切分离出Klenow 酶补平酶补平第二个第二个pBluescript KS+质粒质粒Xho I酶切酶切BsmBI，NotI限制酶和限制酶和 Klenow 酶酶图图1A Rpl22
22、基因的标记过程基因的标记过程RiboTag mouse line补充补充4 胚胎干细胞介导基因的导入胚胎干细胞介导基因的导入利用电穿孔等基因转移技术将外源基因导入胚胎利用电穿孔等基因转移技术将外源基因导入胚胎干细胞内，再将此胚胎干细胞嵌入宿主囊胚的内干细胞内，再将此胚胎干细胞嵌入宿主囊胚的内细胞团中参与胚胎发育，将来出生的动物可能整细胞团中参与胚胎发育，将来出生的动物可能整合上外源基因，通过杂交繁育可得到具有合上外源基因，通过杂交繁育可得到具有纯合纯合目目的基因的转基因动物。的基因的转基因动物。优点是基因整合率高（优点是基因整合率高（50%左右），可选择特殊左右），可选择特殊位置诱导突变，为基
23、因修补提供最大的可能性；位置诱导突变，为基因修补提供最大的可能性；缺点主要在于建立缺点主要在于建立ES细胞株比较困难。细胞株比较困难。 图一图一B 用用 Southern blot辨别导入靶基因的辨别导入靶基因的ES细胞，野生型细胞，野生型HindIII/Sfil DNA片段片段是是9908bp，正确的靶，正确的靶HindIII/Sfil DNA片段片段是是8749bp。图一图一C PCR扩增扩增的产物。野生型的的产物。野生型的PCR产产物（不含物（不含LoxP位点）是位点）是260bp，突变的，突变的PCR产物产物（含（含LoxP位点）是位点）是290bp。 出错啦！出错啦！野生型野生型杂合
24、子杂合子野生型野生型HindIII/Sfil DNA片段片段正确的靶正确的靶HindIII/Sfil DNA片段片段Rpl22HA蛋白质在小鼠组织中的表达蛋白质在小鼠组织中的表达为检测为检测Rpl22HA等位基因的功能，我们首先等位基因的功能，我们首先将将RiboTag小鼠与间质同源小鼠与间质同源2（Meox2）表）表达达Cre重组酶小鼠杂交，激活各组织中的重组酶小鼠杂交，激活各组织中的Rpl22HA等位基因。等位基因。Meox2+/+ : Rpl22 HA/+ mouseMeox2 Cre/+ : Rpl22 HA/+ mouseMeox2 Cre/Cre : Rpl22 HA/HA mou
25、seMeox2 Meox2 表达表达CreCre重组酶小鼠重组酶小鼠RiboTagRiboTag小鼠小鼠图图1D 用野生型用野生型RPL22蛋白质或蛋白质或HA的抗体，检测野生型的抗体，检测野生型RPL22蛋白质和蛋白质和RPL22HA蛋白质的表蛋白质的表达，其分子量分别为达，其分子量分别为15kDa和和23kDa。靶载体与无靶载体与无Cre重组重组酶的小鼠杂交只产生酶的小鼠杂交只产生野生型野生型Rpl22蛋白，蛋白，与有与有Cre重组酶的小重组酶的小鼠杂交只产生鼠杂交只产生Rpl22HA 蛋白。蛋白。Meox2+/+ : Rpl22 HA/+ mouseMeox2 Cre/+ : Rpl22
26、 HA/+ mouseMeox2 Cre/Cre : Rpl22 HA/HA mouse 图图1E 通过对表达通过对表达Rpl22HA的纯合子小鼠的纯合子小鼠Western blotting分析说明分析说明Rpl22HA蛋白质在所有组织中稳定表蛋白质在所有组织中稳定表达。通过另一个大的核糖体蛋白质亚基达。通过另一个大的核糖体蛋白质亚基RPL7的的Western blotting分析得之，分析得之，Rpl22HA蛋白质在各组织蛋白质在各组织中表达量的差异与每个组织中核糖体的量的不同有关。中表达量的差异与每个组织中核糖体的量的不同有关。H心脏心脏 S脾脏脾脏 Li肝脏肝脏 O卵巢卵巢 Sk骨骼肌骨
27、骼肌 Pa胰腺胰腺 Lu肺肺 K肾脏肾脏 B大脑大脑Rpl22HA蛋白质蛋白质整合整合到多聚核糖体到多聚核糖体证明了证明了Rpl22HA蛋白质的稳定表达后，还得蛋白质的稳定表达后，还得证明证明Rpl22HA蛋白质整合到了核糖体中。蛋白质整合到了核糖体中。对表达对表达Rpl22HA蛋白质的纯合子小鼠的大脑蛋白质的纯合子小鼠的大脑匀浆进行蔗糖密度梯度分析，然后再进行匀浆进行蔗糖密度梯度分析，然后再进行Western blotting分析。分析。u图图1F 蔗糖密度梯度为蔗糖密度梯度为15%-50%，测核糖体总蛋白在，测核糖体总蛋白在254nm处处的吸光度，的吸光度，Western blot测定测定
28、Rpl22HA蛋白。蛋白。uRpl22HA蛋白质主要存在于多聚核糖体片断中，在第蛋白质主要存在于多聚核糖体片断中，在第1个梯度个梯度（细胞质）中几乎不存在。当加入（细胞质）中几乎不存在。当加入EDTA后，导致核糖体总蛋后，导致核糖体总蛋白和白和Rpl22HA蛋白质变成更轻的片段，都主要沉降到第蛋白质变成更轻的片段，都主要沉降到第2，3，4个梯度，说明个梯度，说明Rpl22HA蛋白质确实是核糖体的一部分。蛋白质确实是核糖体的一部分。广征意见广征意见 Rpl22HA 的的HA标签用于标签用于免疫沉淀多聚核糖体免疫沉淀多聚核糖体当当RiboTag小鼠与小鼠与Cre 重组酶小鼠杂交后，导致野重组酶小鼠
29、杂交后，导致野生型外显子生型外显子4的消失，取而代之的是的消失，取而代之的是HA标记的外标记的外显子显子4。表达表达HA标记的核标记的核糖体糖体匀浆匀浆结合结合HA的抗体的抗体的磁珠的磁珠4条件下过夜培养条件下过夜培养高盐缓冲液冲洗被磁珠免疫吸附的核糖体高盐缓冲液冲洗被磁珠免疫吸附的核糖体匀质匀质加入到加入到RNARNA被提取出来被提取出来补充补充5 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是基于预分离物质（本文是免疫磁珠分离法是基于预分离物质（本文是核糖体）表面的抗原能与连接有磁珠的特核糖体）表面的抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗异性单抗相结合，在外加磁场中，通过
30、抗体与磁珠相连的物质被吸附而滞留在磁场体与磁珠相连的物质被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的物质由于不能与连中，无该种表面抗原的物质由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使物质得以分离。不在磁场中停留，从而使物质得以分离。 图图2 RiboTag的作用的作用-用来分离与核糖用来分离与核糖体结合的体结合的mRNA图图3A 用用2100 生物分析仪检测从表达生物分析仪检测从表达Rpl22HA蛋白质的小蛋白质的小鼠大脑匀浆或睾丸匀浆中提取的核糖体鼠大脑匀浆或睾丸匀浆中提取的核糖体RNA样品完整性。样品完整性。加入一定量的核糖体加入一
31、定量的核糖体RNA，用，用HA的抗体检测到完整的的抗体检测到完整的18S和和28S核糖体核糖体RNA，而用，而用myc抗体则检测不到抗体则检测不到18S和和28S核核糖体糖体RNA 。图图3B为为RNA的完整性数量（的完整性数量（RIN），反映样），反映样品中品中rRNA的质量，的质量，8.09.2，说明从免疫共，说明从免疫共沉淀中获得的沉淀中获得的RNA的质量很好。的质量很好。Input BrainIP:HA BrainInput TestisIP:HA TestisRIN8.7 0.48.2 0.49.0 0.18.8 0.3 补充补充6 RNA的完整性的检测的完整性的检测对对RNA的完整
32、性进行评估，这是保证实验成功和的完整性进行评估，这是保证实验成功和优异重现性的最重要保障。使用优异重现性的最重要保障。使用2100 生物分析仪，生物分析仪，用用RIN值（值（RNA Integrity Number/ RNA完整性）完整性）来客观的定义来客观的定义RNA样本的完整度。样本的完整度。2100 生物分析仪生物分析仪，是一款基于微流毛细管电泳系，是一款基于微流毛细管电泳系统为基础，对蛋白质，统为基础，对蛋白质，DNA或或RNA进行多功能分进行多功能分析的技术平台。析的技术平台。每当每当2100生物分析仪完成一个生物分析仪完成一个RNA样品分析后，样品分析后，软件会自动给出一个软件会自
33、动给出一个从从1到到10之间的完整性的数值。之间的完整性的数值。数值越大，完整性越好数值越大，完整性越好。RIN值已成为行业内不可缺少的重要参数值已成为行业内不可缺少的重要参数。 图图3C 用用HA的抗体的抗体或或myc抗体磁珠免疫抗体磁珠免疫共沉淀的蛋白质的共沉淀的蛋白质的Western blot分析说分析说明只在明只在HA-IP中检测中检测到到RPL22HA，另一个，另一个核糖体蛋白质核糖体蛋白质（RPL7）被少量也）被少量也被免疫共沉淀。被免疫共沉淀。在多巴胺和在多巴胺和cAMP调控调控磷蛋白（磷蛋白（DARPP-32）的控制下的控制下多巴胺转运多巴胺转运（DAT）启动子）启动子荷尔蒙抗
34、体荷尔蒙抗体（Amh）启动子）启动子RiboTag小鼠小鼠Cre 重组酶小鼠重组酶小鼠 我们观察到在我们观察到在DAT多巴胺神经元，多巴胺神经元，DARPP32纹状体纹状体的中型多棘神经元和的中型多棘神经元和AMH支持细胞中的支持细胞中的RPL22HA蛋白质蛋白质得到了大量表达。得到了大量表达。特定细胞转录组的富集特定细胞转录组的富集44 图图4A RPL22HA蛋白质在各种细胞中大量表达。蛋白质在各种细胞中大量表达。 HA的抗体呈绿色，酪氨酸氢化酶（的抗体呈绿色，酪氨酸氢化酶（TH）的抗体呈红）的抗体呈红 色，色，TO-PRO-3试剂盒呈蓝色。试剂盒呈蓝色。DAT多多巴胺神巴胺神经元经元DA
35、RPP32纹状体纹状体的中型多的中型多棘神经元棘神经元AMH支支持细胞持细胞多巴胺转多巴胺转运启动子运启动子在多巴胺和在多巴胺和cAMPcAMP调控磷蛋调控磷蛋白（白（DARPP-DARPP-3232）的控制下）的控制下荷尔蒙抗荷尔蒙抗体（体（AmhAmh）启动子启动子 图图4B 加入等量的蛋白加入等量的蛋白质，质， 免疫沉淀检测到免疫沉淀检测到的的RPL22HA蛋白质的蛋白质的量依次增多。说明量依次增多。说明RPL22HA蛋白质表达蛋白质表达量取决于细胞类型。量取决于细胞类型。图图4C RPL22HA蛋白质蛋白质免疫沉淀的效率。虽然免疫沉淀的效率。虽然在三种情况下在三种情况下RPL22HA
36、蛋白质表达水平不一样，蛋白质表达水平不一样，但免疫共沉淀的效率没但免疫共沉淀的效率没有很大的变化。有很大的变化。I-inputP-pelletS-supernatantDAT-Cre:RiboTag mice -中脑的中脑的多巴胺神经元中的转录产物（包括多巴胺神经元中的转录产物（包括Th和和Slc6a3）富集倍数为）富集倍数为10-15倍，倍，信噪比低，信噪比低， Cnp不富集；不富集；DARPP32-Cre:RiboTag mice -纹纹状体的中型多棘神经元中的转录产状体的中型多棘神经元中的转录产物（包括物（包括Ppp1r1b，Pdyn和和Penk1）富集倍数为富集倍数为5-6倍，倍，Cn
37、p不在中型多不在中型多棘神经元中表达，所以不富集；棘神经元中表达，所以不富集；AMH-Cre:RiboTag mice -睾丸支睾丸支持细胞中的转录产物持细胞中的转录产物(包括包括Fshr，Trf和和Inhbb)富集倍数为富集倍数为5倍，支持倍，支持细胞中不表达细胞中不表达Prm2，所以不富集。，所以不富集。图图4D 4D 用用qRTqRT- PCR- PCR分析转录产物，与输入分析转录产物，与输入RNARNA相比，特定细胞免疫共沉淀相比，特定细胞免疫共沉淀mRNAmRNA的富集。的富集。信噪信噪比低比低不表达不表达不表达不表达 核糖体结合的核糖体结合的mRNA与非与非核糖体结合的核糖体结合的
38、mRNA的辨别的辨别检测检测RiboTag 方法能否辨别翻译被抑制的和有翻方法能否辨别翻译被抑制的和有翻译活性的译活性的mRNA转录组，在精子形成的过程中，转录组，在精子形成的过程中，精子精子DNA蛋白质的表达就是一个很好的例子。蛋白质的表达就是一个很好的例子。鱼精蛋白的翻译远落后于相应鱼精蛋白的翻译远落后于相应mRNA的转录，鱼的转录，鱼精蛋白精蛋白1（Prm1）mRNA转录后，结合转录后，结合Y-box抑制抑制蛋白，使其以胞浆核蛋白颗粒蛋白，使其以胞浆核蛋白颗粒(cytoplasmic ribonucleoprotein，mRNP)的形式先贮存起来，的形式先贮存起来，直到直到poly(A)
39、尾被尾被脱腺苷化脱腺苷化变短，才在晚期精子细变短，才在晚期精子细胞阶段翻译活化。胞阶段翻译活化。在精子形成的第一阶段，检测总在精子形成的第一阶段，检测总Prm1 mRNA和与核糖体结合的和与核糖体结合的Prm1 mRNA 的量。的量。表达表达RPL22HA的纯合子小鼠的睾丸在出生的纯合子小鼠的睾丸在出生25，28，32天后分离，均质化，用连接有天后分离，均质化，用连接有HA抗体的磁珠免疫沉淀多聚核糖体，获得抗体的磁珠免疫沉淀多聚核糖体，获得不同时间段的核糖体转录组。不同时间段的核糖体转录组。图图5B 在第在第25天与核糖体相关的天与核糖体相关的Prm1 mRNA 转录组只占总转录组只占总Prm
40、1 mRNA的的9%，第，第28天只占天只占18.8%,第第32天增加到天增加到30%。图图5A qRT-PCR分析小鼠总分析小鼠总Prm1 mRNA，总，总Actb mRNA和与核糖体结合的和与核糖体结合的mRNA。说明与核糖体相关的。说明与核糖体相关的Prm1 mRNA在第在第25天开始增加，天开始增加，28天接近最天接近最大值。相反，与核糖体相关的大值。相反，与核糖体相关的Actb mRNA 则没有太大的变化。则没有太大的变化。 图图5D Northern blot分析显示分析显示580nt（无翻译活性无翻译活性） Prm1转录组主要存在于非核糖体转录组主要存在于非核糖体中，而中，而45
41、0nt（脱腺苷化脱腺苷化 ，有翻译活性有翻译活性）Prm1转录组主转录组主要存在于核糖体中。说明有要存在于核糖体中。说明有翻译活性的转录组存在于核翻译活性的转录组存在于核糖体中，即糖体中，即RiboTag 方法能方法能区别翻译被抑制的和有翻译区别翻译被抑制的和有翻译活性的活性的mRNA转录组。转录组。 图图5C 考马斯亮蓝染色显考马斯亮蓝染色显示三个时间段示三个时间段PRM1蛋白蛋白质含量。出生后第质含量。出生后第25天没天没有，第有，第28天开始增加。天开始增加。五五 讨论讨论优点优点v修饰了内源修饰了内源Rpl22 gene，因此核糖体蛋白质更易检，因此核糖体蛋白质更易检测，与细胞内的核糖
42、体的量成比例。测，与细胞内的核糖体的量成比例。vRiboTag 方法利用各种方法利用各种Cre 表达重组酶小鼠系，包表达重组酶小鼠系，包括三种细胞类型，使实验更科学，结果更准确。括三种细胞类型，使实验更科学，结果更准确。v不用担忧不用担忧BAC 基因随机插入到小鼠基因中去。基因随机插入到小鼠基因中去。v在表达在表达Rpl22HA的纯合子小鼠中没有发现任何缺陷，的纯合子小鼠中没有发现任何缺陷，推断标记推断标记Rpl22 蛋白质不影响它在体内的功能。蛋白质不影响它在体内的功能。最近，设计出一种敲除最近，设计出一种敲除Rpl22 基因的小鼠，基因的小鼠，是能活的，多产的。这些小鼠的生存能力是能活的，
43、多产的。这些小鼠的生存能力取决于一种同系物取决于一种同系物- Rpl22-Like 1，在各在各组织均表达。组织均表达。一些细胞的一些细胞的Rpl22-Like 1的表达水平可能高的表达水平可能高于于Rpl22，这影响我们广泛利用，这影响我们广泛利用RiboTag技技术的能力，但是由于不存在术的能力，但是由于不存在Rpl22-Like 1的的抗体，我们不能通过实验对比标记抗体，我们不能通过实验对比标记Rpl22-Like 1和和Rpl22的效率。的效率。实验的不足与发展方向实验的不足与发展方向L本实验发现特定细胞类型的本实验发现特定细胞类型的mRNA已大量富已大量富集，但仍然存在一些未被集，但仍然存在一些未被HA标记的核糖体标记的核糖体被磁珠吸附。被磁珠吸附。不过，我们的方法在未来可以向减少非特异不过，我们的方法在未来可以向减少非特异核糖体免疫沉淀方向发展。核糖体免疫沉淀方向发展。一个提高信噪比的简单方法是解剖适当的大一个提高信噪比的简单方法是解剖适当的大脑区域以增加被标记的核糖体的细胞的比脑区域以增加被标记的核糖体的细胞的比例。例。谢谢大家！谢谢大家！十分感谢孟老师耐心十分感谢孟老师耐心 细致的指导！细致的指导！
